在子宫内 电穿孔技术可实现发育中中枢神经系统（CNS）基因递送的空间和时间精确控制。本文介绍一种高度可调的胚胎内电穿孔实验方案，可用于将表达载体递送至多个胚胎期CNS区域，包括端脑、间脑和视网膜。
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摘要
摘要
操控基因表达的能力是现代实验胚胎学的基石，已促成多条发育通路的阐明。目前已有多种强大且成熟的技术可用于小鼠中基因表达水平的调控，从而构建基因功能缺失和功能获得的模型。然而，小鼠转基因模型的构建既昂贵又耗时。因此，人们广泛寻求其他替代性的基因操控方法。在体电穿孔是一种将基因导入活体小鼠胚胎的方法1,2，我们已成功对此进行了优化应用3,4。该方法主要借鉴了常用于鸡胚的在卵电穿孔技术的成功经验5。简而言之，将DNA注入发育中脑室的开放脑室腔内，通过施加电流在细胞膜上形成瞬时孔道，从而使DNA进入细胞。在我们的操作条件下，胚胎最早可在胚胎发育第11.5天（E11.5）高效地进行电穿孔；而对于更早期胚胎的靶向操作，则需要采用超声引导下的显微注射方案，如先前所述6。相反，由于顶骨和额骨开始分化，阻碍了对脑部的显微注射，因此E15.5是我们能够较容易实施电穿孔的最晚阶段。相比之下，视网膜在整个胚胎发育末期仍可接近并操作。胚胎可在胚胎期或出生后早期的任意时间点收集。注射报告基因载体有助于识别转染的细胞。
迄今为止，子宫内电穿孔技术已最广泛地用于新皮质发育的研究1,2,3,4近期的研究已将目标聚焦于胚胎视网膜7,8,9 和丘脑10,11,12. 这里我们介绍一种改良的 在子宫内 一种可轻松调整以靶向胚胎中枢神经系统不同区域的电穿孔方案。我们提供的证据表明，利用该技术可靶向胚胎端脑、间脑和视网膜。文中展示了代表性结果：首先显示了该技术用于将DNA表达载体导入侧脑室，使我们能够监测胚胎端脑中神经前体细胞的成熟、分化和迁移过程；我们还展示了该技术可用于将DNA靶向至围绕第三脑室的间脑区域rd 脑室，从而能够监测分化中的神经元向间脑核团迁移的路径。最后，我们展示了利用显微操作仪可将DNA构建体精确导入较小的靶区域，包括视网膜下腔，从而能够分析调控基因表达对视网膜发育的影响。
方案
1. 设置
- 按照图1A、A'所示设置手术区域。关键组件包括Eppendorf Femtojet显微注射仪、Narishige带持针器的显微操作器、Leica体视显微镜、光纤照明系统、ECM 830方波电穿孔系统及电极、加热垫以及异氟烷麻醉剂挥发器。
- 使用Metriclean2低泡沫溶液在Bransonic超声波清洗器中清洗所有手术器械，并通过高压灭菌法对器械进行灭菌。灭菌后的器械保存于Germex中。
- 准备含有温热无菌生理盐水和无菌乳酸林格液的注射器。
2. 麻醉
- 将动物放入一个小型（12 cm × 20 cm）麻醉室中。使用蒸发器以1 L/min的流速输送5%异氟烷麻醉剂和氧气（图1A，A'）。值得注意的是，必须使用废气清除系统收集异氟烷废气。
- 当动物呼吸变得深而规律时，将其从麻醉室中取出。通过脚趾夹捏和眨眼反射测试确认是否达到完全麻醉状态。
- 将怀孕小鼠仰卧于加热垫（37°C）上。先用70%乙醇擦拭加热垫进行消毒，然后覆盖一层无菌无绒纱布垫。手术期间使用呼吸管和面罩装置输送异氟烷（2.25%）。
- 在颈背部皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg体重）。
- 整个手术过程中持续监测动物的呼吸，应保持深而规律。动物不应出现喘息、浅呼吸或快速呼吸。浅而快的呼吸可能提示麻醉过浅，应增加异氟烷流量；若动物开始....
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讨论
在子宫内 电穿孔可用于分析多种发育过程。例如，转染报告基因（如GFP、mCherry或碱性磷酸酶）可用于谱系示踪和神经元迁移实验。 Alternatively，可瞬时表达Cre重组酶，以在空间和/或时间上可控的方式选择性消除floxed等位基因。此外，可通过电穿孔导入shRNA或显性负性构建体以敲低目标基因功能。最后，可在野生型和/或遗传突变小鼠品系中靶向过表达或异位表达关键基因，以研究细胞命运决定。该检测方法的高通量特性至关重要，因其可在极短时间内测试多种因子组合。需注意的是，该操作会导致针头穿刺部位周围细胞的基因表达发生变化（即损伤反应基因在伤口处上调；此现象已被我们及其他研究者观察到）。13因此，建议重点关注伤口部位以外的电穿孔细胞。此外，初学该技术时胚胎存活率较低，但随着操作熟练度提高，存活率会迅速上升 >通过练习，成功率可达95%。迄今为止，我们已成功运用子宫内电穿孔技术鉴定了端脑中受神经前体bHLH转录因子调控的基因4我们还验证了该技术用于端脑顺式调控元件分析的可行性。3.
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢 Eva Hadzimova、Pierre Mattar 和 Christopher Kovach 在 CS 实验室初步建立子宫内电穿孔技术过程中所做的工作。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）基金（MOP 44094）和 CIHR/防盲基金会（FFB）新兴团队基金（00933-000）资助 CS，DMK 获阿尔伯塔儿童医院研究基金会基金资助。RD 获加拿大卫生研究院加拿大希望奖学金支持，RC 获防盲基金会研究生奖学金支持，LML 获加拿大卫生研究院儿童遗传学与发育研究培训基金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 精细剪刀 | 手术器械 | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| 虹膜剪，弯型 | 手术器械 | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Olsen-Hegar 超细针持 | 手术器械 | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| 环形镊，9毫米 | 手术器械 | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| 眼科敷料镊 | 手术器械 | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Dumont #7 DMX 镊子 | 手术工具 | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont #5 DMX 镊子 | 手术器械 | 精细科学工具 | 11251-30 | |
| 组织镊-阿德森 | 手术器械 | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| 反射式夹钳施加器 | 手术器械 | World Precision Instruments, Inc. | 500343 | |
| 直径15 mm穿孔勺 | 手术工具 | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| 自动夹移除器 | 手术工具 | Mikron | 427637 | |
| 丝线黑色编织缝合线 | 手术工具 | Ethicon Inc. | K871 | |
| 反射式皮肤闭合不锈钢伤口钉 | 手术工具 | World Precision Instruments, Inc. | 500346 | |
| ECM 830 方波电穿孔系统 | 仪器 | VWR 国际公司 | 58018-004 | |
| 带可变间隙的镊子，2个圆形5毫米铂电极板 | 仪器 | Protech International, Inc. | CUY650P5 | |
| 带可变间隙的镊子式电极 2个圆形7毫米铂电极板 | 仪器 | Protech International, Inc. | CUY650P7 | |
| Eppendorf Femtojet 显微注射仪 | 仪器 | VWR 国际 | CA62111-488 | |
| Eppendorf Femtojet 显微注射仪的脚踏控制 | 仪器 | VWR国际 | CAACCESS（其他） | |
| Bransonic 超声波清洗机型号 1510R-DTH | 仪器 | VWR 国际公司 | CA33995-534CPN-952-118 | |
| Sutter P97 微电极拉制仪 | 仪器 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| 微量移液器 -– 外径：1 mm、内径：0.78 mm、长度 10 cm 的带丝硼硅酸盐玻璃管 | 仪器 | Sutter Instrument Co. | BF100-78-10 | |
| 三轴粗调操纵器 | 仪器 | 卡尔·蔡司股份公司 | M-152 | |
| 用于显微操作仪的磁力固定装置 | 仪器 | World Precision Instruments, Inc. | M1 | |
| 显微操作仪用钢制底板 | 仪器 | World Precision Instruments, Inc. | 5052 | |
| 微量移液器架 | 仪器 | World Precision Instruments, Inc. | MPH3 | |
| 微量移液器手柄 | 仪器 | World Precision Instruments, Inc. | 5444 | |
| 体视显微镜 | 仪器 | 徕卡显微系统 | MZ6 | |
| 异氟烷麻醉剂蒸发器 | 仪器 | 波特仪器公司 | MODEL 100-F | |
| Metriclean2 低泡沫超声清洗液，用于外科手术器械的超声清洗 | 手术试剂 | Metrex Research Corporation | 10-8100 | |
| 缝合后使用含0.2 g亚甲蓝的庆大霉素40 mg/ml抗生素喷雾 | 外科手术试剂 | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| 用于手术器械灭菌的Germex | 手术试剂 | Vé辅酶Q10氢醌形式 | DIN# 00141569 | |
| BNP 眼膏 | 手术试剂 | Vé辅酶Q10氢醌形式 | DIN# 00516414 | |
| Nair® | 外科手术试剂 | 教会 & Dwight Co. | 市售的 | |
| 4% w/v 斯坦己定皮肤清洁剂 | 手术试剂 | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | |
| 布托啡诺（Temgesic）镇痛剂 | 外科手术试剂 | 默克 & 公司 | 531-535 | |
| 磺胺类药物 "25" 磺胺二甲嘧啶口服抗生素 | 外科手术试剂 | 专业兽医实验室 | DIN# 00308218 | |
| 乳酸林格液 | 手术试剂 | Baxter Internationl Inc. | DIN# 0061085 | |
| 生理盐水 -– 0.9% 氯化钠 | 外科手术试剂 | B. Braun Medical | DIN# 01924303 | |
| 吸入麻醉药– Isoflurane USP | 手术试剂 | 加拿大制药合作伙伴 | DIN# 02237518 | |
| 快绿 FCF | 手术试剂 | Sigma-Aldrich | F7252 |
参考文献
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in ....
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