方法文章

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

DOI：

10.3791/2957

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2011年6月23日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hotchkiss Brain Institute, Alberta Children’s Hospital Research Institute, University of Calgary , 2Department of Medical Genetics, Alberta Children’s Hospital Research Institute, Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary

本文内容

摘要

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在子宫内 电穿孔技术可实现发育中中枢神经系统（CNS）基因递送的空间和时间精确控制。本文介绍一种高度可调的胚胎内电穿孔实验方案，可用于将表达载体递送至多个胚胎期CNS区域，包括端脑、间脑和视网膜。

摘要

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操控基因表达的能力是现代实验胚胎学的基石，已促成多条发育通路的阐明。目前已有多种强大且成熟的技术可用于小鼠中基因表达水平的调控，从而构建基因功能缺失和功能获得的模型。然而，小鼠转基因模型的构建既昂贵又耗时。因此，人们广泛寻求其他替代性的基因操控方法。在体电穿孔是一种将基因导入活体小鼠胚胎的方法1,2，我们已成功对此进行了优化应用3,4。该方法主要借鉴了常用于鸡胚的在卵电穿孔技术的成功经验5。简而言之，将DNA注入发育中脑室的开放脑室腔内，通过施加电流在细胞膜上形成瞬时孔道，从而使DNA进入细胞。在我们的操作条件下，胚胎最早可在胚胎发育第11.5天（E11.5）高效地进行电穿孔；而对于更早期胚胎的靶向操作，则需要采用超声引导下的显微注射方案，如先前所述6。相反，由于顶骨和额骨开始分化，阻碍了对脑部的显微注射，因此E15.5是我们能够较容易实施电穿孔的最晚阶段。相比之下，视网膜在整个胚胎发育末期仍可接近并操作。胚胎可在胚胎期或出生后早期的任意时间点收集。注射报告基因载体有助于识别转染的细胞。

迄今为止，子宫内电穿孔技术已最广泛地用于新皮质发育的研究1,2,3,4近期的研究已将目标聚焦于胚胎视网膜7,8,9 和丘脑10,11,12. 这里我们介绍一种改良的 在子宫内 一种可轻松调整以靶向胚胎中枢神经系统不同区域的电穿孔方案。我们提供的证据表明，利用该技术可靶向胚胎端脑、间脑和视网膜。文中展示了代表性结果：首先显示了该技术用于将DNA表达载体导入侧脑室，使我们能够监测胚胎端脑中神经前体细胞的成熟、分化和迁移过程；我们还展示了该技术可用于将DNA靶向至围绕第三脑室的间脑区域rd 脑室，从而能够监测分化中的神经元向间脑核团迁移的路径。最后，我们展示了利用显微操作仪可将DNA构建体精确导入较小的靶区域，包括视网膜下腔，从而能够分析调控基因表达对视网膜发育的影响。

方案

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1. 设置

  1. 按照图1A、A'所示设置手术区域。关键设备包括Eppendorf Femtojet显微注射仪、配有持针器的Narishige显微操作器、Leica体视显微镜、光纤照明系统、ECM 830方波电穿孔系统及电极、加热垫以及异氟烷麻醉用蒸发器。
  2. 使用Metriclean2低泡沫溶液在Bransonic超声波清洗器中清洗所有手术器械，并通过高压灭菌法对器械进行灭菌。灭菌后的器械存放于Germex消毒液中。
  3. 准备含有温热无菌生理盐水和无菌乳酸林格液的注射器。

2. 麻醉

  1. 将动物放入一个小型（12 cm × 20 cm）麻醉室中。使用蒸发器以1 L/min的流速输送5%异氟烷麻醉剂和氧气（图1A，A'）。值得注意的是，必须使用废气清除系统收集异氟烷废气。
  2. 当动物呼吸变得深而规律时，将其从麻醉室中取出。通过脚趾夹捏和眨眼反射测试确认是否达到完全麻醉状态。
  3. 将怀孕小鼠仰卧置于加热垫（37°C）上。先用70%乙醇擦拭加热垫进行消毒，然后覆盖一层无菌无绒纱布垫。手术过程中使用呼吸管和面罩装置输送异氟烷（2.25%）。
  4. 在颈背部皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg体重）。
  5. 整个手术过程中持续监测动物的呼吸情况，应保持深而规律的呼吸。动物不应出现喘息、浅呼吸或快速呼吸。浅而快的呼吸可能是麻醉过浅的表现，应....

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讨论

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在子宫内 电穿孔可用于分析多种发育过程。例如，转染报告基因（如GFP、mCherry或碱性磷酸酶）可用于谱系示踪和神经元迁移实验。 Alternatively，可瞬时表达Cre重组酶，以在空间和/或时间上可控的方式选择性消除floxed等位基因。此外，可通过电穿孔导入shRNA或显性负性构建体以敲低目标基因功能。最后，可在野生型和/或遗传突变小鼠品系中靶向过表达或异位表达关键基因，以研究细胞命运决定。该检测方法的高通量特性至关重要，因其可在极短时间内测试多种因子组合。需注意的是，该操作会导致针头穿刺部位周围细胞的基因表达发生变化（即损伤反应基因在伤口处上调；此现象已被我们及其他研究者观察到）。13因此，建议重点关注伤口部位以外的电穿孔细胞。此外，初学该技术时胚胎存活率较低，但随着操作熟练度提高，存活率会迅速上升 >通过练习，成功率可达95%。迄今为止，我们已成功运用子宫内电穿孔技术鉴定了端脑中受神经前体bHLH转录因子调控的基因4我们还验证了该技术用于端脑顺式调控元件分析的可行性。3.

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披露

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未声明任何利益冲突。

致谢

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作者谨此感谢 Eva Hadzimova、Pierre Mattar 和 Christopher Kovach 在 CS 实验室初步建立子宫内电穿孔技术过程中所做的工作。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR）基金（MOP 44094）和 CIHR/防盲基金会（FFB）新兴团队基金（00933-000）资助 CS，DMK 获阿尔伯塔儿童医院研究基金会基金资助。RD 获加拿大卫生研究院加拿大希望奖学金支持，RC 获防盲基金会研究生奖学金支持，LML 获加拿大卫生研究院儿童遗传学与发育研究培训基金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
精细剪刀手术器械Fine Science Tools14078-10
虹膜剪，弯型手术器械Fine Science Tools14061-10
Olsen-Hegar 超细针持手术器械Fine Science Tools12002-12
环形镊，9毫米手术器械Fine Science Tools11103-09
眼科敷料镊手术器械Fine Science Tools11051-10
Dumont #7 DMX 镊子手术工具Fine Science Tools11271-30
Dumont #5 DMX 镊子手术器械精细科学工具11251-30
组织镊-阿德森手术器械Fine Science Tools11027-12
反射式夹钳施加器手术器械World Precision Instruments, Inc.500343
直径15 mm穿孔勺手术工具Fine Science Tools10370-18
自动夹移除器手术工具Mikron427637
丝线黑色编织缝合线手术工具Ethicon Inc.K871
反射式皮肤闭合不锈钢伤口钉手术工具World Precision Instruments, Inc.500346
ECM 830 方波电穿孔系统仪器VWR 国际公司58018-004
带可变间隙的镊子，2个圆形5毫米铂电极板仪器Protech International, Inc.CUY650P5
带可变间隙的镊子式电极 2个圆形7毫米铂电极板仪器Protech International, Inc.CUY650P7
Eppendorf Femtojet 显微注射仪仪器VWR 国际CA62111-488
Eppendorf Femtojet 显微注射仪的脚踏控制仪器VWR国际CAACCESS（其他）
Bransonic 超声波清洗机型号 1510R-DTH仪器VWR 国际公司CA33995-534CPN-952-118
Sutter P97 微电极拉制仪 仪器Sutter Instrument Co.P-97
微量移液器 -– 外径：1 mm、内径：0.78 mm、长度 10 cm 的带丝硼硅酸盐玻璃管仪器Sutter Instrument Co.BF100-78-10
三轴粗调操纵器仪器卡尔·蔡司股份公司M-152
用于显微操作仪的磁力固定装置仪器World Precision Instruments, Inc.M1
显微操作仪用钢制底板仪器World Precision Instruments, Inc.5052
微量移液器架 仪器World Precision Instruments, Inc.MPH3
微量移液器手柄仪器World Precision Instruments, Inc.5444
体视显微镜仪器徕卡显微系统MZ6
异氟烷麻醉剂蒸发器仪器波特仪器公司MODEL 100-F
Metriclean2 低泡沫超声清洗液，用于外科手术器械的超声清洗手术试剂Metrex Research Corporation10-8100
缝合后使用含0.2 g亚甲蓝的庆大霉素40 mg/ml抗生素喷雾外科手术试剂Sigma-AldrichG1264
用于手术器械灭菌的Germex手术试剂Vé辅酶Q10氢醌形式DIN# 00141569
BNP 眼膏手术试剂Vé辅酶Q10氢醌形式DIN# 00516414
Nair®外科手术试剂教会 & Dwight Co.市售的
4% w/v 斯坦己定皮肤清洁剂手术试剂Omega Laboratories Inc.01938983
布托啡诺（Temgesic）镇痛剂外科手术试剂默克 & 公司531-535
磺胺类药物 "25" 磺胺二甲嘧啶口服抗生素外科手术试剂专业兽医实验室DIN# 00308218
乳酸林格液手术试剂Baxter Internationl Inc.DIN# 0061085
生理盐水 -– 0.9% 氯化钠外科手术试剂B. Braun MedicalDIN# 01924303
吸入麻醉药– Isoflurane USP手术试剂加拿大制药合作伙伴DIN# 02237518
快绿 FCF手术试剂Sigma-AldrichF7252

参考文献

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  1. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  2. Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in ....

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CNS DNA

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