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1. 设置
- 按照图1A、A'所示设置手术区域。关键设备包括Eppendorf Femtojet显微注射仪、配有持针器的Narishige显微操作器、Leica体视显微镜、光纤照明系统、ECM 830方波电穿孔系统及电极、加热垫以及异氟烷麻醉用蒸发器。
- 使用Metriclean2低泡沫溶液在Bransonic超声波清洗器中清洗所有手术器械，并通过高压灭菌法对器械进行灭菌。灭菌后的器械存放于Germex消毒液中。
- 准备含有温热无菌生理盐水和无菌乳酸林格液的注射器。
2. 麻醉
- 将动物放入一个小型（12 cm × 20 cm）麻醉室中。使用蒸发器以1 L/min的流速输送5%异氟烷麻醉剂和氧气（图1A，A'）。值得注意的是，必须使用废气清除系统收集异氟烷废气。
- 当动物呼吸变得深而规律时，将其从麻醉室中取出。通过脚趾夹捏和眨眼反射测试确认是否达到完全麻醉状态。
- 将怀孕小鼠仰卧置于加热垫（37°C）上。先用70%乙醇擦拭加热垫进行消毒，然后覆盖一层无菌无绒纱布垫。手术过程中使用呼吸管和面罩装置输送异氟烷（2.25%）。
- 在颈背部皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg体重）。
- 整个手术过程中持续监测动物的呼吸情况，应保持深而规律的呼吸。动物不应出现喘息、浅呼吸或快速呼吸。浅而快的呼吸可能是麻醉过浅的表现，应增加异氟烷流量；若动物开始喘息，则应减少异氟烷流量。如发生呼吸暂停，应立即关闭异氟烷，增加氧气流量直至动物恢复，随后以较低浓度重新开始异氟烷麻醉。
3. 手术动物准备
- 将动物的前肢用胶带固定在加热垫上，并用钝头镊子夹捏后肢足部，再次检查回缩反应。
- 使用无菌棉签，在腹部均匀涂抹一层较厚的脱毛膏（例如 Nair），以有力的动作确保底层绒毛完全被覆盖。保持约三分钟，并间歇使用无菌清洁棉签检查脱毛效果。用无菌纱布蘸取无菌水擦拭腹部，直至完全清除残留物。随后使用氯己定（例如 Stanhexidine）皮肤清洁剂及更多无菌水重复清洁。最后用干净的无菌纱布将腹部擦干。
- 先用氯己定（例如 Stanhexidine）对切口部位进行消毒，再用更多无菌水冲洗。用干净的无菌纱布将腹部擦干。随后使用70%乙醇及一支新的无菌棉签重复消毒步骤。
- 将一块中央有切口的无菌纱布覆盖在腹部，手术过程中子宫角将由此切口拉出。
4. 切开并暴露子宫角
- 为暴露子宫角，首先在皮肤中线处找到腹白线，即位于中线皮肤下的浅色线条。用镊子将皮肤从腹壁拉开，使用眼科剪在腹部中段向下做一小段直线切口（长约1厘米）。
- 使用弯头镊子和剪刀，对腹膜重复上述操作。
- 将带有小垂直切口的无菌纱布覆盖于切口上，并用预热的无菌生理盐水润湿。
- 将镊子滑入切口，找到子宫。用镊子撑开切口，同时取出子宫角。
- 在第一和第二个可见胚胎之间小心夹住子宫，将胚胎拉至纱布上。取出双侧子宫角，置于无菌纱布上，计数胚胎数量，并记录任何吸收中的胚胎或“不健康”胚胎（如体型较小者）。用生理盐水润湿子宫角，然后小心将一半子宫还纳回腹腔内。
5. 向脑室注射 DNA
- 使用 Sutter Flaming 微电极拉制仪，以带有毛细管的硼硅酸盐微量移液管制备外科手术针（程序： 热=750，拉力=30，速度=90，时间=150使用无菌手术刀片，以45度角轻轻削去针尖。
- 为装填针头，将巴斯德吸管在火焰下拉制成细小直径。将吹管接头连接至装填用吸管，吸取约10 μl含0.01%孔雀绿的无内毒素DNA溶液（浓度为3 mg/ml）（注：孔雀绿染料可使DNA注射过程可视化）。将装满液体的针头安装至显微操作仪支架，并连接至Femtojet显微注射仪。
- 从靠近卵巢的胚胎开始，使用环形镊子在蜕膜内轻轻旋转胚胎，使其呈“面部朝前”位置，以便注射沿头侧至尾侧方向进行。使用光纤光源照明，以帮助观察胚胎脑的中线结构，该区域头侧部分的中线两侧为较大的侧脑室（图1B，B'）。
- 使用环形镊子固定胚胎。将注射针置于子宫上方，使其进入大脑的角度约为45度。借助显微操作器，以快速而稳定的动作将针尖穿过子宫壁并插入胚胎的侧脑室。注射方向分别指向侧脑室、第三脑室或视网膜下腔，以分别靶向端脑、间脑和视网膜。需要注意的是，在胚胎发育早期阶段，脑泡仍处于开放状态，因此注入侧脑室的DNA可流入第三脑室rd 心室
- 踩下脚踏板，使用Eppendorf Femtojet显微注射仪注入无内毒素DNA（1–3 μL）。成功的注射可通过甲基绿染料在胚胎脑室内的扩散清晰观察到。随后缓慢上提并撤出注射针，以避免针尖断裂。
6. 电穿孔
- 将已注射的胚胎（仍位于子宫内）放置在覆盖于母体腹部的无菌纱布上，并用预热的生理盐水充分润湿。请注意**：在膜表面添加生理盐水对于有效传导电流至关重要。
- 在注射DNA后，使用GenePaddle电极夹住子宫。使用ECM8300 BTX电穿孔系统，以每秒一个脉冲的频率施加5次40–50 V、50 ms的方波电脉冲（图1C，C'）。
- 用保护性湿纱布覆盖已注射/电穿孔的胚胎，然后继续处理下一个胚胎。
- 完成所有目标胚胎的注射/电穿孔后，小心地将子宫角推回腹腔内（图1D）。
- 小心取出另一侧子宫角，并从靠近卵巢的胚胎开始重复操作。
7. 缝合与钉合
- 当所有胚胎均已放回子宫内后，在腹腔中加入约 2–3 ml 温热的生理盐水。
- 关闭切口时，首先移除腹部的纱布，确认腹膜两侧边缘。使用黑色编织丝线缝合腹膜。不建议在此操作中使用可吸收缝线，因其通常强度较低，可能导致术后出血或感染。将缝线固定在靠近胸骨的腹膜处，并从此锚定点开始向远端连续缝合。确保所有缝线均扎紧，且未将深层器官或皮肤意外缝入腹膜中。剪除剩余缝线并丢弃。
- 用镊子将皮肤拉拢覆盖于缝合线处。使用 9 mm Reflex™ 皮肤缝合钉，将皮肤切口处钉合，注意避免将下方的缝合线一并钉入，也不要过度牵拉皮肤。推荐操作方法为：用镊子将皮肤提起并远离体壁，缝合钉施加器以 90 度角垂直钉入。持续操作直至切口闭合（约三枚缝合钉）。完成后，用缝合器轻轻按压以确认缝合钉已牢固固定（图 1D'）。
8. 术后护理
- 为监测麻醉恢复情况，将雌性动物俯卧位放置并关闭异氟烷。保持动物面部处于呼吸装置内，将氧气流量调至3%以促进麻醉恢复。应将动物置于加热垫上的清洁干燥纱布垫上，以防止低体温。
- 在动物仍处于昏沉状态时，于其颈部皮肤下皮下注射2 mL林格氏液。
- 继续在氧气流下保持动物温暖数分钟，并更换温热的纱布垫以促使其苏醒。随着动物恢复正常的呼吸模式，应可观察到短暂的活动。持续观察数分钟，直至动物表现出清醒和警觉状态。
- 用庆大霉素喷雾剂喷洒雌性动物的腹部，并用无菌纱布包裹动物。
- 将动物转移至含有高压灭菌垫料和纸板栖所的无菌笼具中。
- 饮水瓶应彻底清洗、灭菌，并装入无菌水。在500 mL水中加入2 mL磺胺甲噻嗪抗生素（25%储备液）。
- 术后次日早晨，按0.05 mg/kg剂量皮下注射布托啡诺。
- 术后24小时内需密切监测雌性动物。若饲养时间超过24小时，则于第2天将雌性动物转移至新的无菌笼具中。
9. 代表性结果
新皮质
新皮层是中枢神经系统中负责视觉、感觉运动处理以及高级认知功能的区域。它由谷氨酸能投射神经元和GABA能中间神经元组成，分别起源于端脑的背侧和腹侧区域。为了研究不同基因在新皮层发育中的作用，我们采用 在子宫内 电穿孔技术用于在端脑背侧或腹侧过表达或阻断不同基因的表达（例如，使用shRNA载体）1,3,4为了在胚胎端脑中实现基因的异位表达，我们采用一种双顺反子表达载体（pCIG2），该载体包含CMV-βactin启动子-增强子以及内部核糖体进入位点（IRES）驱动的增强型绿色荧光蛋白（EGFP；位于pCIG2中）表达盒，从而可通过荧光显微镜检测转染细胞（图2A-C）。我们利用该技术在E11.5至E15.5期间将表达构建体导入端脑（图示数据为E12.5；图2）。通过在电转后继续培养胚胎数天，可追踪GFP标记的前体细胞的分化与迁移过程。随着分化进行，在电转后3天，GFP+ 细胞从脑室带（vz）、脑室下带（svz）和中间带（iz）分化并迁移至皮层板（cp；图2C）。若在E12.5电穿孔后24小时分析脑组织，可通过共标记顶端前体细胞标志物（如Pax6；图2A）、基底前体细胞标志物（如Tbr2；图2B）以及终末分裂的新皮层神经元标志物（如Tbr1；图2C），监测前体细胞成熟和神经元迁移的早期事件。
间脑
下丘脑位于中枢神经系统的腹侧基底部，作为内分泌系统与自主神经系统之间的门户。在发育过程中，构成成熟下丘脑的多个核团均起源于一个共同的前体细胞区域，该区域位于胚胎间脑最腹侧的部分。目前，调控前体细胞增殖、神经元分化以及下丘脑核团形成的分子通路仍不甚清楚。我们使用了 在子宫内 通过将DNA注入第3脑室，利用电穿孔技术将报告基因表达靶向至胚胎间脑rd E12胚胎的脑室。随后，我们在E14期追踪了GFP在分化神经元中的分布。通过该方法，我们成功将GFP表达靶向至丘脑、前丘脑和下丘脑（图3A）。冠状切片分析显示，我们已成功将GFP表达靶向至排列在第三脑室室管膜区的前体细胞rd 脑室及迁移至套层区形成神经核团的神经元（图3B）
视网膜
视网膜是眼睛的神经层，负责将光子转化为传递至大脑的电信号。它起源于间脑的胚胎外突，因此源自神经管。神经视网膜由一个位于视网膜下腔（subretinal space）附近的顶端前体细胞区发育而来，该腔隙将眼睛与头部间充质分隔开。因此，将DNA构建体靶向视网膜前体细胞时，需要将注射精准地注入一个很小的目标区域。借助显微操作仪，我们已成功在E13.5至E15.5胚胎的这一小区域实现了靶向注射（图中显示的是E15.5胚胎中对pCIC载体携带mCherry报告基因的电转染结果；图4）。若在转染后24小时观察电转染的视网膜，可发现大多数mCherry+细胞位于外层神经母细胞层（onbl），即正在分裂的前体细胞所在的位置，而非位于视网膜神经节细胞层（gcl；插图），后者是终末分裂后细胞的定位区域。
图1. 简介 在子宫内 电穿孔装置设置与方法学 (A) 手术装置的关键组件包括 Eppendorf Femtojet 显微注射仪（1）、配有持针器的 Narishige 显微操作仪（2）、Leica 体视显微镜（3）、光纤照明系统（4）、ECM 830 方波电穿孔系统及电极（5）和加热垫（6）。(A') 使用异氟烷麻醉蒸发器对动物进行麻醉。(B,B') 麻醉后，短暂暴露子宫角，将混有快绿染料的 DNA 注射至胚胎脑泡中。通过追踪快绿染料的分布可判断注射是否成功（B'）。(C,C') DNA 成功注射后，将板状电极置于子宫两侧，调整胚胎位置，使 DNA 向正极方向迁移并进入目标脑区。(D,D') 完成所有目标胚胎的注射后，将子宫推回腹腔（D），缝合腹膜，并用钉皮器闭合皮肤（D'）。随后让妊娠雌鼠恢复，于预定时间点收集电穿孔后的仔鼠。
图 2. 背侧端脑电穿孔的代表性示例。 （A-C）对 E12.5 时进行电穿孔、E13.5 时的背侧端脑冠状切片的显微照片。检测电穿孔的 GFP+ 细胞对顶端前体细胞标记物（Pax6+，红色，A）、基底前体细胞标记物（Tbr2+，红色，B）以及终末分裂后神经元标记物（Tbr1+，红色，C）的表达情况。cp，皮层板；svz，脑室下区；vz，脑室区。
图3. 间脑电穿孔的代表性示例。 (A) E12 胚胎期使用 pCIG2 进行电穿孔的 E14 胚胎脑腹侧观。绿色荧光蛋白（GFP）的表层荧光可见于丘脑、前丘脑和下丘脑，表明显微注射的 pCIG2 质粒已扩散至这三个区域rd 脑室。(B) 电穿孔脑组织冠状切片的显微照片，显示GFP标记细胞的迁移+ 细胞从室管膜区迁移至套层区，下丘脑核团将在套层区形成。3V，第三脑室；T，丘脑；Hy，下丘脑；mz，套层区；Tel，端脑；PreT，前丘脑；vz，室管膜区。
图4. 视网膜电穿孔的代表性示例。 对E15.5时进行电穿孔的E16.5胚胎眼球进行冠状切面观察，显示mCherry+细胞在外部神经母细胞层中聚集，而在节细胞层的Brn3b+视网膜神经节细胞中未见分布。插图为方框区域的高倍放大图像。gcl，视网膜神经节细胞层；le，晶状体；onbl，外部神经母细胞层；re，视网膜。