我们提出了一种用于对正畸矫治器上自然形成的口腔生物膜进行结构与成分分析的实验方案，该方案结合了 原位 荧光原位杂交（FISH）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）。口腔生物膜样本采集自腭扩张器，通过刮取其表面的丙烯酸树脂碎片并送至分子处理。
本文内容
摘要
摘要
目前，借助一系列全面的染色技术，可对天然异质性生物膜进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，其中一种技术即为荧光原位杂交（FISH）。1,2 我们开展了一项初步研究，采集固定式正畸装置（腭扩张器）上的口腔生物膜样本，采用FISH染色，旨在评估天然生物膜的三维结构及牙菌斑的积聚情况。3,4 FISH技术利用荧光标记的16S rRNA靶向探针，可在天然生物膜环境中对细胞进行特异性染色。4-7,19 与免疫荧光标记等其他技术相比，该方法成本较低、精确且操作简便，适用于研究混合生物膜群落中的不同细菌类群。18,20 本研究使用了针对真细菌（EUB338 + EUB338II + EUB338III；下文简称EUBmix）8-10、厚壁菌门（LGC354 A-C；下文简称LGCmix）9,10 和拟杆菌门（Bac303）11 的通用探针。此外，还使用了特异性结合Streptococcus mutans（MUT590）12,13 和Porphyromonas gingivalis（POGI）13,14 的探针。由于所涉及表面材料（不锈钢和丙烯酸树脂）硬度极高，我们不得不探索新的生物膜制备方法。由于这些材料难以用冷冻切片机直接切片，因此尝试了多种取样方法以获取完整的口腔生物膜。本文介绍的是其中最可行的操作方案：使用无菌手术刀从携带生物膜的丙烯酸树脂表面刮取微小碎片，过程中注意不破坏生物膜结构；使用镊子从金属表面收集生物膜。采集后，将样本固定并直接置于多聚赖氨酸包被的载玻片上。随后在载玻片上直接进行上述探针的FISH操作。我们整合并优化了多种FISH实验方案，建立了一种易于操作的新流程。5,10,14,15 随后通过共聚焦激光扫描显微镜对样本进行分析。可清晰观察到已知的生物膜结构3,4,16,17，包括蘑菇状结构以及被通道贯穿的球菌样细菌簇。此外，还分析了这些典型生物膜结构的细菌组成，并生成了二维与三维图像。
方案
1. 标本采集
- 在口内使用4个月后拆除固定的腭部扩弓器。拆除前使用NOLA Dry Field System隔离矫治器（图1和图2）。
- 使用已灭菌的钳子、手套和托盘拆除扩弓器，以避免引入污染（图3和图4）。
- 将取出物置于Sarstedt 120 ml试管中，于-20°C保存。运送时保持冰上运输，并在24小时内送至实验室处理。
2. 生物膜固定
- 使用无菌手术刀刮取生物膜碎片，或用无菌镊子收集生物膜片。
- 加入冰浴的4% PFA溶液，直至完全浸没样品。
- 将混合物在+4°C（切勿冷冻）孵育3至12小时。过长的固定时间或较高的固定温度可能导致革兰氏阴性菌细胞膜对寡核苷酸探针的通透性降低。
- 去除PFA溶液，并用冰浴的1X PBS洗涤。重复此步骤2-3次，以彻底去除残留的PFA。
- 将样品重悬于1体积冰浴的1X PBS中，再加入1体积冰浴的96%（v/v）乙醇。
- 将样品储存于-20°C。按照本方案固定的样品可保存数月甚至数年。
3. 固定样品的脱水
- 取5-30 μl经PFA固定的样品，滴加至载玻片上。
- 在46°C下干燥约15分钟，或在室温下干燥更长时间。同时将溶菌酶和甲酰胺解冻。
- 在室温下加入250 μl溶菌酶（1 mg/ml），作用10分钟，通过部分破坏细胞壁以促进探针进入细胞。
- 将载玻片依次浸入50%、80%和96%（v/v）乙醇中，每种浓度各3分钟。乙醇浓度梯度的脱水作用将破坏细胞膜结构。
- 在46°C下干燥载玻片10分钟。
4. 原位 杂交
- 配制 1 ml 新鲜杂交缓冲液（各组分浓度见表1）。本研究中使用的甲酰胺浓度为：10%（EUBmix）、20%（Bac303、POGI、MUT590）或 45%（LGCmix）。
- 解冻寡核苷酸探针溶液。解冻后的探针应置于冰上，并避免光照。
- 将每种探针各取 2 μl 加入 200 μl 杂交缓冲液中，充分混匀后，将混合液加至载玻片上的脱水样品处。
- 将一张滤纸放入方形培养皿中，并将剩余的杂交缓冲液倒在滤纸上。
- 立即将载玻片水平放入培养皿中并盖上皿盖。于 46°C 恒温箱中孵育 1–5 小时（多数情况下 90 分钟即可）。该培养皿作为保湿室，防止杂交液从玻片上蒸发。特别是甲酰胺的蒸发可能导致探针非特异性结合至非靶细胞。
- 配制 50 ml 洗涤缓冲液（各组分浓度见表2）。将洗涤缓冲液置于 50 ml 离心管中，并在水浴中预热至 48°C。洗涤步骤在 48°C 下进行。
- 从杂交炉中取出含玻片的培养皿。立即用少量预热的洗涤缓冲液冲洗掉杂交缓冲液，然后将玻片转移至剩余的洗涤缓冲液中。
- 将装有洗涤缓冲液和玻片的离心管放回水浴中，于 48°C 孵育 10–15 分钟。
- 从离心管中取出玻片，迅速浸入冰冻的 ddH2O 中 2–3 秒，以去除残留的洗涤缓冲液。
- 尽快将玻片晾干（建议使用压缩空气）。快速干燥可减少探针解离。
- 干燥后的玻片可在避光条件下于 -20°C 保存数周，探针荧光信号不会显著减弱。
5. 显微镜观察
- FISH 及洗涤步骤完成后，在载玻片左右两端各加两滴抗荧光淬灭剂（冷冻切片在进行此步骤前应先恢复至室温）。
- 盖上显微镜盖玻片，静置直至抗荧光淬灭剂均匀覆盖整个载玻片。注意抗荧光淬灭剂过量可能导致显微图像模糊。
- 使用配备合适滤光片或激光器的共聚焦激光扫描显微镜观察样品。我们使用的是 Leica TCS 系统（HCX PL APO/63x；NA 1.2）。数据可使用 IMARIS 或 AMIRA 等软件进行分析。
- 封片后含抗荧光淬灭剂的载玻片可在 +4°C（切勿冷冻）保存最多 7 天，之后探针荧光信号将开始减弱。或者，可用 ddH2O 去除抗荧光淬灭剂，将干燥后的载玻片于 -20°C 长期保存。
6. 代表性结果：
刮取固定正畸装置上的生物膜（图5）可获得适合的碎片（图6），可直接杂交到包被的玻片上用于显微镜观察。通过使用不同标记的特异性探针标记细菌rRNA，可在其天然的三维环境中识别口腔微生物组中不同类群的细菌（图7和图8）。在图7中，生物膜使用EUBmix（绿色，所有细菌）和LGCmix（黄色，厚壁菌门）染色。厚壁菌门呈现绿色，因其同时被黄色和蓝色染色。在图8中，生物膜使用EUBmix（红色，所有细菌）、Bac303（蓝色，拟杆菌门）和POGI（黄色，Porphyromonas gingivalis）染色。Porphyromonas gingivalis 显示为黄白色，因为三种探针均结合其DNA，颜色叠加后产生白色信号。还可识别不同类群细菌之间的形态学差异（图9和图10）。图9显示了球状细菌的大团簇，染色使用EUBmix（绿色，所有细菌）。图10展示了口腔细菌的不同形态，通过EUBmix（红色）染色可区分球状和丝状细菌。此外，还可通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）数据的三维建模处理生物膜典型的蘑菇样结构（图11和图12）点击此处观看三维建模的动画视频。
图1. 原位固定的腭部扩弓器 in situ。
图 2. Nola Dry Field 系统。
图 3. 已灭菌的镊子、手套和托盘。
图 4. 已移除的扩弓器。
图 5. 使用无菌手术刀刮除生物膜。
图6. 树脂碎片直接杂交到包被的玻片上。
图7. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像：特定细菌类群的区分。三维CLSM图像序列的二维叠加图。生物膜用EUBmix（绿色，所有细菌）和LGCmix（黄色，厚壁菌门）染色。
图8. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像：特定细菌群的区分。三维CLSM图像堆栈的二维叠加图。生物膜使用EUBmix（红色，所有细菌）、Bac303（蓝色，拟杆菌门）和POGI（黄色，Porphyromonas gingivalis）染色。
图 9. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像：特定形态的区分。三维CLSM图像堆栈的二维叠加。生物膜用EUBmix染色（绿色，所有细菌）。球菌细菌的大簇群（箭头所示）。
图 10. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像：特定形态的区分。三维CLSM图像堆栈的二维叠加。生物膜用EUBmix染色（红色，所有细菌）。可区分球状细菌（下方箭头）和丝状细菌（上方箭头）。
图11. 蘑菇状结构，从下方观察的3D视图。生物膜碎片堆叠（从正畸器具表面刮取），使用EUBmix染色，并通过IMARIS进行处理（CLSM图像）。
图12. 蘑菇状结构，三维侧视图。用IMARIS处理的生物膜碎片堆栈（从正畸器具表面刮取，CLSM图像）。
| 杂交缓冲液（200 μl） | |||
| 甲酰胺浓度 | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 36 | 36 | 36 |
| 1 M Tris-HCl | 4 | 4 | 4 |
| 2% SDS | 1 | 1 | 1 |
| FA | 20 | 40 | 90 |
| ddH2O | 138 | 118 | 68 |
| 任意FISH探针 | 2 | 2 | 2 |
表1. 杂交缓冲液的组分（体积单位为 μl）。
| 洗涤缓冲液（50 ml） | |||
| 甲酰胺浓度 | 10% | 20% | 45% |
| 5 M NaCl | 4500 | 2150 | 300 |
| 1 M Tris-HCl | 1000 | 1000 | 1000 |
| 0.5 M EDTA | 0 | 500 | 500 |
| ddH2O | 44 500 | 46 350 | 48 200 |
表2. 洗涤缓冲液的成分（体积单位为 μl）。
视频 1. 点击此处观看视频。
讨论
本文所述方案是一种适用于对从硬质材料采集的生物膜进行染色的高效可行方法。取样和杂交是最关键的步骤。在取样过程中，必须确保获取适当厚度的切片，以维持生物膜结构的完整性。在杂交过程中，必须避免温度的剧烈波动，从而防止荧光标记探针发生非特异性结合或结合信号丢失。该FISH方案是一种优雅的方法，可直接在玻片上对结构正常的异质性生物膜进行染色，且不破坏其组成。染色后的玻片可立即用于显微镜观察，无需再次转移样品。这种方法相较于在离心管中染色的优势在于，对生物膜施加的剪切力更小。厚度 > 50 μm 的切片亦可采用此方式制备并进行观察。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由格拉茨医科大学卫生基金（Hygiene Fonds）资助。所有受试者均签署了知情同意书。研究方案已获得格拉茨医科大学的机构批准。
参考文献
- Sunde, P. T. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of bacteria in periapical lesions of asymptomatic root-filled teeth. Microbiology. 149, 1095-1102 (2003).
- Sussman, M., Loya, Y., Fine, M., Rosenberg, E. The marine fireworm Hermodice carunculata is a winter reservoir and spring-summer vector for the coral-bleaching pathogen Vibrio shiloi. Environ. Microbiol. 5, 250-255 (2003).
- Kolenbrander, P. E. Communication among oral bacteria. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 486-505 (2002).
- Zijnge, V. Oral biofilm architecture on natural teeth. PLoS One. 5, e9321-e9321 (2010).
- Thurnheer, T., Gmur, R., Giertsen, E., Guggenheim, B. Automated fluorescent in situ hybridization for the specific detection and quantification of oral streptococci in dental plaque. J. Microbiol. Methods. 44, 39-47 (2001).
- Hojo, K., Nagaoka, S., Ohshima, T., Maeda, N. Bacterial interactions in dental biofilm development. J. Dent. Res. 88, 982-990 (2009).
- Jung, D. J. Visualization of initial bacterial colonization on dentine and enamel in situ. J. Microbiol. Methods. 81, 166-174 (2010).
- Al-Ahmad, A. Bacterial colonization of enamel in situ investigated using fluorescence in situ hybridization. J. Med. Microbiol. 58, 1359-1366 (2009).
- Bryers, J. D. Medical biofilms. Biotechnol. Bioeng. 100, 1-18 (2008).
- Cardinale, M., Vieira de Castro, J., Muller, H., Berg, G., Grube, M. In situ analysis of the bacterial community associated with the reindeer lichen Cladonia arbuscula reveals predominance of Alphaproteobacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 63-71 (2008).
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Chin, M. Y., Busscher, H. J., Evans, R., Noar, J., Pratten, J. Early biofilm formation and the effects of antimicrobial agents on orthodontic bonding materials in a parallel plate flow chamber. Eur. J. Orthod. 28, 1-7 (2006).
- Loy, A., Maixner, F., Wagner, M., Horn, M. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes: new features 2007. Nucleic. Acids. Res. 35, (2007).
- Diaz, P. I. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2837-2848 (2006).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J. Oral Sci. 115, 459-467 (2007).
- Kolenbrander, P. E. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontology. 42, 47-79 (2000).
- Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S., Jakubovics, N. S. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nat. Rev. Microbiol. 8, 471-480 (2010).
- Chalmers, N. I. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Wecke, J. A novel technique for monitoring the development of bacterial biofilms in human periodontal pockets. FEMS Microbiol. Lett. 191, 95-101 (2000).
- Moter, A., Gobel, U. B. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for direct visualization of microorganisms. J. Microbiol. Methods. 41, 85-112 (2000).
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