本文描述了一种用于生产蛋白质治疗药物的高通量、自动化细胞系开发制造平台。通过应用BD FACS Aria细胞分选仪、CloneSelect成像仪以及TECAN Freedom EVO液体处理系统，在细胞系开发中显著提高了处理通量，同时改善了细胞系质量并实现了高度可重复性。
本文内容
摘要
摘要
快速发展的生物制药产业迫切需要高效、可靠的生产系统，以满足日益增长的药物供应需求。传统上，生产用细胞系的构建依赖于人工操作，劳动强度大、通量低且易受人为误差影响。本文报道了一种集成化、高通量、自动化的平台，用于蛋白类治疗药物生产用细胞系的开发。
BD FACS Aria 细胞分选仪、CloneSelect 成像仪与 TECAN Freedom EVO 液体处理系统的联合使用，实现了高通量且更高效的细胞系开发流程。在该操作中，首先将携带目的基因的表达载体转染至生产用宿主细胞1，随后加入筛选试剂进行处理。稳定转染的细胞用荧光标记的抗人 IgG 抗体染色，继而进行流式细胞术分析2-4。根据荧光强度筛选出高表达细胞，并通过 BD FACSAria 进行单细胞分选以实现分离。从单细胞阶段开始的克隆形成过程通过显微镜观察，并由 CloneSelect 成像仪拍摄一系列延时数字图像，用于记录细胞系的发育历史。在单克隆形成后，利用 TECAN Freedom EVO 液体处理系统进行 ELISA 筛选以评估其表达量。在当前系统配置下，每个操作周期可筛选约 2,000 至 10,000 个克隆。
该整合方法已用于生成高产的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，以生产治疗性单克隆抗体（mAb）及其融合蛋白。借助不同类型的检测探针，该方法还可用于开发其他蛋白质治疗药物，或应用于其他生产宿主系统。与传统人工操作流程相比，该自动化平台具有显著优势，包括通量大幅提高、确保单克隆性、通过电子记录实现细胞系历史的可追溯性，以及显著降低操作人员出错的可能性。
方案
1. 宿主细胞转染
- 转染前一天，在含有15 ml生长培养基（MEMα培养基，含核苷酸和核苷（Gibco，货号12571），添加10% γ射线灭菌的经鉴定胎牛血清（cFBS）（HyClone，货号SH30071.03）和10 mL/L的45%葡萄糖溶液（Sigma，货号G8769））的T75 Corning细胞培养瓶中接种2 × 106个CHO-DXB11细胞。
- 转染时，按以下步骤制备转染复合物：
- 在无菌微量离心管中，将8 μg DNA溶于800 μl无血清生长培养基中，轻轻混匀。
- 在聚苯乙烯管中，将40 μl Lipofectamine（Invitrogen 18324012）溶于800 μl无血清生长培养基中。
- 将稀释后的DNA加入稀释后的Lipofectamine中，轻轻混匀，并在室温下孵育30分钟。
- 吸除T75培养瓶中的生长培养基，更换为6.4 ml无血清生长培养基，然后加入1.6 ml转染复合物，通过轻轻摇动培养瓶混匀。
- 将细胞置于37°C的CO2培养箱中孵育6小时。
- 向培养瓶中加入8 ml生长培养基，继续在37°C的CO2培养箱中过夜孵育。
- 吸除培养基，向培养瓶中加入新鲜生长培养基，在37°C的CO2培养箱中继续过夜孵育。
- 将生长培养基更换为筛选培养基（不含核苷酸和核苷的MEMα培养基（Gibco，货号12561），添加10% γ射线灭菌的透析胎牛血清（dFBS）（HyClone，货号SH30079.03）和10 mL/L的45%葡萄糖溶液（Sigma，货号G8769））。
- 将细胞在37°C的CO2培养箱中孵育2–3周。
2. 通过流式细胞术分选进行克隆
- 从培养瓶中悬浮细胞，并在 4°C 下以 800 rpm 离心 5 分钟。
- 将细胞重悬于添加了 2% 牛血清白蛋白和荧光标记的抗人 IgG 抗体（1:20 稀释）的筛选培养基中。
- 冰上孵育 15–30 分钟，然后用冷 PBS 洗涤两次。将细胞重悬于聚丙烯管中的 1× PBS 中。
- 在 BD FACSAria 上进行无菌分选准备。准备含有 200 μl 筛选培养基的 96 孔细胞培养板，每孔加入 200 μl。
- 无菌操作将含细胞的管上机，在 BD FACSAria 上进行分析，分别记录染色与未染色细胞的结果。
- 设定门控参数以将具有目标荧光染色特征的单个细胞分选至 96 孔板中。
- 首先根据前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）分析转染细胞。基于前向散射光（反映细胞大小）和侧向散射光（反映细胞复杂性或颗粒度）设定活细胞门控。
- 位于该门控范围内的细胞进一步检测 PE 染色情况。为未染色的转染细胞或染色的宿主细胞设定 PE 阴性门控。当通过流式细胞术检测染色的转染细胞时，将“高 PE”门控设定为包含所有 PE 染色阳性细胞中信号最强的前 5%。
- 将培养板置于 37°C 培养箱中孵育两周。
3. 使用CloneSelect成像仪记录克隆形成
在FACS分选后的第0天、第3天、第7天和第13天，使用CloneSelect Imager记录96孔板中的克隆形成情况。图像记录可确保所选克隆来源于单个细胞。此记录过程中的关键步骤是正确调整第0天测量时的焦平面，因为此时每个孔中仅含有一个细胞。这些单个细胞的图像必须清晰对焦，而试图通过这些单细胞来调整焦平面可能会导致误导。不同品牌培养板之间的焦平面可能存在显著差异，甚至同一品牌不同批次之间也可能存在差异。因此，必须使用预先确定的焦平面。可通过聚焦于与实验所用培养板同一批次的测试微珠或高密度细胞沉积物来实现焦平面的设定。或者，也可使用同一批次培养板中已完全长满的细胞板进行此操作。FACS分选后，成像前还需让细胞静置至少2小时，以确保细胞在孔板上位置固定。
4. 高产克隆的筛选与选择
- 记录样本在接收用96孔检测板中的位置。
- 使用TECAN Freedom EVO液体处理系统将20 μl上清液（必要时进行稀释）转移至96孔检测板中。该灵活且功能强大的机器人平台已针对此项及其他自动化细胞培养工作进行了适配。已编写特殊程序以最大限度地利用并增强Freedom EVO机器人在细胞系开发中的能力。例如，可设置TECAN系统以解读CloneSelect Imager的数据，从而对含有单克隆的孔进行取样。此外还需其他程序来执行额外的细胞培养任务，例如对所取样本进行适当稀释、解读、编目并取样手动标记的板（如需要）、扩增高表达克隆等。其中许多程序也可轻松应用于384孔板以及原始的96孔板格式。
- 使用TECAN Freedom EVO液体处理系统，通过夹心法人IgG检测试剂盒（Pierce, Rockford, IL）对样本中的抗体产量进行分析。
- 将样本和标准品（人骨髓瘤IgG1，κ链）（Sigma, St. Louis, MO）加入预先包被的Bio Coat抗人IgG检测板（BD Biosciences, San Jose, CA）中。
- 板在室温下孵育两小时，随后用PBS洗涤三次。
- 加入ImmunoPure山羊抗人IgG（Fc-γ）-HRP（Pierce, Rockford, IL），按1:2000稀释后在室温下孵育一小时。
- 加入ABTS底物（Pierce, Rockford, IL）前，用PBS洗涤板三次，并使用酶标仪在405 nm波长下测定吸光度以进行检测。
- 筛选高产克隆，并在悬浮培养中评估其生产能力。对于补料分批培养，将细胞以0.3×10⁶ cells/mL的密度接种于无蛋白培养基JRH ImMEDIAte ADVANTAGE 65578（SAFC Biosciences, Lenexa, KS）中，添加5 g/L大豆水解物（DMV International，货号SE50MAF-UF，批号）并在37°C、7.5% CO2条件下培养。当培养液中葡萄糖与乳酸浓度总和低于2 g/L时，补充2 g/L葡萄糖（Sigma，货号G8769，批号098K2329）；当谷氨酰胺浓度低于200 mg/L时（代谢物由YSI生化分析仪测定），补充2 mM谷氨酰胺（Gibco，货号25030，批号568177）。补料分批培养在第14天终止，并通过反相高效液相色谱法（HPLC）测定抗体产量。
- 通过荧光原位杂交（FISH）5对候选克隆进行遗传学表征。
5. 代表性结果：
图1和图2展示了使用高通量方法开发抗体生产克隆的示例。转染后的细胞池用荧光标记的抗人IgG抗体染色（图1A），并在BD FACSAria上进行分析和分选（图1B）。在96孔板中的克隆形成情况通过CloneSelect Imager成像（图1C）。从含有单个克隆的孔中采集细胞培养上清液，并在TECAN Freedom EVO液体处理系统上通过ELISA进行检测（图1D）。高产克隆来源于表面抗体表达水平较高的细胞，这通过荧光标记的抗人IgG染色得以反映。比较初始转染细胞池中两个不同群体所产生的克隆时，发现其在补料分批培养中的生产性能存在显著差异（图2）。对于来自表面抗体高表达细胞群体（PE高）的两个最佳克隆，其比生产率范围为50–70 pg/cell/day；而来自表面抗体低表达细胞群体（PE低）的两个最佳克隆，其抗体比生产率约为20 pg/cell/day。此外，通过FACS分选建立的细胞系在抗体生产方面的稳定性优于通过手动有限稀释法克隆的细胞系（图3A）。通过手动有限稀释法获得的最佳克隆“克隆1”（Clone 1）在培养经历80次细胞倍增后，其比生产率从约30 pcd下降至约10 pcd；而通过FACS分选获得的最佳亚克隆“克隆2”（Clone 2）则能够在至少100次细胞倍增过程中维持约20 pcd的比生产率。通过荧光原位杂交（FISH）分析表明，克隆1表现为表型A（85%）和表型B（15%）的混合群体；相比之下，FACS分选获得的克隆（克隆2）为更均一的群体，其中99.5%的细胞被证实为表型A（图3B）。
图 1. 利用CHO细胞开发单克隆抗体生产用细胞系。A) 使用荧光标记的抗人IgG抗体对初始转染细胞池进行表面染色。B) 将荧光强度高（PE高）和荧光强度低（PE低）的细胞群分选至96孔板中。C) 使用CloneSelect Imager记录接种后第0天至第13天的克隆形成情况。D) 通过ELISA筛选克隆。
图 2. 细胞表面相关抗体水平与细胞的抗体生产率呈正相关。分别将荧光染色强和弱的克隆开发为细胞系，并在补料分批培养中进行评估。比较了每组中前两个克隆的体积滴度和比生产率。
图3. 通过FACS分选获得的克隆表现出更高的遗传同质性和克隆稳定性。A) 在批培养中，经过约80次细胞倍增的培养时间后抗体生产的稳定性。Δ，克隆通过有限稀释法获得，细胞接种密度分别为2000个细胞/孔、1000个细胞/孔和500个细胞/孔。
，克隆通过FACS以每孔1个细胞的方式获得。B) 利用荧光原位杂交技术鉴定CHO细胞染色体中的转基因整合位点。
讨论
我们介绍了一种自动化的细胞系构建平台，该平台能够分离出高产克隆，同时确保克隆的单克隆性和稳定性。通过表面抗体染色结合FACSAria细胞分选技术，是获得高抗体表达单克隆的关键。我们的研究结果及其他文献报道2-4表明，细胞表面瞬时表达的抗体水平与细胞的生产性能高度相关。因此，可使用荧光素标记的抗体识别膜结合产物，从而辅助高产克隆的分离。此外，共表达报告基因以及凝胶微滴技术也已被用于通过FACS筛选高产克隆6-8。除了FACS分离高产克隆外，其他技术也已发展用于实现相同目标。这些技术包括Trellis Bioscience的CellSpot技术，该技术利用微球抗体检测系统和激光筛选技术识别高产克隆并清除不需要的细胞；Genetix的ClonePix FL系统以及StemCell Technologies的ClonaCell EasyPick平台，这些平台均采用荧光抗体检测系统对生产细胞系进行高通量筛选。我们选择基于细胞表面抗体表达水平的FACS克隆方法，因其兼具操作简便、生产性能选择性强以及可保证单克隆性的优势。
采用Tecan Freedom EVO液体处理系统显著提高了筛选通量，从而能够从更大规模的细胞库中筛选出高产克隆。其他可用于检测的仪器，如HTRF、BioForte Octet、HPLC等，也均可用于选择高表达细胞株并淘汰低表达细胞株。通过CloneSelect Imager追踪克隆形成过程，我们获得了必要的文件记录，以数字化的细胞系历史证明克隆来源单一性。进一步通过基因水平表征染色体上单个转基因整合位点，可进一步确认克隆来源单一性。因此，通常用于确保克隆来源单一性的亚克隆步骤可能被省略，从而为细胞系开发节省4至8周的时间。总之，该高通量自动化平台所获得的高质量细胞系具有高生产效率、生产稳定性以及可追溯的细胞系历史，能够满足大规模生产及当前法规监管的要求。
披露
本文作者为默克公司（Merck & Co., Inc.）的雇员，该公司在哺乳动物细胞系中利用该方法大规模生产蛋白质治疗药物。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BD FACS Aria™ 细胞分选仪 | BD Biosciences | ||
| CloneSelect™ 成像仪 | Genetix | ||
| TECAN Freedom EVO® 液体处理系统 | Tecan Group Ltd. |
参考文献
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