功能性心脏免疫细胞的分离

摘要

这种从心脏中分离功能性免疫细胞的方法为传统的胶原酶消化法提供了一种替代方案，后者会引起非预期的免疫细胞活化，导致这些细胞的反应性降低。我们的分离方法避免了酶消化相关的问题，从而获得具有功能的心脏免疫细胞。

摘要

心脏免疫细胞因其在多种心脏疾病病理重塑过程中所起的作用而日益受到关注^1-5。这些免疫细胞包括肥大细胞、T细胞和巨噬细胞，能够储存并释放多种生物活性介质，如细胞因子以及类胰蛋白酶等蛋白酶^6-8。研究表明，这些介质可通过激活基质金属蛋白酶或通过调节心肌成纤维细胞功能导致胶原蛋白积聚，在细胞外基质代谢中发挥关键作用^9-11。然而，目前用于分离心脏免疫细胞的技术存在局限性，因其通常使用细菌胶原酶消化心肌组织，该过程可导致免疫细胞被激活，从而丧失其正常功能。例如，心脏肥大细胞对诱导脱颗粒化合物的反应性显著降低¹²。因此，我们建立了一种可分离功能性心脏免疫细胞的技术，有助于更深入地理解这些细胞在心脏疾病中的作用^{13, 14}

该方法要求熟悉大鼠剑突、腋窝、镰状韧带以及心脏心包膜的解剖位置。这些解剖标志对于提高操作成功率和获得更高产量的心脏免疫细胞至关重要。分离得到的心脏免疫细胞可用于功能、表型、成熟度的表征，以及与其他心脏细胞的共培养实验，从而更深入地理解它们之间的相互作用。

方案

1. 配制汉克斯平衡盐溶液（HBSS）

1. 将1 L玻璃烧杯、1000 mL量筒和搅拌子进行高压灭菌。
2. 在已灭菌的1 L玻璃烧杯中，用双蒸水将HBSS粉末溶液定容至900 mL刻度线。
3. 向HBSS溶液中加入3.4 g Hepes钠盐，并使用浓HCl或NaOH将pH值调节至7.35–7.41之间。
4. 当达到目标pH值并保持稳定后，在室温下向溶液中加入5 g牛血清白蛋白，持续搅拌直至白蛋白完全溶解。
5. 向溶液中加入10 mL抗生素-抗真菌剂，并用双蒸水定容至1000 mL刻度线。
6. 充分搅拌溶液。
7. 将HBSS溶液过滤后分装至50 mL Falcon离心管中以备后续使用。多余的分装管可冷冻保存，供日后使用。

2. 动物准备——气管插管

1. 准备一个托盘，放置插入气管插管所需的器械和材料（例如：镊子、剪刀、气管插管、3-0黑色编织缝线、小型动物呼吸机等）。
2. 当大鼠通过按2:1比例配制的氯胺酮/赛拉嗪混合物完全麻醉后，剃除其腹部、胸部和喉部的毛发。为确认已达到深度麻醉状态，可夹捏大鼠脚趾并观察肢体是否出现屈曲回缩反应。在进行任何切口前，务必确保大鼠处于深度麻醉状态。
3. 将大鼠置于一块切割板上，头部抬高，切割板倾斜30°角。
4. 从腹部中线开始向下颌下方做一皮肤切口。分离颈部前三角区的肌肉组织，暴露气管。
5. 将一根3-0黑色编织缝线穿过气管下方。
6. 在气管软骨环之间做一切口，插入气管插管，并将缝线扎紧，以固定气管插管与气管的连接。
7. 将气管插管连接至小型动物呼吸机。

3. 免疫细胞分离的仪器准备

1. 准备一个托盘，放置用于免疫细胞分离操作的器械（例如镊子、剪刀、HBSS、修剪过的柔软特氟龙材质24号Baxter套管针快速导管）。
2. 准备两个10 mL注射器，其中一个装入HBSS，用于将缓冲液注入心包腔；另一个留作抽吸含有细胞的HBSS之用。
   
   3.2.1. 为进行分离操作，将24号Baxter套管针快速导管的特氟龙尖端（原长1.6 cm）剪短至原长度的1/2至3/4。
3. 将所有注射器、缓冲液以及一个空的15 mL Falcon离心管（用于在操作结束后盛装提取的液体）置于冰上。

4. 免疫细胞分离

1. 沿腹白线在腹壁做正中切口，直至剑突。
2. 从剑突稍外侧开始，沿斜向腋窝的方向在两侧肋骨上做切口。注意避免穿破肺、心脏或心包膜。
3. 当胸骨两侧的切口完成后，从下位肋骨处向内侧解剖分离膈肌。
   
   注意：始终注意心包膜与膈肌和胸骨的连接位置，避免造成损伤。可利用镰状韧带作为解剖标志，判断心包膜在膈肌对侧的附着位置。此外，若心包膜被切破，则将无法有效分离细胞。
4. 轻柔抬起一侧肋骨，以暴露胸腔及心脏（心脏仍被心包膜包裹）。
5. 取装有HBSS的注射器，在心包腔内选择一个位置，大致位于胸骨与心脏之间的中点处（优先选择偏头侧而非尾侧的位置），将截短的快速导管（quick-cath）的聚四氟乙烯（Teflon）头穿过心包膜双层插入。
6. 导管就位后，缓慢注入2至3 ml HBSS缓冲液至心包腔。若导管位置正确，可立即观察到心包腔扩张。若未见充盈，应撤出并重新调整快速导管的位置。
7. 当心包腔充满液体后，取另一支10 ml注射器，将针头重新插入心包腔，开始抽吸缓冲液。可使用同一穿刺孔，也可另开新孔。抽吸过程中，确保针头不要过于靠近心包腔壁，尤其是心脏下方区域，以免刺破心包腔，导致含细胞液体流失。
8. 在抽吸缓冲液的同时，可轻微移动导管头在心包腔内的位置，以尽可能收集更多的液体。

注意：如果在此过程中轻微撕裂心包膜，导致心脏顶部的孔洞比原始孔洞稍大，无需惊慌。只要心包膜仍包裹住足够多的心脏组织，仍可进行额外的心脏冲洗，尽管缓冲液体积需相应减少。为收集到最佳数量的细胞，还需进行三到四次额外冲洗。

9. 将提取的缓冲液放入预先置于冰上的 Falcon 管中。
10. 根据后续实验需要，移除心脏、肺脏和/或任何其他组织。在收集免疫细胞和其他组织后，必须迅速且人道地处死大鼠。
11. 将收集的免疫细胞样品在 4°C 下以 200g 离心 10 分钟。不使用时，始终将管子置于冰上。
12. 弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL Hyclone 缓冲液或 HBSS 中。

注意：在免疫细胞分离程序后，对从每颗心脏获得的免疫细胞数量进行计数非常重要。

5. 代表性结果：

利用该技术获得并经甲苯胺蓝以及番红O/阿尔新蓝染色的分离心脏肥大细胞示例分别如图2A和2B所示。如图3所示，心脏肥大细胞在经已知激活剂（如化合物48/80和P物质）处理后，仍保持释放组胺的能力，相关方法见Morgan等⁹的描述。CD4+细胞和CD8+细胞的代表性流式细胞术散点图分别如图4和图5所示。T淋巴细胞可进一步通过该技术被鉴定并表型分类为特定的细胞群体。

图1. 心脏免疫细胞分离流程图。

图 2. 心脏肥大细胞的组织学代表性图像染色如下：(A) 甲苯胺蓝染色，(B) 阿利新蓝-藏红O染色。

图 3. 从心外膜心肌区域分离的心脏肥大细胞在化合物 48/80（10μg/mL）和P物质（10μM）刺激下的功能研究。

图4. 经P物质（1:100稀释）标记的分离CD4+细胞的代表性流式细胞术散点图。

图 5. 经P物质（1:100稀释）标记的分离CD8+细胞的代表性流式细胞术分析结果。

讨论

这种分离心脏免疫细胞的方法能够在不引起传统酶消化分离技术中常见非预期激活的情况下，分析这些细胞的功能、表型和成熟度。采用该技术每只大鼠心脏平均可获得约400,000个细胞，对这些细胞进行差异染色和流式细胞术分析表明，细胞群体主要包括T淋巴细胞（约70%）、巨噬细胞（约12%）和肥大细胞（约12%）^{13, 14}。因此，需要进一步的纯化方法以实现心脏免疫细胞亚群的分离。分离得到的免疫细胞可用于多种实验应用，包括功能研究、流式细胞术、免疫荧光以及共培养实验。通过进一步纯化和实验，这些分离的细胞为研究免疫系统在心脏重塑过程中的作用提供了有力工具。

动物安全：

大鼠在标准环境条件下饲养，并可自由摄取商品化大鼠饲料和自来水。ad libitum。所有研究均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》的原则，并经南卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会批准。实验终点时，采用氯胺酮与赛拉嗪按2:1比例配制的混合物进行麻醉。该操作为非存活性手术，允许使用未经灭菌的器械。在分离免疫细胞及其他所需组织后，根据...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
亨克斯’ 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H4891	一瓶配制1升Hanks液’ 平衡盐 溶液。用Hanks重新溶解’ 平衡盐 作为实验步骤的一部分的溶液。
抗生素-抗真菌剂	GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene 滤瓶	赛默飞世尔科技公司	157-0020
12 N HCl	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	对于6 N，将等体积的HCl加入去离子水中。
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	对于5 N，将等体积的NaOH加入去离子水中。
双蒸水
特定设备清单：
3-O 缝合丝线编织	Ethicon Inc.	SA64H
小型动物呼吸机	CWE, Inc.	SAR-830	将呼吸频率设置为 40.5 次/分钟。
18号斜面针头	BD Biosciences	305199	将针头修剪至原长度的1/2至3/4，用作气管插管。
24 号 Baxter Quick-Cath 导管（移除针头）的聚四氟乙烯尖端	Baxter Internationl Inc.	2N111	将特氟龙尖端长度缩短至1/2到3/4。
10 cc 注射器	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon管	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B 冷冻离心机	Fisher Scientific	75-004-377	请记住预先冷却并保持在4℃°C.
Hyclone	赛默飞世尔科技公司	S300030.02
血细胞计数板	豪瑟科学	HS-LB-1483