为微流控装置中的区室化培养准备E18大鼠皮层神经元

摘要

在本视频中，我们演示了E18大鼠皮层神经元的制备方法。

摘要

在本视频中，我们演示了E18大鼠皮层神经元的制备过程。E18大鼠皮层神经元来源于先前已解剖并准备好的E18胎鼠皮层组织。皮层组织在解剖后需立即解离为单个神经元。E18皮层组织可在含有B27的Hibernate E缓冲液中于4°C保存最多一周后再进行解离，但细胞活力会有所下降。通常情况下，我们使用新鲜获取的E18皮层组织。组织运输至实验室时，置于冰上预冷的无钙无镁解剖缓冲液（CMFM）中。到达后，向皮层组织中加入胰蛋白酶，使其终浓度为0.125%。随后将组织在37°C孵育8分钟。加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基以终止消化反应。将组织在2500 rpm下离心2分钟。弃去上清液，加入2 ml含2% B27（v/v）和0.25% Glutamax（v/v）的神经基础培养基（NBM），并通过反复吹打使沉淀重新悬浮。接下来，使用经火焰抛光的玻璃移液管对组织进行吹打解离，移液管口径依次减小。吹打完成后，再次以2500 rpm离心2分钟。弃去上清液，将沉淀用2 ml含B27和Glutamax的NBM重新悬浮。细胞悬液随后通过40 µm尼龙细胞滤网过滤。接着对细胞进行计数。此时神经元已准备好用于接种至神经元微流控装置中。

方案

为E18胎鼠皮层神经元的区室化培养做准备

开始实验前，务必将所有必需的培养基和试剂预热至 37°C。

同样重要的是 对用于细胞制备的所有物品（如橡胶吸头、试管架、培养基瓶等）进行灭菌处理，以及后续使用的相关器具 被放置 在通风橱中 用70%乙醇擦拭。

1. 将两份E18胎鼠大脑皮层组织（来自一个先前已解剖的大脑）放入含有1 ml冰冻无钙无镁解离缓冲液的15 ml离心管中。
2. 向含有皮层组织的解离缓冲液中加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使终体积达到2 ml，终浓度为0.125%胰蛋白酶。
3. 将15 ml离心管置于37°C水浴中孵育8分钟。
4. 在此期间，在生物安全柜中对3支玻璃巴斯德吸管进行火焰抛光，使其尖端开口依次变小，以保持无菌状态。
5. 皮层组织孵育8分钟后，向其中加入10 ml含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，以终止胰蛋白酶反应。
6. 将含有皮层组织和DMEM/10% FBS的15 ml离心管在2500 rpm条件下离心2分钟。
7. 在生物安全柜中，使用连接真空负压装置的玻璃巴斯德吸管小心吸除上清液，注意不要扰动或移走沉淀物。
8. 向皮层组织沉淀中加入1 ml NMB培养基，轻轻吹打混匀。吹打过程中必须避免产生气泡，因为气泡可通过 氧化作用损伤细胞。
9. 使用开口最宽的火焰抛光巴斯德吸管，将其末端连接无菌橡胶吹球，上下吹打5次以 triturate（机械解离）皮层组织，再次注意避免引入气泡。随后依次使用另外两支开口更小的玻璃吸管继续该过程 。
10. 完成解离后，再次以2500 rpm离心 细胞2分钟。
11. 离心结束后，再次小心吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于2 ml NBM培养基中。
12. 将重悬的细胞悬液通过45 µm细胞滤网过滤。
13. 用台盼蓝染色细胞，进行计数后加载至实验装置中。通常每装置加载20 µl细胞悬液。

注意：细胞的终浓度通常介于 250 万细胞/ml 至 800 万细胞/ml 之间

加样细胞

细胞计数完成后，即可将细胞加载到装置中：

1. 将先前制备好的含有NBM的装置移入生物安全柜中，以保持无菌状态。
2. 用真空抽吸法去除孔中的过量培养基，但注意避免将所有培养基完全吸除—— 主通道中必须有一些培养基。
3. 将20 μl细胞加入装置的左上方储液池中（如有需要，请参见示意图）。细胞流入装置并附着于PLL处理的表面。
4. 加样后，将含有细胞的装置放回培养箱中孵育10分钟，以使细胞贴壁。
5. 10 分钟后，向储液槽中加入培养基，并将装置放回培养箱中。

讨论

细胞密度可根据具体应用进行调整。然而，原代神经元接种密度过低通常会导致细胞死亡。根据培养箱及湿度水平的不同，可能需要每2至3天更换一次装置中的培养基。更换培养基时，从储液池中移除培养基后，切勿从主通道中移除培养基。此外，建议先将新鲜培养基加入上方孔中，使部分新鲜培养基流经装置并进入主通道，然后再填满所有储液池，这是一种良好的操作实践。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NBM	培养基	Invitrogen	21103-049	神经基础培养基（Neural Basal Media）由 Invitrogen 公司通过其 Gibco 细胞培养试剂系列提供。
E18 大鼠胚胎	动物			来源于妊娠的 Sprague Dawley 大鼠。通过处死妊娠大鼠，解剖获取 E18 胎鼠大脑皮层组织。
CMFM 解剖缓冲液 HBSS	缓冲液			基于冰冻的无钙无镁 HBSS 解剖缓冲液。
15 ml 离心管	工具	BD Biosciences	Falcon No. 352097	可通过 Fisher Scientific 目录编号 14-959-70C 购得。
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	试剂	Invitrogen
37˚C 水浴
巴斯德吸管		Fisher Scientific		玻璃材质
DMEM	培养基	Invitrogen
FBS	试剂	Invitrogen		血清，在 DMEM 中使用浓度为 10%
离心机				设定为 2500 rpm
台盼蓝		Invitrogen		用于活/死细胞计数
BD Falcon 细胞滤网 40 µm	工具	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	可通过 Fisher Scientific 购得，Fisher 目录号 08-771-1
B27	试剂	Invitrogen	17504-044	B27 是 Invitrogen 公司 Gibco 细胞培养试剂系列中的一种专有添加剂。
Glutamax	试剂	Invitrogen	35050-061	Glutamax 由 Invitrogen 公司通过其 Gibco 细胞培养试剂系列提供。