侧向液体冲击：小鼠创伤性脑损伤模型

摘要

本文演示了小鼠创伤性脑损伤的成熟模型——侧向液体脉冲冲击（LFP）。LFP 满足动物模型的三个主要标准：有效性、可靠性和临床相关性。文中描述了该实验操作的完整流程，包括外科开颅手术、连接装置的固定以及损伤的诱导，最终导致局灶性和弥漫性脑损伤。

摘要

由于人们对导致发病率和死亡率的头部损伤日益关注，创伤性脑损伤（TBI）研究重新获得了发展动力。根据TBI后原发性损伤的性质，会引发复杂且异质性的继发性后果，随后出现再生过程^1,2。原发性损伤可由颅骨骨折导致脑组织直接受挫，或因组织剪切与拉伸引起脑部移位所致^3,4。由此产生的血肿和脑裂伤会引发血管反应^3,5，而白质的形态和功能损害则导致弥漫性轴索损伤^6-8。脑内常见的其他继发性改变包括脑水肿和颅内压升高⁹。TBI发生后，生化和生理通路会发生微观层面的改变，涉及兴奋性神经递质、免疫介质和氧自由基的释放^10-12，最终导致长期的神经功能障碍^13,14。因此，选择能够模拟人类与啮齿类动物TBI中相似细胞和分子事件的合适动物模型，对于研究损伤与修复机制至关重要。

已开发出多种创伤性脑损伤（TBI）实验模型，以模拟在人类中观察到的TBI特征，其中三种特定模型在啮齿类动物中被广泛采用：液体打击损伤模型、皮层冲击损伤模型和自由落体/冲击加速损伤模型¹。液体打击装置通过颅骨切除术，在完整的硬脑膜上施加短暂的液体压力脉冲来造成损伤。该压力脉冲由摆锤撞击液体储液器的活塞而产生。这种打击会导致神经组织发生短暂的位移和形变^1,15。相反，皮层冲击损伤则是通过气压驱动的刚性撞击器向完整的硬脑膜传递机械能量而造成损伤^16,17。自由落体/冲击模型的特点是具有一定质量的杆状物落在闭合的颅骨上¹⁸。在这些TBI模型中，侧向液体打击损伤（LFP）模型是最成熟且最常用的模型，用于评估混合性局灶性和弥漫性脑损伤¹⁹。该模型具有良好的可重复性，并已实现标准化，便于调控损伤参数。LFP能够重现人类中观察到的损伤特征，因此具有临床相关性，同时也可用于探索新型治疗方法，推动其向临床转化²⁰。

我们描述了在小鼠中实施LFP（轻度至中度脑外伤）的详细实验方案。所造成的脑损伤为轻度至中度，大脑皮层、海马和胼胝体等脑区最为易损。在LFP后，可进一步开展海马依赖性学习和运动学习相关的行为学任务评估。

方案

1. 开颅术

1. 准备无菌手术区域，包括使用小鼠立体定位仪（Kopf Instruments）和连接至麻醉机（含O₂冲洗功能，Parkland Scientific）的小鼠气体麻醉头架（Kopf Instruments），以便在手术期间持续吸入异氟烷。手术过程中将保持在37°C的加热垫置于小鼠下方。需要配备手术显微镜及光源。实验人员应穿戴实验服、外科口罩、鞋套、手套和头套。所有接触手术区域的器械和材料均需灭菌。
2. 通过使用刀片切除20号1½英寸针头（Becton Dickinson）的金属端，制备一个损伤连接头，该连接头由Luer-lok雌性端构成。切割时应略带倾斜，使其内径开口约为3 mm。可使用环钻（见步骤1.10）测量并制作合适直径的损伤连接头。每只动物需准备一个连接头。该连接头将被固定于颅骨上，并与LFP装置连接以传递压力脉冲。
3. 使用刀片将实心尼龙线（直径1.7 mm，例如割草机线）切成约1 mm厚的圆片。同样，每只动物需要一个圆片。该圆片用于在进行开颅术时稳定环钻（见步骤1.10）。
4. 小鼠可采用任何品系和年龄（我们主要使用1至9月龄的C57BL/6小鼠）。称量小鼠体重后，将其放入预充满4–5%异氟烷（溶于100% O₂）的小型诱导室中麻醉至少1分钟。为实施预先镇痛，经腹腔注射布托啡诺（0.1 mg/kg），然后将小鼠放回诱导室再停留1分钟。镇痛方案应经与当地实验动物使用与护理委员会协商确认。
5. 尽可能贴近皮肤剪除小鼠头部顶部的毛发。将小鼠固定于配备咬合板的立体定位仪中，该装置用于输送挥发性气体麻醉剂（Kopf Instruments）。将异氟烷气体浓度降低至2%或根据麻醉效果调整。手术期间通过肉眼监测呼吸频率。其他生理参数如血气（_pO₂、_pCO₂）、血液pH值或血压可在操作过程中使用适当设备进行测量。
6. 使用棉签将人工泪液润滑眼膏涂抹于小鼠眼部，防止其干燥。用棉签将聚维酮碘涂抹于两眼之间至颈部的皮肤，随后使用70%酒精处理。聚维酮碘和酒精的涂抹共重复3次。
7. 使用手术刀（#15刀片）从眼睛至颈部做正中矢状切口，用小型鳄鱼夹（Fine Science Tools #18050-28）牵拉并固定皮肤，以暴露颅骨并提供清晰的手术视野。鳄鱼夹应夹在颅骨的侧缘外侧。
8. 用棉签将局部麻醉剂布比卡因（0.025%生理盐水溶液）涂抹于颅骨表面，并用牙科工具或骨刮匙尖端（例如Fine Science Tools，#10075-16）刮除颅骨上的筋膜组织。
9. 使用永久性记号笔在颅骨上标记前囟与后囟中点，以及右半球矢状缝与外侧嵴之间（距中线约2 mm右侧）的位置。将一滴Loctite氰基丙烯酸酯胶水（Loctite Tak Pak 454）滴入塑料称量皿中，使用侧向夹持镊子（Fine Science Tools，Dumont #6）夹取一段实心尼龙线圆片（见上述1.3）蘸取胶水，然后将其压在颅骨标记处。使用1 ml注射器和26 3/8 G钝针向圆片上方滴加1至2滴Loctite加速剂，促使胶水固化。在继续操作前测试圆片与颅骨的粘附牢固性。
10. 将外径3 mm的环钻（宾夕法尼亚大学研究仪器车间）置于圆片上，顺时针旋转直至完全切穿颅骨。需频繁检查环钻进展，避免钻入过深导致硬脑膜破裂。当环钻周围颅骨变薄、骨瓣轻压时有松动感即表示完成。将牙科工具平行于颅骨表面插入骨瓣下方，撬起并移除骨瓣。使用镊子将骨片从颅骨上分离。若出现少量出血但未损伤硬脑膜，可用棉签施加压力止血，并防止骨屑污染硬脑膜。然而，若硬脑膜发生破裂并可见脑组织膨出，则应通过人道安乐死方式终止该动物的实验。此步骤需充分练习以掌握必要的手术技能。
11. 使用镊子将损伤连接头稳定置于颅骨开窗处，确保其倾斜方向与颅骨曲率一致（即连接头较长边缘靠近颅骨外侧嵴）。同时，使用经刀片斜切制成尖端的木棒，用另一只手在连接头外缘涂抹瞬间胶凝胶，并固定连接头直至其垂直牢固地粘附于骨窗上方。必须注意避免胶水接触硬脑膜表面，否则会导致损伤效应减弱。
12. 使用小纸杯混合甲基丙烯酸甲酯牙科丙烯酸树脂（Jet Acrylic Liquid 与 Perm Reline/Repair Resin，Butler Schein），配制成粘稠溶液。使用1 cc无针注射器将骨水泥均匀涂布于损伤连接头周围。骨水泥应覆盖连接头底部2 mm部分以及周围暴露的颅骨表面。需用骨水泥密封颅骨缝，以确保损伤产生的液体脉冲保留在颅腔内。
13. 使用注射器和钝针向连接头内注入无菌0.9% NaCl（生理盐水）。生理盐水可在恢复期间保持硬脑膜湿润。此外，若连接头无法维持充满状态，则提示连接处存在泄漏，应更换新的连接头。给予小鼠腹腔注射0.25 ml无菌生理盐水，将其从立体定位仪上取下，放入无金属网盖的空笼中，并置于加热板上。在笼底放置适量水凝胶，让小鼠恢复1–2小时。

2. 损伤诱导

1. 打开示波器（Tektronix TDS 1001B，双通道数字存储示波器，40 mHz，500Ms.s）以及连接至LFP装置的放大器（Trauma Inducer Pressure Transducer Amplifier）。确认LFP装置（由弗吉尼亚联邦大学定制设计与制造）及其连接的高压管路（长度41 cm，体积2 ml，Baxter #2C5643）已充满无菌水且无气泡。管路末端为雄性鲁尔锁接头。在关闭管路鲁尔锁端的情况下，通过释放摆锤传递测试脉冲。应先传递约10次测试脉冲以对装置进行预处理。确认摆锤在示波器和放大器上产生平滑信号。若信号存在噪声，则表明系统内有空气，必须在施加损伤脉冲前将其排除。脉冲持续时间应约为20毫秒。LFP装置配套的传感器放大器已校准为10 mV = 1.0磅每平方英寸（PSI）。1个大气压（ATM）= 14.7 PSI。通常施加的损伤压力范围为0.9 - 2.1个大气压，以产生不同范围的翻正反射时间，并伴随因肺水肿导致的渐进性死亡率。轻度损伤定义为翻正反射时间为2 - 4分钟，死亡率为0 - 5%；中度损伤定义为翻正反射时间为6 - 10分钟，死亡率为10 - 20%。如有必要，可调节摆锤角度以增加或减小脉冲强度。摆锤起始位置的角度约为10度。调整LFP装置后，务必打开管路的鲁尔锁端。
2. 将小鼠放入预充4-5%异氟烷的麻醉舱中，直至达到外科麻醉深度。将小鼠置于LFP装置旁的平台上，并将套管内充满无菌生理盐水。将LFP装置带有雄性鲁尔锁的管路连接至套管的雌性鲁尔锁接口。将动物侧卧放置，待其呼吸恢复正常但尚未完全清醒前（约2分钟），释放LFP装置的摆锤以产生单次损伤脉冲。必须避免在动物麻醉过深时施加损伤，否则可能导致呼吸衰竭和死亡。应准确记录脉冲的实际压力。假手术对照组动物接受所有相同操作，但不施加实际的液体脉冲以诱导损伤。
3. 应立即将动物从LFP装置上取下，并仰卧放置以监测翻正反射时间。当小鼠完成翻正动作后，再次短暂麻醉，并用手将颅骨上的牙科水泥和套管一并移除。随后使用Vetbond组织粘合剂（3M）、缝线或钉合器闭合头皮。记录是否存在硬脑膜疝出或套管堵塞情况。套管堵塞将导致损伤程度减弱且无法准确评估。将动物放回笼中，置于加热垫上直至恢复自主活动，然后送回原饲养笼。

3. 运动、认知及组织学结果的评估

1. 可通过转棒实验评估LFP引起的运动功能缺陷，该实验是前庭运动和感觉运动功能整合的指标²¹。所有动物在损伤前均需进行测试，以确定基线值并使小鼠适应实验范式。在损伤前两天，每天训练小鼠使用转棒装置3次，每次间隔1小时。测量小鼠在直径为36 mm、表面覆有橡胶的旋转棒上保持平衡的潜伏期。转棒转速在180秒内从4 rpm匀速增加至40 rpm。每次试验以动物从转棒上跌落为结束。
2. 在损伤后的不同时间点（通常为1、7和21天），再次使用转棒装置对小鼠进行测试。损伤后转棒实验的评估基于个体得分与其基线潜伏期的相对变化²²。将损伤小鼠的平均跌落潜伏期与假手术小鼠进行比较。
3. 可在另一组小鼠中使用莫里斯水迷宫（MWM）检测LFP后的认知功能，该方法是评估啮齿类动物创伤后空间学习和工作记忆的敏感指标²³。在损伤前4天，通过可见平台实验使小鼠适应实验范式并测定基线反应。使用一个白色圆形水池（直径1 m），其中盛水并加入无毒白色颜料。平台通过旗帜或标记物使其可见，池壁周围不设置视觉线索。在4次试验中，将小鼠放置于与可见平台相对的象限，记录其找到平台的潜伏期。每次试验最长持续60秒，试验结束时小鼠停留在平台上或被放置于平台上15秒。试验间间隔5分钟，在此期间将小鼠置于加热垫上保温。每次试验中平台位置更换至不同象限，共进行4次试验。
4. 为评估学习能力，在损伤后不同时间点（通常为1、7和21天），使用隐藏平台固定的MWM对小鼠进行训练，平台固定于4个象限之一。在池壁周围设置黑白视觉线索。训练过程中，小鼠起始象限采用伪随机方式变化，记录其找到平台所需时间。每次试验最长持续60秒，试验结束后小鼠停留在平台上或被放置于平台上15秒，并在试验间歇保温5分钟。小鼠每天接受8次试验，连续进行3天。为评估记忆保持能力，在最后一次训练的次日进行一次持续60秒的探查试验。探查试验中移除平台，记录小鼠在原平台所在象限停留的时间和游泳距离。最后进行可见平台测试，以排除损伤后可能出现的运动或视觉功能障碍。
5. 为确定LFP损伤的组织学后果，在损伤后特定时间点通过心脏灌注固定组织，先灌注0.9% NaCl，随后灌注4%多聚甲醛。组织在4°C下后固定过夜，然后依次置于10%和30%蔗糖及包埋液中进行冷冻保护。使用冷冻切片机切割冷冻连续切片，并采用多种免疫组织化学和组织学技术进行处理。

4. 代表性结果：

LFP装置诱导的损伤在动物之间具有可重复性，尤其是在具备充分手术训练的情况下。为保持损伤的一致性，需监测装置传递至硬脑膜的压力大小。摆锤撞击一个充满水的丙烯酸圆柱体，该圆柱体通过高压管路和鲁尔锁紧接头连接至固定在动物颅骨开窗部位的损伤接口(图1A)。对于轻度至中度损伤，摆锤的角度设定为产生0.9–2.1 atm的压力，同时使用连接放大器的示波器来观察压力脉冲波形(图1B)。损伤可导致翻正反射时间出现不同程度延长，并伴随与肺水肿相关的死亡率升高。轻度损伤定义为翻正反射时间为2–4分钟，死亡率为0–5%；中度损伤定义为翻正反射时间为6–10分钟，死亡率为10–20%。此外，接受LFP处理的小鼠可能出现强直性姿势，提示可能存在癫痫发作。癫痫发作常与硬脑膜受损有关。上述结果共同表明，该损伤可导致神经系统损害。假手术动物虽连接至LFP装置，但不释放摆锤。

为了观察LFP所诱导的损伤，我们使用了可识别星形胶质细胞和巨噬细胞的抗体进行免疫细胞化学染色，这两种细胞均与损伤反应相关。胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）染色显示，在损伤区域的皮层中胶质增生明显增加，而假手术组小鼠在颅骨切除下方相应部位未出现星形胶质细胞增多现象（图2A、B）。同样，MAC1染色表明，与接受假手术的小鼠相比，LFP处理小鼠在损伤部位周围存在更多的巨噬细胞。此外，在接受LFP处理的小鼠中，常可观察到皮层组织的物理性损伤，而在假手术小鼠中则无此现象（图2C、D）。

轻度局灶性挫伤（LFP）后的行为学测试可用于评估认知和运动功能。Morris水迷宫（MWM）用于检测学习和记忆能力。利用测试房间内的视觉线索，假手术组小鼠在水迷宫训练中随着每天训练的进行，迅速提高了定位平台的效率。与假手术组小鼠相比，接受轻度LFP的小鼠在测试的前两天定位隐藏平台所需时间更长，但在第三天似乎已学会该任务（图3A）。这些结果表明，损伤降低了小鼠获取空间学习能力的速度。为评估损伤对记忆保持的影响，在最后一次训练结束后1天进行探针试验。假手术组小鼠在目标象限停留的时间长于接受轻度LFP的小鼠，提示损伤影响了小鼠回忆平台原先位置的能力（图3B）。为评估运动功能，采用转棒仪对小鼠进行测试。与假手术组小鼠相比，接受轻度LFP的小鼠在伤后1、7和21天（dpi）的平均跌落潜伏期更短（图3C）。这些数据表明，损伤小鼠的前庭运动和感觉运动整合功能受损。

图 1. LFP 装置及损伤过程中示波器获得的代表性波形。A) LFP 装置的组成部分包括：固定在支架上并设定为特定角度以施加所需力的摆锤、装有水的丙烯酸圆筒并连接高压管和雄性鲁尔锁接头、放大器和示波器。B) 示波器记录的压力脉冲代表性波形。峰峰值为 2.16 伏，对应压力为 1.47 个大气压。

图 2. 侧向液体脉冲损伤（LFP）后胶质增生和炎症反应增强，表明损伤程度。取假手术（A, C）或LFP损伤（B, D）后7天（dpi）小鼠脑组织的冷冻横切面（20μm）。皮层图像位于颅骨切除术中心位置。（A, B）使用抗体标记星形胶质细胞。胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）抗体（MAB360, Chemicon, 1:400）显示，与假手术组相比，LFP损伤组小鼠皮层中星形胶质细胞数量明显增多（箭头所示）。二抗为山羊抗小鼠594（1:1000）。（C, D）使用抗体标记巨噬细胞。MAC1抗体（MAC1-α链CD11b, BD Biosciences, 1:50）显示，与假手术组相比，LFP损伤组皮层损伤部位周围存在更多的巨噬细胞和/或活化的小胶质细胞（箭头所示）。二抗为山羊抗大鼠CY3（1:50）。比例尺：A和B中为200μm，C和D中为100μm。

图3. 轻度LFP损伤后的行为学测试显示，与假手术小鼠相比，损伤小鼠表现出认知功能缺陷。A) 在MWM实验中，接受轻度LFP处理的小鼠学会寻找平台任务所需时间长于假手术小鼠。假手术组 vs LFP组（平均秒数 ± SEM）：第1天 34.21 ± 3.02 vs 38.64 ± 2.63；第2天 24.52 ± 2.84 vs 27.21 ± 2.11；第3天 22.47 ± 2.00 vs 22.08 ± 2.52（1 dpi，n = 9 假手术组，10 LFP组）。B) 在MWM最后一次训练后24小时进行的探针试验中，接受轻度LFP处理的小鼠在目标象限停留的时间短于假手术小鼠（21 dpi，n = 10）。C) 接受轻度LFP处理的小鼠在转棒实验中比假手术小鼠更早跌落（1、7 和 21 dpi，n = 5 假手术组，8 LFP组）。误差线表示标准误（SE）。

讨论

本文介绍的LFP方法模拟了轻度至中度创伤性脑损伤的多种神经病理学和行为学结果，因此已成为广泛应用的TBI动物模型。为了提高该技术的有效性和可靠性，有几个关键步骤需要考虑。例如，只有在颅骨切除过程中硬脑膜完整性未受破坏的动物，才应接受LFP处理并用于研究。此外，如果颅骨切除部位被任何胶水或水泥堵塞，导致硬脑膜下方部分区域未能受到流体压力的作用，则该动物应被排除在研究之外。最后，如果翻正反射时间或死亡率不在预期范围内，该动物也不应纳入研究。可通过增加压力脉冲的强度来产生更严重的损伤。

如图1所示，LFP装置的构型相对简单，通过监测示波器上的压力环境可保持损伤程度的可重复性。示波器轨迹上曲线的平滑形态表明液体中无气泡存在，否则可能干扰LFP损伤的诱导。在诱导损伤前应先施加测试脉冲，若示波器轨迹未呈现平滑曲线，则应排除气泡。脉冲持续时间约为20毫秒，该时间对应于碰撞测试模拟中测得的冲击诱导时间。较短脉冲的损伤更可能产生局灶性损伤。因此，该脉冲持续时间可模拟人类创伤性脑损伤（TBI）。

LFP 后的形态学和细胞变化包括脑组织的物理性损伤，以及星形胶质细胞和巨噬细胞数量的增加，如图 2 所示。已有充分证据表明，损伤的一个典型特征是星形胶质细胞增生并形成胶质瘢痕。研究表明，胶质瘢痕既具有有益作用，也具有不利影响²⁴。同样，已知巨噬细胞在损伤后的修复阶段会在多种组织中聚集²⁵。因此，与假手术对照组相比，LFP 样本中 GFAP 和 MAC1 阳性细胞数量的增加表明损伤已被成功诱导。假手术对照组中这些细胞特异性标志物无表达，说明仅手术操作本身对脑组织健康无不良影响，且蛋白表达的变化特异性地由损伤模型引起。

图3所示的轻度局灶性脑挫伤（LFP）的行为后果包括认知功能障碍和运动功能缺陷。莫里斯水迷宫（MWM）实验结果表明，LFP小鼠最终能够学会该任务，但学习速度较假手术小鼠更慢，且在训练后一天的记忆保持能力也较差。因此，即使轻度损伤的小鼠在利用外部线索处理、巩固和存储空间信息方面也比假手术小鼠效率更低，而这些信息必须在后续测试中被成功提取。其他依赖海马的认知任务（如条件性恐惧反应）也已被证明在经历LFP的小鼠中出现损伤²⁶。最后，在轻度损伤后长达3周内，LFP小鼠在转棒实验中较假手术小鼠更早跌落，表明其前庭运动和感觉运动整合功能存在缺陷。更中等程度的损伤会导致更为显著的认知和运动功能改变，这一点已被其他研究团队证实^27-30。

总之，LFP 是一种有效的人类创伤性脑损伤（TBI）模型，因为它满足了许多预期的标准。LFP 具有结构效度，因其能够重现诱导人类 TBI 的病因学过程。具体而言，其所施加的力的强度和导致的死亡率与轻度至中度运动相关和交通事故相关损伤的情况相似，但需注意的是，动物模型中伤前的外科干预是该模型特有的。LFP 同样具有表观效度，因其可重现人类 TBI 中观察到的多种解剖学、生物化学、神经病理学及行为学改变。LFP 后既可检测到局灶性改变，也可检测到弥散性改变，且由于冲击具有侧向定位特点，可比较损伤同侧与对侧的形态学损害。需要注意的一点是，由于仅损伤一个半球，其认知和运动功能的影响可能较为轻微。最后，LFP 具有预测效度，且该技术具有良好的可重复性，因此可在损伤发生前或发生后评估多种药理学和遗传学干预的效果²⁰。为了确定治疗药物的作用机制，需要在有或无试验药物的情况下测量血压、血液 pH 值和血气等生理参数。然而，由于 TBI 的原发性和继发性后果具有高度复杂性，要找到一种能够缓解所有症状的单一干预手段仍是一项艰巨的任务。

未来对LFP技术的一种考虑可能是使用微流体冲击装置，该装置采用微处理器控制、气动驱动的仪器，从而无需校准摆锤传递的力，并避免流体中气泡等操作变量的影响¹⁵。然而，标准的LFP方法已被众多研究人员证实为一种可靠且简便的技术，可用于探索创伤性脑损伤（TBI）后损伤与恢复的分子机制，进而推动更有效的干预措施和治疗方法的发展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<李>小鼠立体定位仪（Kopf Instruments） <李>小鼠气体麻醉头部固定器（Kopf Instruments） <李>麻醉机配备 O2 冲洗（Parkland Scientific） <李>麻醉机配氧气冲洗装置（Parkland Scientific） <李>布托啡诺（Webster Animal Supply）<李>Refresh Lacri Lube 眼用软膏（Fisher）<李>布比卡因/Marcaine（Webster Animal Supply）<李>聚维酮碘溶液（Fisher）<李>20 g 1 ½” 针头（Becton Dickinson）<李>手术刀片（#15）及刀柄（Becton Dickinson） Bulldog夹具（Fine Science Tools） <李>牙科工具或骨刮匙（Fine Science Tools）<李>侧向抓取镊 Dumont #6（Fine Science Tools）<李>外径3 mm的环钻（Research Instrumentation Shop，宾夕法尼亚大学） 实心尼龙绳（直径 1.7 mm，例如割草机割线） <李>超级胶水凝胶<李>Loctite 氰基丙烯酸酯胶水（Loctite 444 Tak Pak）（Henkel 公司）<李>Jet丙烯酸液体（Butler Schein）<李>Perm Reline/Repair 树脂（Butler Schein）<李>存储示波器 TDS 1001B，40 mHz，500MS/s（Tektronix）<李>创伤诱导器压力传感器放大器（定制设计与制作，弗吉尼亚联邦大学）<李>LFP装置（定制设计与制造，弗吉尼亚联邦大学）<李>高压管路，长度41 cm，体积2 ml（Baxter）<李>3M Vetbond 组织粘合剂（Fisher）