人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

摘要

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外 一种能够识别有患1型糖尿病风险个体中免疫失衡的检测方法。

摘要

调节性T细胞（Tregs）是介导对自身抗原免疫耐受的关键因素。此外，它们在感染后免疫应答的调控中也发挥着至关重要的作用。尽管已有诸多努力试图鉴定Tregs特有的表面标志物，但其唯一独特特征仍是抑制效应T细胞增殖和功能的能力。虽然目前明确的是，仅 体外 在评估人类调节性T细胞（Treg）功能时，尽管可以使用多种检测方法，但在进行横断面研究结果评估时会遇到问题，尤其是在需要比较健康个体细胞与自身免疫性疾病患者（如1型糖尿病-T1D）分离细胞的情况下。目前各实验室在所使用的反应性T细胞的数量和类型、刺激的性质与强度、Treg与反应性T细胞的比例，以及所用抗原呈递细胞（APC）的数量和类型方面存在显著差异。 体外 抑制实验。这种变异性使得不同研究之间在评估Treg功能时难以进行比较。Treg研究领域亟需一种标准化的抑制实验方法，能够同时适用于健康个体和自身免疫性疾病患者。我们已开发出一种 体外 抑制试验显示，与存在胰腺β细胞自身免疫破坏的受试者相比，来自健康志愿者的T细胞在刺激过程中表现出极低的实验内变异性。本文主要目的是描述一种 体外 一种可实现不同受试组间比较的人源抑制试验。此外，该试验有望揭示自然调节性T细胞（nTreg）功能的轻微下降，并预测其未来可能的进一步减损，从而识别出可能从预防性免疫调节治疗中获益的个体¹以下，我们将详细描述该操作步骤中的各个环节。我们希望为该技术的标准化作出贡献 体外 用于评估Treg功能的抑制试验。此外，我们提供该试验作为识别免疫失衡早期状态以及T1D潜在功能性生物标志物的工具。

方案

1. 在建立抑制实验之前，需用抗人CD3抗体（克隆号UCHT1，终浓度 1μg/ml用于细胞刺激，随后通过建立实验检测磁珠是否被有效包被 体外 使用人T细胞的增殖实验

1. 从原瓶中取出1 ml M-450 甲苯磺酰活化珠，置于磁力架上，静置直至所有珠子吸附至管壁一侧。保持管子在磁力架上，吸除缓冲液。将管子从磁力架上取下，加入1 ml 缓冲液1，再次将管子放入磁力架，待珠子吸附后，在管子仍处于磁力架中时吸除缓冲液1；用1 ml 缓冲液1重悬珠子，然后加入 40μl 抗人CD3，振荡处理 37°C 15分钟时，加入0.1%（w/v）BSA，继续振荡16小时。
2. 用缓冲液2洗涤珠子，每次5分钟，共洗两次，温度为2-8°C 并在缓冲液3中于2-8℃下孵育5分钟8°C 使用磁力架，操作如上所述；弃去缓冲液，将磁珠重悬于1 ml缓冲液2中；磁珠数量为4×10⁸⁸/ml 终浓度，可直接使用。
3. 在96孔板中，每孔分别加入50,000和25,000个PBMC，设三个复孔，并加入不同数量的CD3包被磁珠（4×10⁸beads/ml，CD3 1μg/ml，例如每个细胞1、2、3、4、5个磁珠），以确定每个细胞的最佳磁珠数量。培养72小时后，加入 1μCi [³H] 胸腺嘧啶脱氧核苷并继续在 37°C 继续培养16小时。使用Multiscreen收获板（Millipore）收集细胞，加入闪烁液，用Top Count NX....

讨论

由于抑制功能是调节性T细胞（Tregs）唯一的独特特征，因此应在同一研究及不同研究中，对疾病发展不同阶段的受试者之间可靠且一致地检测该功能。我们提供了本实验室建立的抑制实验的详细信息，以推动该实验方法的标准化。在我们 extensive 的优化研究中，我们确定使用抗人CD3包被的微珠（UCHT1克隆，浓度为1μg/ml，而非商业产品常用的5μg/ml）联合外周血单个核细胞（PBMC）作为抗原呈递细胞（APC），可提供一种天然刺激方式，有效激活受试者中的反应性T细胞和调节性T细胞¹。抗人CD3抗体的选择至关重要，因为在我们的实验中，仅Ancell公司的抗体获得了预期结果。单独使用抗人CD3与抗人CD28联合刺激不足以检测出不同受试组之间的差异（结果未显示），而PBMC可提供完整的共刺激信号谱，从而提高信号转导的可能性并实现高效刺激。

本方案既可用于白细胞浓缩物，也可用于患者血液。唯一的区别在于PBMC分离过程中需要加在Ficoll-Paque PLUS上方的血量。本实验所用培养基含有10%混合人AB型血清，我们发现该成分对实验具有显著促进作用。然而，在使用前必须.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
菲可-帕克 PLUS	Amersham	17-1440-03
DPBS-1X	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
台盼蓝	Invitrogen	15250-061
抗 CD4 磁珠	Miltenyi Biotec	130-045-101
预分离滤器	Miltenyi Biotec	130-041-407
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
EDTA	Invitrogen	15575-020
BSA	Sigma-Aldrich	B4287
抗人 CD4-APCCy7（克隆 RPA-T4）	BD Biosciences	557852
抗人 CD25-PE（克隆 M-A251；IL-2Rα）	BD Biosciences	555432
抗人 CD8-FITC（克隆 RPA-T8）	BD Biosciences	555366
抗人 CD14-FITC（克隆 M5E2；LPS 受体）	BD Biosciences	555397
抗人 CD32-FITC（克隆 FLI8.26；FcγR II 型）	BD Biosciences	555448
抗人 CD116-FITC（克隆 M5D12；GM-CSFRα 链）	BD Biosciences	554532
Dynalbeads M-450 甲苯磺酰化磁珠	Invitrogen	140-13
抗人 CD3	Ancell	144-024
缓冲液1	自制		0.1M Na2B4O7 pH7.6
缓冲液2	自制		PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
缓冲液3	自制		0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
完全 RPMI 培养基	自制		RPMI 1640 培养基 2 mM L-谷氨酰胺 5 mM HEPES 100 U/μg/ml 青霉素/链霉素 0.5 mM 丙酮酸钠
[3H] 胸苷	PerkinElmer, Inc.	NET027Z005MC
人混合 AB 血清	Atlanta Biologicals	S40110
多孔收获板	EMD Millipore	MAHFC1H60
Microscint 20	PerkinElmer, Inc.	6013621