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方法文章

人类 体外 抑制作为识别免疫失衡早期状态的筛选工具

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DOI：

10.3791/3071

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2011年7月22日

 ,  , 
1Department of Pediatrics/Allergy, Medical College of Wisconsin , 2Flow Cytometry Core Facility, Medical College of Wisconsin , 3Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetes and Human Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin

本文内容

摘要

Tregs 是免疫系统的强效抑制细胞。由于缺乏定义 Tregs 的特异性表面标志物，因此对 Tregs 的定义主要基于其功能。本文描述了一种优化的 体外 一种能够识别有患1型糖尿病风险个体中免疫失衡的检测方法。

摘要

调节性T细胞（Tregs）是介导对自身抗原免疫耐受的关键因素。此外，它们在感染后免疫应答的调控中也发挥着至关重要的作用。尽管已有诸多努力试图鉴定Tregs特有的表面标志物，但其唯一独特特征仍是抑制效应T细胞增殖和功能的能力。虽然目前明确的是，仅 体外 在评估人类调节性T细胞（Treg）功能时，尽管可以使用多种检测方法，但在进行横断面研究结果评估时会遇到问题，尤其是在需要比较健康个体细胞与自身免疫性疾病患者（如1型糖尿病-T1D）分离细胞的情况下。目前各实验室在所使用的反应性T细胞的数量和类型、刺激的性质与强度、Treg与反应性T细胞的比例，以及所用抗原呈递细胞（APC）的数量和类型方面存在显著差异。 体外 抑制实验。这种变异性使得不同研究之间在评估Treg功能时难以进行比较。Treg研究领域亟需一种标准化的抑制实验方法，能够同时适用于健康个体和自身免疫性疾病患者。我们已开发出一种 体外 抑制试验显示，与存在胰腺β细胞自身免疫破坏的受试者相比，来自健康志愿者的T细胞在刺激过程中表现出极低的实验内变异性。本文主要目的是描述一种 体外 一种可实现不同受试组间比较的人源抑制试验。此外，该试验有望揭示自然调节性T细胞（nTreg）功能的轻微下降，并预测其未来可能的进一步减损，从而识别出可能从预防性免疫调节治疗中获益的个体1以下，我们将详细描述该操作步骤中的各个环节。我们希望为该技术的标准化作出贡献 体外 用于评估Treg功能的抑制试验。此外，我们提供该试验作为识别免疫失衡早期状态以及T1D潜在功能性生物标志物的工具。

方案

1. 在建立抑制实验之前，需用抗人CD3抗体（克隆号UCHT1，终浓度 1μg/ml用于细胞刺激，随后通过建立实验检测磁珠是否被有效包被 体外 使用人T细胞的增殖实验

  1. 从原瓶中取出1 ml M-450 甲苯磺酰活化珠，置于磁力架上，静置直至所有珠子吸附至管壁一侧。保持管子在磁力架上，吸除缓冲液。将管子从磁力架上取下，加入1 ml 缓冲液1，再次将管子放入磁力架，待珠子吸附后，在管子仍处于磁力架中时吸除缓冲液1；用1 ml 缓冲液1重悬珠子，然后加入 40μl 抗人CD3，振荡处理 37°C 15分钟时，加入0.1%（w/v）BSA，继续振荡16小时。
  2. 用缓冲液2洗涤珠子，每次5分钟，共洗两次，温度为2-8°C 并在缓冲液3中于2-8℃下孵育5分钟8°C 使用磁力架，操作如上所述；弃去缓冲液，将磁珠重悬于1 ml缓冲液2中；磁珠数量为4×10⁸8/ml 终浓度，可直接使用。
  3. 在96孔板中，每孔分别加入50,000和25,000个PBMC，设三个复孔，并加入不同数量的CD3包被磁珠（4×108beads/ml，CD3 1μg/ml，例如每个细胞1、2、3、4、5个磁珠），以确定每个细胞的最佳磁珠数量。培养72小时后，加入 1μCi [3H] 胸腺嘧啶脱氧核苷并继续在 37°C 继续培养16小时。使用Multiscreen收获板（Millipore）收集细胞，加入闪烁液，用Top Count NXT（Packard, CT）检测每孔每分钟计数（cpm）。当cpm值高于5000但低于15000时，采用微珠与细胞的比例（beads/cell ratio），以避免调节性T细胞（Tregs）过度刺激而丧失抑制功能。通常，每细胞3个微珠的比例可有效刺激迄今测试的所有受试组中的反应性T细胞和Treg细胞。1-4.

2. 从健康供体的全血、人白细胞浓缩液或通常来自健康志愿者并可从当地血液中心免费获得的血沉棕黄层（BC）中分离外周血单个核细胞（PBMC）（图1）

  1. 用 PBS 将 BC（约 50 ml）按 1:6 比例稀释（加入 250 ml），总体积现为 300 ml。将 25 ml 稀释后的 BC 缓慢地加至已装有 15 ml Ficoll-Paque PLUS 的 50 ml Falcon 管上层，注意不要搅动液层。在 4°C 条件下，以 800×g（Sorvall 离心机配 SH-3000 摇桶转子，转速 1400 rpm）离心 30 分钟，关闭刹车。
  2. 小心收集 PBMC 层（中间相），转移至新的 50 ml Falcon 管中。用 DPBS 将管内液体补至 50 ml 以洗涤 PBMC。将 2 个细胞沉淀合并至同一管中。在 4°C 条件下，以 400×g 离心 10 分钟。重复洗涤步骤两次，每次均将 2 个细胞沉淀合并至同一管中。最后将所有细胞沉淀合并至一个 50 ml 管中。
  3. 使用台盼蓝排斥法计数 PBMC。取 20 μl PBMC 与 180 μl 台盼蓝染液混合，制备成 1:10 稀释液，充分混匀后立即取 20 μl 加入血细胞计数板进行计数。计数位于两个大方格（每个大方格含 16 个小方格）内的所有未染色细胞及仅被染成蓝色的细胞数量。取两个大方格计数结果的平均值，乘以 10。再将该数值除以 100，得到每毫升 PBMC 的数量。细胞活力百分比计算公式为：[1－（蓝色细胞数 / 总细胞数）×100]。若细胞活力 ≥95%，则继续后续实验。

3. CD4 T细胞的MACS预分选

  1. 操作前，将1ml PBMC转移至新离心管中，加入4ml培养基，用于准备接受5000rad照射的细胞——这些细胞将作为抗原呈递细胞（APC）。
  2. 将剩余细胞在含PBS/2mM EDTA/0.5%BSA的缓冲液中以250×g离心10分钟（4°C）。弃去上清液，用4ml PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液重悬细胞。
  3. 加入200μl MACS抗CD4微珠，4°C孵育20分钟。
  4. 加入40ml PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液洗涤，250×g离心10分钟（4°C）。弃去上清液，用8ml脱气、室温的PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液重悬细胞。
  5. 在上样至LS柱前，使用预分离滤器过滤细胞悬液。
  6. 将细胞悬液分装，每份4ml加至已校准的LS柱（柱内预先加入3ml脱气的PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液）。LS柱固定于MidiMACS分选器中。在细胞悬液完全流尽前，可选择将穿流液重新上样，或加入3ml脱气室温PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液并使其流过柱体。继续添加缓冲液直至流出液澄清。
  7. 用移液器将5ml脱气缓冲液加入LS柱，从MidiMACS分选器上取下LS柱，放入新的无菌15ml收集管中，让约1.0ml液体自然流出。将推杆插入柱中，缓慢将剩余液体全部推出。
  8. 对两个LS柱进行相同操作，并合并所得的两份CD4+细胞组分。加入PBS至总体积达50ml，计数细胞。预期产量可达5×108个细胞。以400×g离心10分钟，充分重悬于2ml PBS/2mM EDTA/0.5%BSA缓冲液中。

4. 荧光激活细胞分选（FACS）分离（图2）

  1. 配制针对以下细胞表面标志物的CD标志物抗体混合液（避光保存）：20 μl 抗人CD8-FITC（克隆号RPA-T8）、20 μl 抗人CD14-FITC（克隆号M5E2；LPS受体）、20 μl 抗人CD32-FITC（克隆号FLI8.26；FcγR-II型）和6 μl 抗人CD116-FITC（克隆号M5D12；GM-CSFRα链），可选择性地额外加入40 μl 抗人CD4-APCCy7（克隆号RPA-T4）。
  2. 从2 ml细胞悬液中取出5 μl，加入2 μl染色混合液进行染色，作为确定阈值的对照管（荧光染料减一对照，FMO）5。
  3. 向染色混合液中加入50 μl 抗人CD25-PE（克隆号M-A251；IL-2Rα），混匀后加入细胞悬液中，4°C孵育30分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞，400×g离心10分钟，重悬细胞至浓度为107/ml。
  4. 准备未染色的细胞以及用单一荧光染料染色的细胞或微珠，作为在FACS Aria（BD Biosciences，San Jose，NJ）上进行细胞分选时的补偿对照。
  5. 检测FMO管中的细胞，用于设定CD25+ T细胞分选的阈值（图2a）。在图中设定门控圈选FITC阴性细胞，以排除表达FITC的单核细胞、巨噬细胞及其他CD4+非T细胞（图2b）。
  6. 在另一图中，分别圈选CD25-、CD25low和CD25high T细胞——调节性T细胞（Tregs，指表达CD25水平最高的前1%细胞）（图2c）。这些细胞亚群通常具有较高的纯度（图2d、2e和2f）。
  7. 将收集管中的细胞以400×g离心10分钟，离心后置于冰上保存，直至进行铺板操作。

5. 在96孔板中建立细胞培养（方案见表1），每孔200μl

  1. 在U型底96孔板中，将50μl CD3包被的磁珠（1 μg/ml，按每3个磁珠对应1个反应细胞计算）用含10%混合人AB血清的完全培养基重悬。例如，配制2ml含CD3包被磁珠的培养基时，取7.5μl磁珠原液（终浓度为4×108/ml），加入2ml培养基中；每50μl含75,000个磁珠，即每细胞3个磁珠。
  2. 将照射处理的抗原呈递细胞（APC）稀释至细胞浓度为5×105/ml，每孔加入50μl（含2.5×104个细胞），加入至已预先添加刺激物的各孔中，包括表1中标记为“仅Treg”、“仅APC”和“仅培养基”的孔。
  3. 按照表1的设计，每孔加入2.5×104个CD4CD25-或CD4CD25low T细胞，每个样本设三个复孔。
  4. 将调节性T细胞（Tregs）以1:10的比例（即2,500个Treg细胞）加入共培养孔（表1中B行）以及标记为“仅Treg”的孔中，将培养板置于37°C、含5% CO2、饱和湿度的CO2培养箱中孵育72小时。
  5. 每孔加入1μCi [3H]胸腺嘧啶核苷进行脉冲标记，继续在37°C孵育16小时。

6. 收获与计数

  1. 使用Packard FilterMate细胞收集器或替代系统，在多孔滤膜收集板上收集细胞。
  2. 加入闪烁液（Microscint 20），并用透明塑料盖覆盖收集板，以准备进行最后一步。
  3. 使用Top Count NXT（Packard, CT）或替代系统读取每孔每分钟计数（cpm）。

7. 计算抑制百分比

  1. 由于细胞以三复孔培养，因此针对每种条件计算平均值。若变异系数为 >30% 时，剔除该离群值，仅取两个孔的 cpm 值求平均。抑制率通过公式 [(s-c)/s] × 100% 计算，其中 s 为单独培养时的 cpm 值，c 为共培养时的 cpm 值。
  2. 初始型（CD25-）和 体内 活化的（CD25low）效应T细胞作为反应T细胞接种，通过检测调节性T细胞（Tregs）对这些亚群抑制能力的差异，并基于“活化细胞更难被抑制”的假设，将其作为潜在的功能性预后指标。

8. 代表性结果：

所采用方法及所得结果存在较大差异 体外 人类抑制实验促使我们对影响该实验的各种条件进行了全面研究1我们开发了一种检测方法，不仅能够检测Treg的功能，还能评估其纯度，该方法基于我们先前确定的Tregs与Teffs之间的较低比例（1:10）6此外，Treg细胞在有效抑制初始T细胞和 体内-激活的T细胞，即使在健康受试者中也是如此，如图3及我们先前的研究所示2,4，当免疫平衡受损时，这一现象会更加明显，例如在有发展为1型糖尿病（T1D）风险的个体中。该检测方法在研究中表现良好，我们借此比较了天然性（nTregs）、诱导性（iTregs）和 体外 扩增的天然调节性T细胞（nTregs），从而能够比较健康对照组、新发（RO）1型糖尿病（T1D）和长期（LS）T1D受试者之间这些细胞的功能。我们得出结论：与长期T1D和健康对照组受试者相比，新发T1D受试者在生成具有功能性的诱导型调节性T细胞（iTregs）和扩增的天然调节性T细胞（nTregs）方面能力更强。7因此，该检测可作为识别免疫失衡早期和晚期状态的优良工具。

方案1 参与步骤的示意图 体外 抑制实验

细胞分选工作流程：包被磁珠、PBMC分离、磁珠分选（MACS）、流式分选（FACS）、体外培养、细胞计数。
图1. 步骤 体外 抑制实验以照片形式展示

流式细胞术图谱；基于CD25表达分析的细胞分选；FSC-A 与 PE-A 散点图。
图2. FACS细胞分离中的设门策略。a) 根据荧光减一对照（FMO）设定CD25+阈值，b) 将细胞设门为FITC阴性，c) 对FITC阴性细胞进一步设门并分选为CD+CD25-、CD+CD25low和CD+CD25high（调节性T细胞，Tregs），图中显示各群百分比，d) 分选后经FACS分选的Tregs细胞，e) 分选后经FACS分选的CD+CD25low细胞，f) 分选后经FACS分选的CD4+CD25- T细胞

CD4+ T细胞抑制数据；柱状图；CD25亚群比较；免疫学研究结果
图3. 健康受试者的代表性结果 a) 健康受试者每分钟计数（cpm）的代表性结果，以所有涉及细胞亚群的单独培养形式呈现，包括初始型CD25-细胞、体内活化的CD25low细胞、抗原呈递细胞（APC）和调节性T细胞（Treg），以及反应性T细胞（CD25- 或 CD25low）与Treg的共培养体系。b) 显示健康对照组受试者（n=4）中自体Treg对CD25-和CD25low反应性T细胞的抑制百分比。抑制率计算公式为[(s-c)/s] × 100%，其中s为单独培养的cpm值，c为共培养的cpm值。尽管观察到Treg对反应性T细胞的抑制能力存在轻微差异，但无统计学意义（配对t检验，p=0.08）。c) 显示高风险受试者各单独培养体系的cpm值，包括以CD25-和CD25low细胞作为反应性T细胞，以及APC和Treg，并包括将每种反应性T细胞亚群与Treg共同培养的体系（CD25-/Treg 和 CD25low/Treg）。d) 显示高风险受试者（n=4）中自体Treg对CD25-和CD25low反应性T细胞的抑制百分比。Treg对CD25-与CD25low反应性T细胞的抑制能力差异具有统计学意义（配对t检验，p=0.04）。

表1. 示意图设置 体外 抑制实验

 1-34-67-910-12
ACD4CD25-CD4CD25low仅培养基仅培养基
BCD4CD25- /TregsCD4CD25low /Tregs仅Tregs仅APC
C    
D    
E    
F    
G    
H    

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讨论

由于抑制功能是调节性T细胞（Tregs）唯一的独特特征，因此应在同一研究及不同研究中，对疾病发展不同阶段的受试者之间可靠且一致地检测该功能。我们提供了本实验室建立的抑制实验的详细信息，以推动该实验方法的标准化。在我们 extensive 的优化研究中，我们确定使用抗人CD3包被的微珠（UCHT1克隆，浓度为1μg/ml，而非商业产品常用的5μg/ml）联合外周血单个核细胞（PBMC）作为抗原呈递细胞（APC），可提供一种天然刺激方式，有效激活受试者中的反应性T细胞和调节性T细胞1。抗人CD3抗体的选择至关重要，因为在我们的实验中，仅Ancell公司的抗体获得了预期结果。单独使用抗人CD3与抗人CD28联合刺激不足以检测出不同受试组之间的差异（结果未显示），而PBMC可提供完整的共刺激信号谱，从而提高信号转导的可能性并实现高效刺激。

本方案既可用于白细胞浓缩物，也可用于患者血液。唯一的区别在于PBMC分离过程中需要加在Ficoll-Paque PLUS上方的血量。本实验所用培养基含有10%混合人AB型血清，我们发现该成分对实验具有显著促进作用。然而，在使用前必须...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究由威斯康星医学院麦克斯·麦吉青少年糖尿病国家研究中心和威斯康星儿童研究所资助。资助方在研究设计、数据收集与分析，以及稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
菲可-帕克 PLUSAmersham17-1440-03
DPBS-1XGIBCO, by Life Technologies14190-144
台盼蓝Invitrogen15250-061
抗 CD4 磁珠Miltenyi Biotec130-045-101
预分离滤器Miltenyi Biotec130-041-407
LS 柱Miltenyi Biotec130-042-401
EDTAInvitrogen15575-020
BSASigma-AldrichB4287
抗人 CD4-APCCy7（克隆 RPA-T4）BD Biosciences557852
抗人 CD25-PE（克隆 M-A251；IL-2Rα）BD Biosciences555432
抗人 CD8-FITC（克隆 RPA-T8）BD Biosciences555366
抗人 CD14-FITC（克隆 M5E2；LPS 受体）BD Biosciences555397
抗人 CD32-FITC（克隆 FLI8.26；FcγR II 型）BD Biosciences555448
抗人 CD116-FITC（克隆 M5D12；GM-CSFRα 链）BD Biosciences554532
Dynalbeads M-450 甲苯磺酰化磁珠Invitrogen140-13
抗人 CD3Ancell144-024
缓冲液1自制0.1M Na2B4O7 pH7.6
缓冲液2自制PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4
缓冲液3自制0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5
完全 RPMI 培养基自制RPMI 1640 培养基 2 mM L-谷氨酰胺 5 mM HEPES 100 U/μg/ml 青霉素/链霉素 0.5 mM 丙酮酸钠
[3H] 胸苷PerkinElmer, Inc.NET027Z005MC
人混合 AB 血清Atlanta BiologicalsS40110
多孔收获板EMD MilliporeMAHFC1H60
Microscint 20PerkinElmer, Inc.6013621

参考文献

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