本文描述了一种制备由I型胶原和原代人成纤维细胞组成的三维基质的方法。这种类器官凝胶能够模拟组织间质的基本特征，适用于多种显微镜观察，因此是评估细胞侵袭性迁移的有用基质。
本文内容
摘要
摘要
细胞迁移在生物学的许多方面具有基础性作用，包括发育、伤口愈合、免疫系统的细胞反应以及肿瘤细胞的转移。为了便于通过光学显微镜研究细胞动态，细胞迁移通常在玻璃盖玻片上进行研究。然而，越来越多的研究表明，细胞迁移的许多特征依赖于局部微环境的特性，例如其弹性、蛋白质组成和孔径大小，而这些特性无法通过玻璃或塑料等刚性二维基质得到真实再现1。此外，与其他细胞类型（包括基质成纤维细胞2和免疫细胞3）的相互作用已被证明在促进癌细胞侵袭过程中发挥关键作用。在分子水平上的研究 increasingly 表明，相同细胞在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下对药物处理等分子动态的响应存在显著差异4。
理想情况下，最好在活体生物的自然环境中研究细胞迁移，但这并不总是可行的。因此，中间组织培养系统（如细胞来源基质、Matrigel、类器官培养（本文所述）、组织外植体、类器官和异种移植）是重要的实验中间模型。这些系统能够模拟某些体内环境的特征，同时更便于进行实验操作，例如使用稳定转染的细胞系、药物处理方案、长期和高分辨率成像。这类中间系统特别适用于验证探针的有效性，并在开展体内5成像之前确定细胞动态响应及荧光报告分子成像所需的参数。因此，它们在减少对活体动物实验的需求方面具有重要作用。
方案
1. 从皮肤外植体建立成纤维细胞培养
- 从人体前臂获取的4 mm穿刺活检组织置于MEM培养基中，该培养基添加100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和0.25 μg/ml两性霉素B（Fungizone）。
- 去除任何皮下脂肪，并通过在培养皿底部来回 rocking 24号手术刀片将活检组织切成细小碎片。
- 将组织匀浆放入25 cm2组织培养瓶中，加入原代成纤维细胞生长培养基（MEM培养基补充10%胎牛血清、100单位/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和25 μg/ml两性霉素B），加至培养瓶表面被覆盖但液体深度不足以使组织漂浮为止。
- 在37°C、含5% CO2的湿润环境中孵育3天后，加入3 ml原代成纤维细胞生长培养基。
- 再孵育3天后，更换为新鲜的原代成纤维细胞生长培养基；若细胞接近融合，可按1:4比例传代至新鲜培养基中。（从此步骤开始可省略两性霉素B）。
2. 第一阶段——从大鼠尾部制备I型胶原蛋白
注意：适用于约12-14条青春期大鼠尾巴（新鲜或冷冻）的实验方案
- 用70%乙醇清洗大鼠尾巴，并按以下步骤去除肌腱：
- 用解剖刀从尾部顶端至底部沿中线切开皮肤，然后沿尾部长度方向剥离，去除皮肤。
- 从尾部近端核心区域分离肌腱。
- 使用有齿镊子将肌腱向尾部远端剥离，注意避免损伤鞘膜。
- 将1 g肌腱加入250 ml 0.5 M乙酸中，在4°C下搅拌提取48小时。
- 将提取液在7,500 × g条件下离心30分钟，弃去沉淀。
- 向 supernatant 中加入等体积的10% (w/v) NaCl溶液，搅拌30–60分钟。
- 在10,000 × g条件下离心30分钟，弃去上清液，将沉淀物重新溶解于0.25 M乙酸中（体积比约为1:1），在4°C下搅拌24小时。
- 将胶原溶液置于6–8次更换的6 L约17.5 mM乙酸溶液中透析（每升冷水中加入1 ml冰乙酸，每日更换2次）。
- 将透析后的胶原溶液在30,000 × g条件下离心1.5小时。
- 移除上清液，将沉淀物转移至无菌烧瓶中。
- 在4°C条件下，用0.5 mM乙酸将I型胶原浓度调节至约2 mg/ml。
3. 第二阶段——构建含有包埋成纤维细胞的三维基质（允许收缩8天）。
- 在预冷的容器中，于 4°C 下使用冷的试剂配制混合液。胶原蛋白 I 需保持在冰上。
- 对于一个 T75培养瓶的汇合原代成纤维细胞（约细胞数量 1 × 106），使用以下组分：
- 25 ml 大鼠尾部胶原蛋白（浓度约 2 mg/ml）
- 3 ml 10×MEM
- 0.22 M NaOH：先加入 2 ml，然后在搅拌下逐滴加入，直至胶原液变为橙色，
- 但不可变为粉红色（通常总量不超过 3 ml）。pH 约为 7.2。
- 注意：必须确保培养基/凝胶保持中性或微酸性，因为成纤维细胞在暴露于轻微碱性条件时将无法收缩凝胶。
- 用胰蛋白酶消化成纤维细胞，400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 在上述 5 分钟离心期间：准备 12 个 35 mm 塑料培养皿——通常一个培养瓶的成纤维细胞/胶原混合液可制备 12 个培养皿。
- 将成纤维细胞重悬于 3 ml 胎牛血清（FCS）中，并立即加入胶原混合液中，充分搅拌。
- 尽快将约 2.5 ml 胶原/成纤维细胞混合液接种至每个培养皿中。尽量避免产生气泡及胶原提前凝固。
- 将胶原置于 37°C、含 5% CO2 的湿润空气中孵育 10 分钟，使其凝固。
- 每皿加入 1 ml 成纤维细胞生长培养基（DMEM + 10% FCS）。
- 用移液器将胶原/成纤维细胞基质从培养皿边缘剥离。
- 次日：每皿加入 1 ml 成纤维细胞生长培养基（DMEM + 10% FCS）。
- 每隔一天更换一次培养基。让胶原/成纤维细胞基质收缩约 8 天，直至其可放入 24 孔板中（直径由约 3.5 cm 收缩至 1.5 cm，见图 1）。
注意：胶原蛋白浓度应根据具体应用进行调整。胶原溶液越稀，成纤维细胞对其收缩的速度越快。即使浓度相同，不同批次的胶原蛋白也会导致收缩速率存在轻微差异。同样，不同培养的成纤维细胞对胶原凝胶的收缩速率也各不相同，成纤维细胞数量越多，收缩速率越快。因此，可通过调整胶原蛋白浓度和成纤维细胞密度来调控收缩速率以及胶原凝胶的最终密度。
4. 第二阶段 - 将目标细胞接种至基质上
注意：使用前需用乙醇对所有镊子和设备进行灭菌。
- 使用钝头镊子将收缩的基质轻轻转移至24孔板中，注意避免折叠。
- 将目标细胞重悬于约 4 × 104 /ml 的浓度，取1 ml（胰酶消化后，离心去除胰酶）接种于基质表面。实际所需细胞数量因细胞类型而异。细胞培养基应为目标细胞的常规生长培养基。
- 让细胞在基质表面生长至完全融合，大约需要3–5天。
5. 第三阶段——将基质转移至网格以进行侵袭（约0-21天）
- 将不锈钢网格切割成三脚架形状，并在使用前进行高压灭菌（见图2）。
- 将无菌网格置于6 cm培养皿中，加入培养基至高于网格水平（约10.5 ml）。将基质置于网格上，轻轻吸除培养基，使基质底部与培养基接触但不完全浸没。此状态称为空气/液体界面，可形成促进细胞侵袭的梯度。每两天更换一次培养基（见图2）。
- 在此阶段或更早阶段，可对表达荧光蛋白的活细胞进行具有组织环境背景的成像。收缩态或纤维状的I型胶原可通过二次谐波生成（SHG，见图3）进行成像。结合多光子激发与宽场探测技术，我们发现SHG信号可至少深入基质100 μm，而表达胞质GFP的细胞可被成像至至少200 μm深度。
注意：关于侵袭的定量分析，将基质放置于网格上的当天定义为第0天。将基质置于网格上可形成细胞培养基的浓度梯度，从而促进细胞向基质内侵袭。可在接下来的1至21天（或更长时间）内对样本进行成像，以评估侵袭、增殖、存活或分化等生物学过程（参见参考文献列表）。
6. 第四阶段——固定
- 在 Falcon 管中加入 5 ml 的 4% 多聚甲醛（PFA）。
- 将基质转移至平坦表面，用一把新的洁净解剖刀将基质切成两半（因需对横切面进行染色），用解剖刀挑起基质并转移至 4% PFA 中，过夜固定。
- 此时类器官型基质已准备好，可使用选定的抗体或染料进行染色（见图 3）。
7. 代表性结果：
图1 成纤维细胞收缩的I型胶原蛋白示例。 成纤维细胞与大鼠尾部胶原蛋白混合物从培养皿上脱离后，在6-8天内发生收缩。
图 2 类器官培养实验的进程。A，类器官培养系统的示意图及其实验流程。B，不锈钢无菌网格上形成胶原/成纤维细胞基质的示例，用于建立气液界面。
图3 类器官培养实验的应用。A, B 胰腺导管腺癌（PDAC）非侵袭性和侵袭性细胞随时间在类器官基质中侵袭的情况。C，活体皮肤等效物，显示成纤维细胞收缩的胶原性真皮组分上形成分层的表皮。D，C8161黑色素瘤细胞侵入成纤维细胞收缩的胶原性真皮等效物中。E，侵袭性PDAC细胞（绿色）在类器官基质中与成纤维细胞（红色）相互作用并发生侵袭。F，侵袭性PDAC细胞（绿色）与周围正在降解的细胞外基质（紫色）相互作用，通过基于多光子的二次谐波成像技术进行可视化观察。
讨论
在此，我们介绍一种用于侵袭性细胞迁移研究的三维基质制备方法 6-8基质由I型胶原纤维构成，这些纤维在数天内被原代人表皮成纤维细胞收缩。胶原通过酸提取法而非酶消化法制备，从而保留了多肽末端的反应活性，并在缓冲体系中和后促进胶原纤维交联形成更大的聚集体。 9这会形成一种重组凝胶，其特性更接近于胶原蛋白的特征 体内 并且对在凝胶中培养的细胞的侵袭特性具有重要意义。起始材料是新鲜的还是冷冻的并无影响，但使用青春期大鼠尾巴至关重要，因为年轻动物的胶原交联更为不稳定。因此，来自较年轻动物的I型胶原更容易提取，并且能够以更高的保真度重新构建。
可对胶原蛋白基质进行固定，并使用特异性针对侵袭性肿瘤细胞或基质成纤维细胞的抗体进行染色2,10，该方法在检测可能抑制侵袭的药物疗效方面具有重要应用价值5,6。
尽管本方案建议使用原代人皮肤成纤维细胞，但根据所研究的组织类型，也可使用来自其他组织类型的原代成纤维细胞。此外，还可以使用永生化成纤维细胞建立培养体系，包括稳定转染了荧光蛋白偶联物的细胞。通过这种方法，可对基质细胞和肿瘤细胞进行标记，以观察侵袭过程中细胞间的相互作用11。
披露
我们无任何披露事项。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x MEM | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 21430 | - |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 367176-500G | 用蒸馏水配制 0.22 M 储存液 |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | - |
| 35 mm 培养皿 | Falcon BD | 353001 | 用于步骤 3.4 |
| 60 mm 培养皿 | Falcon BD | 353004 | 用于步骤 5.2 |
| 钝头弹簧镊 | Samco Scientific，Thermo Fisher Scientific | E003/02 | 带齿，非光滑 |
| 16% 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 使用前用 PBS 稀释至 4% |
| cd-1 筛网，40 目 | Sigma-Aldrich | S07707-5EA | 不锈钢筛网，每包 5 个 |
| 透析袋 | Medicell International | 7607 2295 | 12 - 14 kD |
| PBS | Oxford Labware | BR0014G | - |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 242853 | - |
| 24 孔板 | Falcon BD | 353047 | 用于步骤 4.1 |
| 两性霉素 B（Fungizone） | Invitrogen | 15290018 | - |
参考文献
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