基于细胞的钙流检测法利用FlexStation 3对TRP通道功能进行中高通量筛选

摘要

本视频提供了使用 FlexStation 3 研究人源 TRPA1 通道药理学特性的详细实验方案。该方案涵盖了细胞制备、染料加载以及微孔板读板仪 FlexStation 3 操作的各个步骤。

摘要

Molecular Devices 公司的 FlexStation 3 是一台台式多功能微孔板读板仪，能够在多孔板中自动进行荧光检测。该设备非常适合在学术研究环境中开展中高通量筛选。仪器配备了一个集成的液体转移模块，内置多通道移液器，可逐列读取多孔板，以监测多种荧光试剂的荧光变化。例如，FlexStation 3 已被用于通过检测细胞内游离 Ca²⁺ 水平的变化，研究可通透 Ca²⁺ 的离子通道和 G 蛋白偶联受体的功能。瞬时受体电位（TRP）通道是一类庞大的非选择性阳离子通道家族，在多种生理和病理生理过程中发挥重要作用。大多数 TRP 通道可通透钙离子，激活后可引起钙离子内流。在本视频中，我们展示了 FlexStation 3 在研究 TRPA1 通道药理学特性中的应用，TRPA1 是一种对多种有害刺激物敏感的分子感受器。在 96 孔板中培养的、瞬时或稳定表达人源 TRPA1 通道的 HEK293 细胞，被加载 Ca²⁺ 敏感的荧光染料 Fluo-4，利用 FlexStation 3 的 FLEX 模式，在 TRPA1 激动剂作用前后实时测量这些细胞的荧光变化。同时，也检测了潜在 TRPA1 拮抗剂的作用效果。实验数据被导入 SoftMax Pro 软件，用于构建 TRPA1 激动剂和抑制剂的浓度-反应关系曲线。

方案

1. 96孔板中的细胞制备

对于瞬时转染人 TRPA1 cDNA 的 HEK293 细胞

1. 在含4.5 mg/ml葡萄糖的杜尔贝科最低必需培养基（DMEM，Thermo Scientific，SH3002201）中培养HEK293细胞1至2天，培养基中添加10%热灭活胎牛血清（Invitrogen，16000-044）、50单位/ml青霉素和50 μg/ml链霉素（Invitrogen，15140-163）。转染当天，细胞密度应达到70–90%。
2. 用移液器将50 μl聚-L-鸟氨酸（Sigma P3655，20 μg/ml溶于无菌蒸馏水）加入96孔板的每孔中，37°C孵育至少15分钟。用不含Mg²⁺和Ca²⁺的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS，Thermo Scientific，SH3002803）冲洗每孔一次。该板可在细胞培养超净台中放置数小时。
3. 对于96孔板的每一孔，在1.5 ml离心管中将0.2 μg cDNA溶于25 μl OPTI-MEM（Invitrogen，31985-070）中。根据需转染的孔数按比例放大。另取一个1.5 ml离心管，每孔加入0.4 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen，11668-019）溶于25 μl OPTI-MEM中。根据需转染的总孔数按比例放大。
4. 短暂涡旋振荡稀释后的cDNA和Lipofectamine 2000，室温静置约5分钟。
5. 将等体积的稀释后Lipofectamine 2000转移至含有稀释cDNA的离心管中，涡旋混匀，室温静置15分钟至2小时。在此期间，将cDNA/Lipofectamine 2000混合物以49 μl/孔加入已包被聚-L-鸟氨酸的孔板中。
6. 用胰蛋白酶消化HEK293细胞（步骤1.1），使用血细胞计数板或Countess自动细胞计数仪（Invitrogen，C10227）计数细胞密度，并将所需数量的细胞（通常约为125,000–150,000个细胞/孔）转移至15 ml无菌锥底离心管中。以1000 × RPM离心5分钟。用含10%热灭活胎牛血清但不含抗生素的DMEM培养基重悬细胞，终浓度约为1,250,000–1,500,000个细胞/ml。
7. 使用多通道移液器或MicroFill微孔板分液器（Bio-Tek），将98 μl细胞悬液加入含有cDNA-Lipofectamine 2000混合物的各孔中。将板在超净台中静置至少30分钟，然后放入加湿的细胞培养孵育箱中。在37°C、5% CO₂条件下孵育20–44小时。

对于稳定表达 TRPA1 的 HEK293 细胞

8. 按照步骤 1.2 对 96 孔板进行包被。
9. 可诱导表达的 HEK293-hTRPA1 细胞系由 A. Patapoutian 博士（The Scripps Research Institute）惠赠，在与野生型 HEK293 细胞相同的培养基中培养（步骤 1.1），但额外添加 5 μg/ml 杀稻瘟菌素（blasticidin，Invitrogen，A1113902）和 50 μg/ml 潮霉素 B（hygromycin B，Invitrogen，10687010）。当细胞密度达到约 90% 时，用胰蛋白酶消化细胞，计数细胞密度，并将所需数量的细胞在 1000 × RPM 条件下离心 5 分钟。用含有强力霉素（doxycycline，Fisher，BP26535，0.25 μg/ml）的相同培养基重悬细胞，调整细胞密度至约 1,000,000 个细胞/ml。
10. 使用多通道移液器或 MicroFill（Bio-Tek）将细胞悬液以每孔 100 μl 的体积加入聚-L-鸟氨酸包被的培养板中。将培养板在生物安全柜中静置至少 30 分钟后，转移至加湿的细胞培养孵箱中。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16–24 小时。

2. 溶液

1. 使用 Hank's 缓冲盐溶液（HBSS）作为细胞外溶液。其成分（单位为 mM）如下：137 NaCl、5.4 KCl、0.25 Na₂HPO₄、0.44
   KH₂PO₄、1.3 CaCl₂、1.0 MgSO₄、1.0 MgCl₂、10 葡萄糖、10 HEPES，用 1N NaOH 调节 pH 至 7.4。
2. Fluo-4 检测缓冲液含有 2 mM 丙磺舒的 HBSS 溶液。将丙磺舒（Sigma, P8761）溶于 0.5 N NaOH 中配制成 250 mM 储存液，按 1:125 的比例稀释至 HBSS 中，再用 1 N HCl 重新调节 pH 至 7.4。

3. 使用 Fluo-4 AM 加载细胞

1. 将1 mg Fluo-4 AM（Invitrogen，F14202）溶解于912 μl无水DMSO中，配制成1 mM的储存液。Fluo-4 AM储存液可在-20 °C下保存至少一个月。
2. 取10 μl 1 mM Fluo-4 AM与10 μl Pluronic F-127（Invitrogen，P3000MP，20% (w/v) DMSO溶液）混合，然后将全部混合物转移至5 ml Fluo-4检测缓冲液（步骤2.2）中，该缓冲液需添加0.1%牛血清白蛋白（Sigma，A9418）。
3. 使用微孔板清洗仪（如Bio-Tek的ELx405TM），以HBSS对96孔板中培养的细胞（步骤1.7或1.10）进行清洗，每孔80 μl，清洗2次。
4. 使用多通道移液器或MicroFill（Bio-Tek）向每孔加入50 μl Fluo-4 AM负载溶液（步骤3.2），并在37 °C下孵育1小时。
5. 使用ELx405TM微孔板清洗仪，用Fluo-4检测缓冲液（步骤2.2）清洗细胞3次。最后一次清洗后，每孔保留80 μl Fluo-4检测缓冲液。

4. 化合物板的制备

1. 在1小时的细胞加载期间，用Fluo-4检测缓冲液配制激动剂（或拮抗剂）的3倍稀释系列溶液，使其浓度为所需最终浓度的3倍。
2. 将250–300 μl稀释后的化合物溶液移入96孔化合物板中。尽可能将同一化合物的系列稀释液及其相应的阳性和阴性对照安排在同一列中，因为FlexStation 3一次仅读取一列。

5. 在 FlexStation 3 中进行酶标仪读数

1. 开启系统（FlexStation 3、计算机和 SoftMax Pro 5.2 软件）
2. 使用新的文件名保存实验。在设置中选择 FLEX 模式，并输入以下数值：

方案 #1，激动剂效应

方案 #2，拮抗作用

3. 将新的吸头盒、化合物板和读数板放置到 FlexStation 3 的相应托盘中，然后点击“读取”按钮。FlexStation 3 将逐列读取数据，并在预设的时间点自动添加化合物，读取过程不会中断。完成一列的读取约需 3 分钟（方案 #2 为 5 分钟），仪器将继续读取下一列，同时按照用户在步骤 5.2 中设定的程序添加化合物，直至所有列读取完毕。

6. 数据分析

1. 实验数据可直接使用 SoftMax Pro 5.2 软件进行处理，或复制粘贴至任意电子表格程序（如 Microsoft Excel）中。使用以下最小二乘法拟合程序构建 TRPA1 激动剂氟芬那酸（FFA）的浓度-反应曲线。，其中 Y 为观测到的反应，Y_max 为归一化的最大反应，C 为相应的药物浓度，EC₅₀ 为引发半最大反应的浓度，n_H 为表观 Hill 系数。通过固定 FFA 浓度（100 μM）并逐步增加化合物 A 的浓度，获得假定 TRPA1 拮抗剂化合物 A 的浓度-抑制曲线。化合物 A 的 IC₅₀ 值通过最小二乘法拟合以下方程计算。，其中 Y 为观测到的反应，Y_max 为归一化的峰值反应，[Ant] 为相应化合物 A 的浓度，IC₅₀ 为产生 FFA 诱导反应半最大抑制的拮抗剂浓度，n_H 为表观 Hill 系数。

7. 代表性结果：

TRPA1 是一种可通透 Ca²⁺ 的阳离子通道，其激活可导致钙离子内流，该过程可通过 Ca²⁺ 敏感性染料 Fluo-4 进行检测（1-2）。本研究采用 HEK293-hTRPA1 稳定细胞系，用于分析 TRPA1 激动剂和拮抗剂的浓度-反应关系。细胞经 Fluo-4 AM 负载后，置于 80 μl 检测缓冲液中，并使用 FlexStation 3 进行读数。在记录 30 秒的基础荧光信号后，通过 FlexStation 3 流体模块配备的多通道移液器，向细胞中加入 40 μl 系列稀释的 TRPA1 激动剂 FFA（每种浓度均为目标终浓度的 3 倍）。随后继续监测荧光信号变化 180 秒。各孔中 Fluo-4 荧光信号的相对变化以 ΔF = (F - F₀) 表示，其中 F 和 F₀ 分别代表感兴趣时间点和读数起始时刻的荧光值。图 1 展示了在一系列 FFA 浓度刺激下荧光信号随时间变化的代表性曲线。值得注意的是，在最后四个 FFA 浓度条件下，尽管最大反应水平相似，但在较高浓度下的激活动力学明显快于较低浓度。因此，为区分这些差异，通过测量加入不同浓度 FFA 后荧光信号上升的初始速率（斜率）来构建浓度-反应关系曲线（图 2）。FFA 的半数最大有效浓度（EC₅₀）确定为 55.4 μM（n=3）。为测试潜在的 TRPA1 拮抗剂化合物 A，我们采用方案 #2（步骤 2）进行了类似实验。在此实验中，先于 30 秒时加入系列稀释的拮抗剂（40 μl，终浓度的 3 倍），180 秒后再加入 FFA（60 μl，300 μM，终浓度为 100 μM）。化合物 A 以剂量依赖方式抑制 TRPA1 细胞对 FFA 的反应，其半数最大抑制浓度（IC₅₀）为 4.3 μM（n=3）（图 2）。

图1. FFA浓度依赖性激活人源TRPA1。图中曲线显示FFA诱导的荧光随时间增加（仅展示前60秒的反应，以更清晰地说明FFA诱导反应的快速动力学特征）。请注意，尽管峰值荧光水平相似，但在较高浓度下，FFA诱导荧光增加的动力学速度明显快于较低浓度。

图2. 在稳定表达人源TRPA1的HEK293细胞中，FFA诱导的荧光变化及化合物A对FFA反应抑制的浓度-反应关系。Δ，通过测定加入不同浓度FFA后归一化荧光信号上升的初始速率（斜率），确定FFA的浓度-反应关系。O，假定的TRPA1拮抗剂化合物A对FFA诱发的钙反应抑制作用的浓度-反应关系。

讨论

细胞内 Ca²⁺ 在多种生理和病理条件下发挥重要作用，例如神经递质释放（3）、心肌动作电位（4）、肌细胞收缩（5）、细胞信号转导（6-7）以及兴奋性毒性细胞死亡（8）。细胞内Ca²⁺ 水平有助于阐明Ca的功能变化²⁺-质膜或细胞内细胞器中的可渗透通道及其贡献
钙²⁺ 上述过程（9-13）。该检测也可用于研究G蛋白偶联受体的功能，其中许多受体在激活后可导致细胞内游离Ca²⁺水平升高²⁺ 通过释放 Ca 来调节浓度²⁺ 来自细胞内 Ca²⁺ 储存或激活其他Ca²⁺ 可渗透离子通道（14-16）。FlexStation 3 利用 Ca²⁺ 敏感性染料，其荧光强度随细胞内 Ca²⁺ 浓度升高而增强，或发生比例性变化²⁺ 浓度。本视频文章展示了FlexStation 3在Ca研究中的应用²⁺在HEK293细胞中异源表达的可通透TRPA1通道。尽管本演示仅使用了96孔板，用户可通过更换分配移液器（8...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
96孔 FlexStation 移液吸头	Molecular Devices	9000-0912
96孔板	Greiner Bio-One	655090
96孔透明平底板	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14202
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P36551
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418