基于细胞的钙流检测法利用FlexStation 3对TRP通道功能进行中高通量筛选

摘要

本视频提供了使用 FlexStation 3 研究人源 TRPA1 通道药理学特性的详细实验方案。该方案涵盖了细胞制备、染料加载以及微孔板读板仪 FlexStation 3 操作的各个步骤。

摘要

Molecular Devices 公司的 FlexStation 3 是一台台式多功能微孔板读板仪，能够在多孔板中自动进行荧光检测。该设备非常适合在学术研究环境中开展中高通量筛选。仪器配备了一个集成的液体转移模块，内置多通道移液器，可逐列读取多孔板，以监测多种荧光试剂的荧光变化。例如，FlexStation 3 已被用于通过检测细胞内游离 Ca²⁺ 水平的变化，研究可通透 Ca²⁺ 的离子通道和 G 蛋白偶联受体的功能。瞬时受体电位（TRP）通道是一类庞大的非选择性阳离子通道家族，在多种生理和病理生理过程中发挥重要作用。大多数 TRP 通道可通透钙离子，激活后可引起钙离子内流。在本视频中，我们展示了 FlexStation 3 在研究 TRPA1 通道药理学特性中的应用，TRPA1 是一种对多种有害刺激物敏感的分子感受器。在 96 孔板中培养的、瞬时或稳定表达人源 TRPA1 通道的 HEK293 细胞，被加载 Ca²⁺ 敏感的荧光染料 Fluo-4，利用 FlexStation 3 的 FLEX 模式，在 TRPA1 激动剂作用前后实时测量这些细胞的荧光变化。同时，也检测了潜在 TRPA1 拮抗剂的作用效果。实验数据被导入 SoftMax Pro 软件，用于构建 TRPA1 激动剂和抑制剂的浓度-反应关系曲线。

方案

1. 96孔板中的细胞制备

对于瞬时转染人 TRPA1 cDNA 的 HEK293 细胞

1. HEK293 细胞在含有 4.5 mg/ml 葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（Thermo Scientific, SH3002201）中培养 1 至 2 天，培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清（Invitrogen, 16000-044）、50 单位/ml 青霉素和 50 μg/ml 链霉素（Invitrogen, 15140-163）。转染当天，细胞密度应达到 70–90%。
2. 通过移液将 50 μl 多聚-L-鸟氨酸（Sigma P3655，20 μg/ml 溶于无菌蒸馏水）加入 96 孔板的每个孔中，于 37°C 孵育至少 15 分钟，以完成包被。用不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（Thermo Scientific, SH3002803）冲洗每个孔一次。该 96 孔板可在细胞培养超净台中放置数小时。
3. 对于 96 孔板的每个孔，在 1.5 ml 离心管中将 0.2 μg cDNA 溶于 25 μl OPTI-MEM（Invitrogen, 31985-070）中进行稀释。若使用相同 cDNA 转染多个孔，则按比例放大稀释体积。另取单独的 1.5 ml 离心管，每孔加入 0.4 μl 脂质体 2000（Lipofectamine 2000）（Invitrogen, 11668-019）并用 25 μl OPTI-MEM 稀释。根据需转染的总孔数按比例放大该稀释液。
4. 短暂涡旋振荡稀释后的 cDNA 和 Lipofectamine 2000，室温静置约 5 分钟。
5. 将等体积的稀释后 Lipofectamine 2000 转移至含有稀释 cDNA 的离心管中，涡旋混匀后室温静置 15 分钟至 2 小时。在此期间，将 cDNA/Lipofectamine 2000 混合物以每孔 49 μl 的量加入已包被多聚-L-鸟氨酸的 96 孔板中。
6. 用胰蛋白酶消化 HEK293 细胞（步骤 1.1），使用血细胞计数板或 Countess 自动细胞计数仪（Invitrogen, C10227）测定细胞密度，并将所需数量的细胞（通常约为 125,000–150,000 个细胞/孔）转移至 15 ml 无菌圆底离心管中。以 1000 × RPM 离心 5 分钟。用含 10% 热灭活胎牛血清但不含抗生素的 DMEM 培养基重悬细胞，细胞密度约为 1,250,000–1,500,000 个细胞/ml。
7. 使用多通道移液器或 MicroFill 微孔板分液器（Bio-Tek），将 98 μl 细胞悬液加入含有 cDNA-Lipofectamine 2000 混合物的各孔中。将 96 孔板置于超净台中静置至少 30 分钟后，再放入加湿的细胞培养孵箱中。于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育 20–44 小时。

对于稳定表达 TRPA1 的 HEK293 细胞

8. 按照步骤 1.2 的方法包被 96 孔板。
9. 可诱导表达的 HEK293-hTRPA1 细胞系由 A. Patapoutian 博士（The Scripps Research Institute）慷慨提供，培养所用培养基与野生型 HEK293 细胞相同（步骤 1.1），但额外添加 5 μg/ml 普乐沙福（blasticidin，Invitrogen，A1113902）和 50 μg/ml 潮霉素 B（hygromycin B，Invitrogen，10687010）。当细胞密度达到约 90% 时，用胰蛋白酶消化细胞，计数细胞密度，并以 1000 × RPM 离心所需数量的细胞 5 分钟。将细胞重悬于含有 0.25 μg/ml 多西环素（doxycycline，Fisher，BP26535）的相同培养基中，细胞密度约为 1,000,000 个细胞/ml。
10. 使用多通道移液器或 MicroFill（Bio-Tek）将细胞悬液以每孔 100 μl 的体积加入预先包被多聚-L-鸟氨酸的孔板中。将板子在生物安全柜中静置至少 30 分钟后，再放入加湿的细胞培养孵箱中。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 16–24 小时。

2. 溶液

1. Hank's 平衡盐溶液（HBSS）用作细胞外液。其成分（单位：mM）为：137 NaCl、5.4 KCl、0.25 Na₂HPO₄, 0.44
   KH₂PO₄，1.3 CaCl₂，1.0 MgSO₄₄，1.0 MgCl₂，10 葡萄糖，10 HEPES，用 1N NaOH 调节 pH 至 7.4。
2. Fluo-4 检测缓冲液含有 2 mM 丙磺舒（probenecid），溶于 HBSS 中。用 0.5 N NaOH 配制 250 mM 丙磺舒（Sigma, P8761）储备液，按 1:125 的比例稀释至 HBSS 中。使用 1 N HCl 将 pH 值重新调节至 7.4。

3. 使用 Fluo-4 AM 负载细胞

1. 将1 mg Fluo-4 AM（Invitrogen，货号F14202）溶解于912 μl无水DMSO中，配制成1 mM的储存液。Fluo-4 AM储存液可在-20 °C保存至少一个月。
2. 取10 μl 1 mM Fluo-4 AM与10 μl Pluronic F-127（Invitrogen，货号P3000MP，20% (w/v) DMSO溶液）混合，然后将全部混合物转移至5 ml Fluo-4检测缓冲液（步骤2.2）中，该缓冲液需添加0.1%牛血清白蛋白（Sigma，货号A9418）。
3. 使用酶标板洗涤仪（如Bio-Tek的ELx405TM）用HBSS对96孔板中的细胞（步骤1.7或1.10）进行洗涤，每孔80 μl，共洗两次。
4. 使用多通道移液器或MicroFill（Bio-Tek）向每孔加入50 μl Fluo-4 AM负载溶液（步骤3.2），并将酶标板在37 °C孵育1小时。
5. 使用ELx405TM酶标板洗涤仪用Fluo-4检测缓冲液（步骤2.2）洗涤细胞3次。最后一次洗涤后，每孔保留80 μl Fluo-4检测缓冲液。

4. 化合物板的制备

1. 在1小时的细胞负载期间，用Fluo-4检测缓冲液配制激动剂（或拮抗剂）的系列3倍稀释液，使其浓度为所需最终浓度的3倍。
2. 将250–300 μl稀释后的化合物溶液加入96孔化合物板中。尽可能将同一化合物的系列稀释液及其相应的阳性和阴性对照安排在化合物板的同一列中，因为FlexStation 3每次仅读取一列。

5. 在 FlexStation 3 中进行酶标仪读数

1. 开启系统（FlexStation 3、计算机和 SoftMax Pro 5.2 软件）
2. 使用新的文件名保存实验。在设置中选择 FLEX 模式，并输入以下数值：

方案 #1，激动剂效应

方案 #2，拮抗作用

3. 将新的吸头盒、化合物板和读数板放置到 FlexStation 3 的相应托盘中，然后点击“读取”按钮。FlexStation 3 将逐列读取数据，并在预设的时间点自动添加化合物，同时不中断读数过程。读取一列大约需要 3 分钟（方案 #2 为 5 分钟），仪器将继续读取下一列，并按照用户在步骤 5.2 中设定的程序进行化合物添加，直至所有列读取完毕。

6. 数据分析

1. 实验数据可直接使用 SoftMax Pro 5.2 软件进行处理，或复制粘贴至任意电子表格程序（如 Microsoft Excel）中。TRPA1 激动剂氟芬那酸（FFA）的浓度-反应曲线通过以下最小二乘法拟合程序构建。，其中 Y 为观测到的反应，Y_max 为归一化后的最大反应值，C 为相应的药物浓度，EC₅₀ 为引发半最大反应的浓度，n_H 为表观 Hill 系数。对于假定的 TRPA1 拮抗剂化合物 A，其浓度-抑制曲线通过固定浓度的 FFA（100 μM）并逐步增加化合物 A 的浓度获得。化合物 A 的 IC₅₀ 值通过最小二乘法拟合以下方程计算得到。，其中 Y 为观测到的反应，Y_max 为归一化的峰值反应，[Ant] 为化合物 A 的相应浓度，IC₅₀ 为使 FFA 诱导反应产生半最大抑制的拮抗剂浓度，n_H 为表观 Hill 系数。

7. 代表性结果：

TRPA1 是一种 Ca²⁺-可渗透性阳离子通道，其激活可导致钙离子内流，该过程可通过Ca²⁺-敏感性染料Fluo-4（1-2）。采用HEK293-hTRPA1稳定细胞系研究TRPA1激动剂与拮抗剂的浓度-反应关系。细胞加载Fluo-4 AM后，置于 80 μl 加入检测缓冲液，使用FlexStation 3读取荧光信号。记录30秒的基础荧光值后， 40 μl 通过FlexStation 3流体模块配备的多通道移液器，向细胞中加入一系列浓度的TRPA1激动剂FFA（每种浓度均为目标终浓度的3倍）。随后继续监测荧光变化180秒。各孔中Fluo-4荧光的相对变化以ΔF = (F - F₀)表示。₀），其中 F 和 F₀ 分别为所关注时间点和读数开始时的荧光值。图1展示了在一系列游离脂肪酸（FFA）浓度刺激下，荧光随时间变化的代表性轨迹。需要注意的是，在最后四个FFA浓度条件下，尽管最大反应水平相似，但较高浓度下的激活动力学明显快于较低浓度。因此，为了区分这些差异，通过测量加入不同浓度FFA后荧光上升的初始速率（斜率），构建了浓度-反应关系曲线（图2）。半最大有效浓度（EC₅₀游离脂肪酸（FFA）的含量被确定为 55.4 μM （n=3）。为验证假定的TRPA1拮抗剂化合物A，我们采用方案#2（步骤2）进行了类似的实验。在此情况下，于30 s时加入一系列浓度梯度的拮抗剂40 μl 3倍目标终浓度）的试剂，游离脂肪酸（FFA）则在180秒后加入（60 μl 在 300 μM 最终浓度为 100 μM）。化合物A以剂量依赖性方式抑制TRPA1细胞对FFA的反应，其半数抑制浓度（IC₅₀) 的 4.3 μM （n=3）（图2）。

图 1. FFA 对人源 TRPA1 的浓度依赖性激活。图中曲线显示 FFA 引发的荧光随时间增加的情况（仅显示前 60 秒的反应，以便更清晰地展示 FFA 引发反应的快速动力学特征）。请注意，尽管峰值荧光水平相似，但在较高浓度下，FFA 引发的荧光增加速度明显快于较低浓度。

图 2. FFA 引起的荧光变化以及化合物 A 对 FFA 反应抑制作用的浓度-反应关系，实验基于在 HEK293 细胞中稳定表达的人源 TRPA1。Δ，FFA 的浓度-反应关系通过测定加入不同浓度 FFA 后归一化荧光信号上升的初始速率（斜率）来确定。O，通过候选 TRPA1 拮抗剂化合物 A 对 FFA 诱发的钙反应抑制作用所确定的浓度-反应关系。

讨论

细胞内 Ca²⁺ 在多种生理和病理条件下发挥重要作用，例如神经递质释放（3）、心肌动作电位（4）、肌细胞收缩（5）、细胞信号转导（6-7）以及兴奋性毒性细胞死亡（8）。细胞内Ca²⁺ 水平有助于阐明Ca的功能变化²⁺-质膜或细胞内细胞器中的可渗透通道及其贡献
钙²⁺ 上述过程（9-13）。该检测也可用于研究G蛋白偶联受体的功能，其中许多受体在激活后可导致细胞内游离Ca²⁺水平升高²⁺ 通过释放 Ca 来调节浓度²⁺ 来自细胞内 Ca²⁺ 储存或激活其他Ca²⁺ 可渗透离子通道（14-16）。FlexStation 3 利用 Ca²⁺ 敏感性染料，其荧光强度随细胞内 Ca²⁺ 浓度升高而增强，或发生比例性变化²⁺ 浓度。本视频文章展示了FlexStation 3在Ca研究中的应用²⁺在HEK293细胞中异源表达的可通透TRPA1通道。尽管本演示仅使用了96孔板，用户可通过更换分配移液器（8...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
96孔 FlexStation 移液吸头	Molecular Devices	9000-0912
96孔板	Greiner Bio-One	655090
96孔透明平底板	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14202
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P36551
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418