基于细胞的钙流检测法利用FlexStation 3对TRP通道功能进行中高通量筛选

摘要

本视频提供了使用 FlexStation 3 研究人源 TRPA1 通道药理学特性的详细实验方案。该方案涵盖了细胞制备、染料加载以及微孔板读板仪 FlexStation 3 操作的各个步骤。

摘要

Molecular Devices 公司的 FlexStation 3 是一台台式多功能微孔板读板仪，能够在多孔板中自动进行荧光检测。该设备非常适合在学术研究环境中开展中高通量筛选。仪器配备了一个集成的液体转移模块，内置多通道移液器，可逐列读取多孔板，以监测多种荧光试剂的荧光变化。例如，FlexStation 3 已被用于通过检测细胞内游离 Ca²⁺ 水平的变化，研究可通透 Ca²⁺ 的离子通道和 G 蛋白偶联受体的功能。瞬时受体电位（TRP）通道是一类庞大的非选择性阳离子通道家族，在多种生理和病理生理过程中发挥重要作用。大多数 TRP 通道可通透钙离子，激活后可引起钙离子内流。在本视频中，我们展示了 FlexStation 3 在研究 TRPA1 通道药理学特性中的应用，TRPA1 是一种对多种有害刺激物敏感的分子感受器。在 96 孔板中培养的、瞬时或稳定表达人源 TRPA1 通道的 HEK293 细胞，被加载 Ca²⁺ 敏感的荧光染料 Fluo-4，利用 FlexStation 3 的 FLEX 模式，在 TRPA1 激动剂作用前后实时测量这些细胞的荧光变化。同时，也检测了潜在 TRPA1 拮抗剂的作用效果。实验数据被导入 SoftMax Pro 软件，用于构建 TRPA1 激动剂和抑制剂的浓度-反应关系曲线。

方案

1. 96孔板中的细胞制备

对于瞬时转染人 TRPA1 cDNA 的 HEK293 细胞

1. HEK293 细胞在含有 4.5 mg/ml 葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（Thermo Scientific, SH3002201）中培养 1 至 2 天，培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清（Invitrogen, 16000-044）、50 单位/ml 青霉素和 50 μg/ml 链霉素（Invitrogen, 15140-163）。转染当天，细胞密度应达到 70–90%。
2. 通过移液将 50 μl 多聚-L-鸟氨酸（Sigma P3655，20 μg/ml 溶于无菌蒸馏水）加入 96 孔板的每个孔中，于 37°C 孵育至少 15 分钟，以完成包被。用不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（Thermo Scientific, SH3002803）冲洗每个孔一次。该 96 孔板可在细胞培养超净台中放置数小时。
3. 对于 96 孔板的每个孔，在 1.5 ml 离心管中将 0.2 μg cDNA 溶于 25 μl OPTI-MEM（Invitrogen, 31985-070）中进行稀释。若使用相同 cDNA 转染多个孔，则按比例放大稀释体积。另取单独的 1.5 ml 离心管，每孔加入 0.4 μl 脂质体 2000（Lipofectamin....

讨论

细胞内 Ca²⁺ 在多种生理和病理条件下发挥重要作用，例如神经递质释放（3）、心肌动作电位（4）、肌细胞收缩（5）、细胞信号转导（6-7）以及兴奋性毒性细胞死亡（8）。细胞内Ca²⁺ 水平有助于阐明Ca的功能变化²⁺-质膜或细胞内细胞器中的可渗透通道及其贡献
钙²⁺ 上述过程（9-13）。该检测也可用于研究G蛋白偶联受体的功能，其中许多受体在激活后可导致细胞内游离Ca²⁺水平升高²⁺ 通过释放 Ca 来调节浓度²⁺ 来自细胞内 Ca²⁺ 储存或激活其他Ca²⁺ 可渗透离子通道（14-16）。FlexStation 3 利用 Ca²⁺ 敏感性染料，其荧光强度随细胞内 Ca²⁺ 浓度升高而增强，或发生比例性变化²⁺ 浓度。本视频文章展示了FlexStation 3在Ca研究中的应用²⁺在HEK293细胞中异源表达的可通透TRPA1通道。尽管本演示仅使用了96孔板，用户可通过更换分配移液器（8.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
FlexStation 3	Molecular Devices	FLEX3
96孔 FlexStation 移液吸头	Molecular Devices	9000-0912
96孔板	Greiner Bio-One	655090
96孔透明平底板	Costar	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14202
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
多聚-L-鸟氨酸	Sigma-Aldrich	P36551
丙磺舒	Sigma-Aldrich	P8761
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9418