我们描述了从感染细胞中分离高纯度疱疹病毒核衣壳DNA的方法。从溶液中最终捕获的DNA具有高浓度和高纯度，非常适合用于高通量测序、高保真PCR反应以及转染以产生新的病毒重组体。
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摘要
摘要
病毒是专性细胞内寄生生物，因此研究其DNA需要将病毒成分与宿主细胞杂质及DNA分离。多个下游应用需要大量高纯度的病毒DNA，本方案可提供满足此需求的病毒DNA。这些应用包括病毒基因组测序，在该过程中去除宿主DNA对于优化病毒序列的数据产出至关重要；以及新型病毒重组株的构建，其中共转染纯化的质粒与线性病毒DNA有助于实现重组。1,2,3
该实验流程结合提取和基于密度的离心方法，从感染细胞中分离纯化的线性疱疹病毒核衣壳DNA4,5。初始纯化步骤旨在分离出完整的病毒衣壳，这些衣壳可在去除宿主细胞蛋白和DNA的提取及离心过程中保护病毒DNA。随后裂解核衣壳以释放病毒DNA，并通过两次最终的酚-氯仿抽提步骤去除残留的蛋白质。从溶液中回收的最终DNA具有高浓度和高纯度，平均OD260/280为1.90。根据所用感染细胞的数量不同，病毒DNA的产量可达150–800 μg或更高。该DNA纯度高，可在4°C长期稳定保存。因此，该DNA非常适用于高通量测序、高保真PCR反应以及转染实验。
在开始实验方案之前，需要了解每皿细胞的平均数量（例如，一个汇合的15 cm培养皿中平均有8 × 106个PK-15细胞），以及所用病毒原液的滴度（例如，每毫升1 × 108个空斑形成单位）。这些参数对于计算实验所需的感染复数（MOI）至关重要6。例如，若要以MOI为5的条件感染一皿上述PK-15细胞，需使用400 μl病毒原液，并用3.6 ml培养基稀释（即每块15 cm培养板的总接种体积为4 ml）。
可同时制备多种病毒DNA。同时进行制备的数量仅受限于超速离心机转子所能容纳的离心管数量（每种病毒一支管；参见下文步骤3.9）。此处我们以一种病毒的制备为例描述该操作流程。
方案
1. 第一天：病毒感染与缓冲液制备
- 准备5-10个组织培养皿（直径15 cm）用于感染，例如PK-15细胞用于伪狂犬病病毒（PRV）或Vero细胞用于单纯疱疹病毒（HSV）。
- 当细胞融合度达到95%-100%时，以5-10的感染复数（MOI）进行感染。每块培养皿使用病毒储备液接种，总体积为4 ml，然后在37°C孵育1小时。每15分钟轻轻摇动培养皿一次，以确保细胞单层始终被病毒接种物完全覆盖。同时，将下一步所需的培养基预热。
- 感染1小时后，吸除各培养皿中的病毒接种物，加入15 ml预热的培养基，并在37°C、湿润的培养箱中继续孵育12-20小时。
- 配制LCM缓冲液（见表1），并在4°C轻轻摇动过夜以充分混匀。同时配制用于病毒DNA重悬的TNE溶液（见表2）。
第2天，第一阶段：细胞裂解与超速离心
- 在显微镜下确认细胞感染已导致均匀的细胞病变效应（CPE）。继续培养直至所有细胞变圆，但尚未从培养皿上脱落。
- 将感染的细胞用刮刀刮入培养基中，并将细胞与培养基合并至50 ml锥形管中。所需锥形管的数量取决于第1.2步中用于感染的培养皿数量，例如，每管最多可收集3个培养皿（每个含15 ml培养基）的样本。 可选步骤： 用10 ml PBS冲洗培养皿，并将冲洗液合并至细胞与培养基中。
- 室温下以2000相对离心力（rcf）离心10分钟，去除上清液，将每管沉淀重悬于10 ml PBS中。若第2.2步中一个病毒感染样本分装至多个锥形管，此时可将这些管中的沉淀合并至同一管中。重复离心与吸除上清步骤。 可选步骤： 此沉淀可在-20°C保存，后续再继续实验流程。
3. 第二天，第二阶段：超速离心
在后续步骤中，应尽可能将细胞沉淀和LCM缓冲液置于冰上。
- 向0%甘油-LCM缓冲液中加入β-巯基乙醇。开始将超速离心机冷却（用于下文步骤3.9），将其设定为4°C并开启真空。
- 用5 ml 0%甘油-LCM缓冲液重悬细胞沉淀，直至无明显团块。如有必要，可用涡旋振荡器震荡以打散未溶解的细胞沉淀。
- 加入1.5 ml 氟利昂（1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷）并剧烈涡旋进行抽提。立即在4°C条件下以2000 rcf离心10分钟。用宽口吸头小心吸取上层液体（避免接触界面），转移至新离心管中。可选：若沉淀呈胶状固体，可迅速将上层液体倒入新离心管中。
- 重复一次氟利昂抽提，并再次离心。
- 收集上层液体（约5 ml），转移至新的聚碳酸酯超速离心管中。向其余两种含甘油的LCM缓冲液中加入β-巯基乙醇。
- 在聚碳酸酯离心管中制备梯度：将氟利昂抽提物（上层）下方小心加入3 ml 5%甘油-LCM缓冲液（中间层），再在其下方加入2.5 ml 45%甘油-LCM缓冲液（底层）。使用细口吸头以避免管内容物溢出。
- 如有需要，使用相同比例的LCM缓冲液制备一个配平管。
- 将离心管放入超速离心机吊桶中。通过向顶部液体层缓慢添加额外的0%甘油-LCM缓冲液（每次约50–100 μl），将各吊桶之间的质量差平衡至0.1 g以内。
- 使用预冷至4°C的超速离心机，配备水平转子或摆桶转子，以77,000 rcf（例如SW41Ti转子为25,000 rpm）离心1小时。
- 在超速离心过程中，制备玻璃钩以用于后续乙醇沉淀步骤（下文步骤4.6）中捕获漂浮的DNA。握住玻璃巴斯德吸管的两端，将其中段悬于火焰上方。当玻璃局部接近熔融时，轻轻拉伸使其延展，再轻柔弯曲形成一个锐角钩状（<90度），然后迅速拉断以封住末端。若玻璃钩尖端开口，可将其尖端置于火焰上加热至熔融闭合。
- 超速离心结束后，可见底部有一层薄而浑浊的沉淀，中央有深色斑点。小心吸除管内液体（包括沿管壁流下的液滴），避免触碰底部沉淀。
- 加入0.5 ml 室温TNE缓冲液。
- 让沉淀静置至少10分钟，使其充分水化。可选：若置于4°C环境中，沉淀也可在TNE缓冲液中过夜溶解。
第3天："幽灵" DNA 沉淀
- 用小口径移液器吸头通过移液吹打使沉淀松散例如 一个200 μL移液器吸头）。此步骤无需担心剪切，因为病毒DNA此时仍包含在衣壳内。在室温下，向含有病毒沉淀的离心管中加入以下试剂以破坏衣壳：
- 4.25 ml TNE
- 0.25 ml 10% SDS
- 2 mg 蛋白酶K
从此步骤开始注意避免剪切力，例如使用宽口吸头，且不要涡旋病毒材料
- 加入 5 ml 苯酚-氯仿以提取病毒蛋白，并立即开始倒置或涡旋，以维持乳化状态。混合 10 秒后，在室温下以 2000 rcf 离心 5 分钟。用宽口移液器吸头收集上层液体，避免接触界面，转移至新离心管中。可选： 此步骤可使用相锁凝胶（PLG）管，以避免界面污染。
- 重复苯酚-氯仿抽提，并再次离心。
- 第二次苯酚-氯仿抽提后，将上层液体收集至 30 ml 玻璃 Corex 管中，并在 -20°C 冰箱中预冷 10–15 分钟，注意防止冻结。
- 加入 10 ml 预冷乙醇，盖紧管口（例如 用 Parafilm M 封口），立即倒置混匀。观察是否有 DNA“絮状物”出现，表现为细长丝状沉淀物。轻柔倒置管体进一步混匀，促使黏性 DNA 沉淀聚集形成团块。
- 用玻璃钩捞出 DNA 絮状物。小心吸去多余液体，然后将玻璃钩（尖端朝下）放入 1.5 ml 离心管中，静置干燥。加入 0.25–0.5 ml TE 缓冲液以溶解 DNA 絮状物。让 DNA 至少重悬 1 小时。将 DNA 储存于 4°C。可选： 为最大化 DNA 产量，可将玻璃钩折断留在 1.5 ml 离心管中，使 DNA 能持续从玻璃碎片上溶解下来。
5. 典型结果
使用足够高的感染复数（MOI），细胞在感染后约18小时（hpi）应对野生型PRV毒株表现出完全的细胞病变效应（CPE），而对野生型HSV-1毒株则约在24小时（hpi）达到完全CPE（图1）。一旦收获感染后的细胞沉淀，后续实验步骤可在一天内长时间完成，或分两天进行（图2）。
在制备用于捕获DNA幽灵的玻璃钩时，应确保钩子的角度小于90度，以便后续能够插入1.5 ml离心管的底部（图3）。密封该钩子的尖端可防止DNA在移液过程中丢失。
DNA在沉淀过程中会形成“DNA幽灵”，表现为白色、呈丝状的絮状物（图4）。这些絮状物会聚集并相互粘连，或粘附在用于钩取DNA的玻璃钩上。因此，可使用同一根玻璃钩从沉淀液中收集多条DNA絮状物。
| 根据所需体积选择列： | 10 ml | 15 ml | 20 ml | 40 ml |
| 1M KCL | 1.3 ml | 1.9 ml | 2.5 ml | 5 ml |
| 1M Tris (pH 7.4) | 300 μl | 450 μl | 600 μl | 1.2 ml |
| 1M MgCl2 | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| 0.5 EDTA | 10 μl | 15 μl | 20 μl | 40 μl |
| NP40/IGEPAL | 50 μl | 75 μl | 100 μl | 200 μl |
| β-巯基乙醇（使用前立即加入） | 4.3 μl | 6.5 μl | 8.6 μl | 17.2 μl |
| 根据所需甘油百分比（0、5 或 45%）使用相应比例 | ||||
| 0% 甘油 | 无 | 无 | 无 | 无 |
| 水 | 8.3 ml | 12.5 ml | 16.7 ml | 33.4 ml |
| 5% 甘油 | 0.5 ml | 0.8 ml | 1.0 ml | 2.0 ml |
| 水 | 7.8 ml | 11.7 ml | 15.7 ml | 31.4 ml |
| 45% 甘油 | 4.5 ml | 6.8 ml | 9.0 ml | 18.0 ml |
| 水 | 3.8 ml | 5.7 ml | 7.7 ml | 15.4 ml |
表1. LCM缓冲液的配制配方
| 50 ml 体积配制 |
| 5 ml 1M NaCl |
| 2.5 ml 1M Tris, pH 7.5 |
| 1 ml 0.5 M EDTA |
| 41.5 ml H2O |
表2. TNE的配制 (0.1 M NaCl; 50 mM Tris, pH 7.5; 10 mM EDTA)
| 1 L 体积所需 |
| 0.2 g KCl |
| 0.2 g KH2PO4 |
| 8 g NaCl |
| 1.15 g Na2HPO4 |
| H2O 定容至 1 L |
表3. PBS的配制（2.7 mM KCl；1.5 mM KH2PO4；137 mM NaCl；8.1 mM Na2HPO4；pH 7.0）
图 1. PK15 细胞（A）感染前、（B）感染中期和（C）高感染复数感染后出现细胞病变效应（CPE）时的形态。
图2. 实验方案概览。
图 3. 用于收集病毒DNA空壳的三种代表性玻璃钩示例。
图 4. 形成良好且数量丰富的 DNA“幽灵”的代表性示例。
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讨论
本方案的部分内容最初是为在BSL4条件下分离病毒DNA而开发的，但同样适用于非BSL4条件。4 我们通常使用该方案从α-疱疹病毒伪狂犬病毒（PRV）和单纯疱疹病毒1型（HSV-1）中分离DNA，这些病毒的DNA基因组被包裹在蛋白质衣壳内，并由脂质包膜包围。7,8 然而，该方案很可能也可直接适用于其他大型DNA病毒，包括β-和γ-疱疹病毒以及腺病毒。类似的提取方法也常用于RNA病毒。9
这种DNA制备方法的稳健性可能源于其中包含的多种纯化步骤。最初的氟利昂抽提可使脂质膜变性，从而分离细胞组分，并释放出包裹疱疹病毒衣壳的脂质包膜及外层被膜蛋白。随后进行超速离心，较重的病毒核衣壳会穿过两层梯度垫沉淀下来，从而有效地与大多数其他细胞组分分离。将这些衣壳重悬后，通过蛋白酶K和去污剂裂解衣壳，释放出病毒核衣壳DNA。两次苯酚-氯仿抽提可彻底去除核衣壳组分及任何残留的细胞蛋白。最后，通过沉淀溶液中较大的病毒DNA基因组，减少盐类或颗粒污染物的残留。
该分离病毒核衣壳DNA...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢 Greg Smith、Lisa Pomeranz、Matt Lyman、Marlies Eldridge、Halina Staniszewska Goraczniak 以及 Enquist 实验室成员在优化本实验方案过程中所做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氟利昂（1,1,2-三氯-1,2,2-三氟–乙烷） | 费舍尔科技公司 | T178-4 | 请咨询您所在机构关于含氟利昂废弃物的适当处理指南，或参见 Mendez 等人关于潜在氟利昂替代品的研究。9 |
| 相锁凝胶管，重型，15 ml 容量 | 5 PRIME | 2302850 | 可选 |
| 聚烯烃超速离心管 | 贝克曼库尔特公司 | 331372* | *请选择适用于您所用超速离心机的管子；此处仅作示例 |
| NP-40 / IGEPAL | 西格玛-奥德里奇公司 | I-3021 | |
| PK-15 细胞 | 美国典型培养物保藏中心 | CCL-33 | |
| Vero 细胞 | 美国典型培养物保藏中心 | CCL-81 | |
| PBS | 海克隆公司 | SH30028.03 |
参考文献
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