创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

摘要

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。

摘要

微接触印刷提供了一种快速且高度可重复的方法，用于制备定义明确的图案化基底。¹ 尽管微接触印刷可直接用于印刷多种分子，包括蛋白质²、DNA³ 和硅烷⁴，但在金表面通过长链烷烃硫醇形成自组装单分子层（SAMs）则为将蛋白质和细胞限制在包含黏附区与抗黏附区的特定图案中提供了一种简便方法。这种限制可用于控制细胞形态，并有助于研究蛋白质与细胞生物学中的多种问题。本文中，我们描述了一种用于细胞研究的、制备定义明确蛋白质图案的通用方法。⁵ 该过程包括三个步骤：利用光刻技术制备图案化模板、制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，以及对镀金基底进行微接触印刷。图案化后的这些细胞培养基底能够将蛋白质和/或细胞（原代细胞或细胞系）限制在特定图案区域内。

利用自组装单分子层化学技术，可精确控制图案化的蛋白质/细胞黏附区域与非黏附区域，而直接蛋白质印迹法无法实现这一效果。在微接触印刷步骤中使用的长链烷基硫醇——十六烷硫醇，可形成疏水表面，易于从溶液中吸附蛋白质。用于填充基底非印刷区域的乙二醇端基硫醇，则形成一层抗蛋白质吸附的单分子层，从而抑制细胞生长⁶。这些硫醇单体可形成高度有序的单分子层，精确界定基底上能够支持蛋白质吸附和细胞生长的区域。因此，这类基底适用于多种应用，从细胞间行为研究⁷到微电子器件的构建⁸。

尽管已有其他类型的单分子层化学方法被用于细胞培养研究，包括我们课题组利用三氯硅烷在玻璃基底上直接构建图案的工作⁹，但由烷基硫醇在金表面形成的图案化单分子层更易于制备。此外，用于单分子层制备的单体可商业化获得，性质稳定，无需在惰性气氛下储存或操作。由烷基硫醇制备的图案化基底还可多次回收再利用，同时仍能保持对细胞的限定能力¹⁰。

方案

1. 图案化母版的制备（图1）

1. 将硅片置于匀胶机中心，并在表1所示的两步旋转程序的第一步中用丙酮冲洗硅片。在旋转程序的第二步中，丙酮将挥发，留下洁净且干燥的硅片。
2. 在硅片上以每英寸（直径）约1 mL的量涂覆AZ9245光刻胶，并按照表1所述条件进行旋涂。
3. 使用高均匀性加热板在110°C下对涂有光刻胶的硅片进行前烘，时间为2分钟。
4. 使用直写式光刻系统或掩模对准系统及相应的掩模对基底进行光刻图形化。掩模可从多个商业渠道购买。此外，也可将用紫外吸收性油墨打印的透明胶片粘贴至光学平面上，用于制作具有较大特征尺寸的图形。
5. 将已曝光的硅片在1:2配比的400K显影液与半导体级去离子水混合溶液中显影1分45秒，期间轻柔搅动。随后用半导体级去离子水充分冲洗，并用氮气（N₂）气流吹干。可使用带紫外滤光片的显微镜检查图形显影情况。若图形未完全显影，可将硅片重新放入显影液中继续显影一段时间。

注意：为获得最佳效果，光刻图案化应在洁净室环境中进行。

2. PDMS印章的制备（图2）

1. 按重量比10:1配制Sylgard 182（PDMS）的树脂与固化剂混合物，并将该混合物完全覆盖在母模（光刻图案化晶圆）上，置于一次性培养皿中。
2. 将覆盖PDMS的母模放入真空干燥器中脱气，直至无可见....

讨论

在用于制备PDMS印章的模板光刻加工过程中，可能会出现多种问题。光刻胶涂层硅片曝光不足会导致图案模糊不清，而曝光过度则会导致特征结构变大或缺失。通常情况下，具有较大特征尺寸（>10 μm）的模板相对容易实现图案化和显影，而具有较小特征的模板则可能需要对光刻和显影参数进行大量优化（超出光刻胶制造商推荐的参数范围）。最难制备的模板是同时包含大尺寸和小尺寸特征的模板。

使用第2节中描述的方法从模具制备PDMS印章非常简便。然而，必须注意将Sylgard 184的两种组分充分混合。若混合不充分，将导致印章无法完全固化，并可能损坏模具。此外，在分离PDMS印章与模具时，若施加过大的力或发生扭转，模具可能发生碎裂。如果在取下印章的过程中模具发生破损，经过乙醇清洗后仍有可能继续使用该印章，但此印章所形成的图案可能出现缺陷位点。

尽管使用PDMS印章进行自组装单分子膜（SAMs）的微接触印刷技术具有多功能性，并可在许多应用中发挥作用，但必须遵循若干关键步骤才能实现成功的蛋白质和细胞限制。为了获得良好的蛋白质和细胞限制效果，金基底必须.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅片	晶圆回收服务		2 英寸
旋涂仪/加热板	Brewer Science, Inc.	Cee 200CB 旋涂-烘烤系统
AZ9245 光刻胶	Mays Chemical Company	105880034-1160
直写式光刻系统	Microtech s.r.l.	LW325 激光直写系统
掩模对准器	HTG	3HR
AZ 400K 显影液	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 硅橡胶弹性体试剂盒	Dow Corning
25 mm 一号圆形玻璃盖玻片	VWR international	16004-310
等离子体氧化仪	Diener	Femto
钛片 Kamis	公司		99.95% 纯度
金颗粒	Kamis Incorporated		99.999% 纯度
电子束蒸发仪	Kurt J. Lesker	PVD 75 薄膜沉积系统	配备电子束附件
十六烷基硫醇	Alfa Aesar	A11362
1-巯基十一烷基)四(乙二醇)	Sigma-Aldrich	674508
乙醇	Pharmco-AAPER	111000200	200 证明，无水
Parafilm 封口膜	VWR international	52858-000
DPBS	VWR international	4500-434	不含钙和镁
小鼠层粘连蛋白 I	VWR international	95036-762
人血浆纤连蛋白	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor® 647 羧酸琥珀酰亚胺酯	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Red 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor® 350 羧酸琥珀酰亚胺酯	Invitrogen	A-10168
抗层粘连蛋白抗体	Fisher Scientific	AB2034MI