在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。
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摘要
摘要
微接触印刷提供了一种快速且高度可重复的方法，用于制备定义明确的图案化基底。1 尽管微接触印刷可直接用于印刷多种分子，包括蛋白质2、DNA3 和硅烷4，但在金表面通过长链烷烃硫醇形成自组装单分子层（SAMs）则为将蛋白质和细胞限制在包含黏附区与抗黏附区的特定图案中提供了一种简便方法。这种限制可用于控制细胞形态，并有助于研究蛋白质与细胞生物学中的多种问题。本文中，我们描述了一种用于细胞研究的、制备定义明确蛋白质图案的通用方法。5 该过程包括三个步骤：利用光刻技术制备图案化模板、制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，以及对镀金基底进行微接触印刷。图案化后的这些细胞培养基底能够将蛋白质和/或细胞（原代细胞或细胞系）限制在特定图案区域内。
利用自组装单分子层化学技术，可精确控制图案化的蛋白质/细胞黏附区域与非黏附区域，而直接蛋白质印迹法无法实现这一效果。在微接触印刷步骤中使用的长链烷基硫醇——十六烷硫醇，可形成疏水表面，易于从溶液中吸附蛋白质。用于填充基底非印刷区域的乙二醇端基硫醇，则形成一层抗蛋白质吸附的单分子层，从而抑制细胞生长6。这些硫醇单体可形成高度有序的单分子层，精确界定基底上能够支持蛋白质吸附和细胞生长的区域。因此，这类基底适用于多种应用，从细胞间行为研究7到微电子器件的构建8。
尽管已有其他类型的单分子层化学方法被用于细胞培养研究，包括我们课题组利用三氯硅烷在玻璃基底上直接构建图案的工作9，但由烷基硫醇在金表面形成的图案化单分子层更易于制备。此外，用于单分子层制备的单体可商业化获得，性质稳定，无需在惰性气氛下储存或操作。由烷基硫醇制备的图案化基底还可多次回收再利用，同时仍能保持对细胞的限定能力10。
方案
1. 图案化母版的制备（图1）
- 将硅片置于匀胶机中心，并在表1所示的两步旋转程序的第一步中用丙酮冲洗硅片。在旋转程序的第二步中，丙酮将挥发，留下洁净且干燥的硅片。
- 在硅片上以每英寸（直径）约1 mL的量涂覆AZ9245光刻胶，并按照表1所述条件进行旋涂。
- 使用高均匀性加热板在110°C下对涂有光刻胶的硅片进行前烘，时间为2分钟。
- 使用直写式光刻系统或掩模对准系统及相应的掩模对基底进行光刻图形化。掩模可从多个商业渠道购买。此外，也可将用紫外吸收性油墨打印的透明胶片粘贴至光学平面上，用于制作具有较大特征尺寸的图形。
- 将已曝光的硅片在1:2配比的400K显影液与半导体级去离子水混合溶液中显影1分45秒，期间轻柔搅动。随后用半导体级去离子水充分冲洗，并用氮气（N2）气流吹干。可使用带紫外滤光片的显微镜检查图形显影情况。若图形未完全显影，可将硅片重新放入显影液中继续显影一段时间。
注意：为获得最佳效果，光刻图案化应在洁净室环境中进行。
2. PDMS印章的制备（图2）
- 按重量比10:1配制Sylgard 182（PDMS）的树脂与固化剂混合物，并将该混合物完全覆盖在母模（光刻图案化晶圆）上，置于一次性培养皿中。
- 将覆盖PDMS的母模放入真空干燥器中脱气，直至无可见气泡，随后将印章置于65°C烘箱中固化1.5小时。在固化前，需确保母模位于培养皿底部，因为在脱气过程中其可能上浮至表面。
- 从母模上取下PDMS印章，并修剪至合适尺寸。将印章存放于带盖容器中（微结构面朝上），以防灰尘和碎屑污染。
3. 图案化金基底的制备（图3）
- 将25 mm直径1号圆形玻璃盖玻片用氧气等离子体处理10分钟，以备金属沉积。每次处理后用18.2 MΩ的去离子水冲洗两次，再用乙醇冲洗两次，每次步骤之间用N2气体流吹干。
- 使用多腔电子束沉积系统，先沉积50 Å的钛，再沉积150 Å的金。在沉积钛层和金层之间不要打开蒸发室。或者，也可从不同供应商处购买镀金盖玻片，但需确保金属层是通过电子束蒸发而非热蒸发制备的。若从外部采购，金基底在使用前可通过等离子体氧化或“piranha”溶液（7:3 浓H2SO4:30% H2O2）11进行清洗。
注意：“Piranha”溶液在接触有机化合物时可能发生爆炸。
- 配制印模溶液（10 mM 十六烷基硫醇的无水乙醇溶液）和反填充溶液（1 mM 羟基封端硫醇的无水乙醇溶液）。
- 用乙醇冲洗PDMS印模，再用N2气体彻底干燥。将印模溶液逐滴加至PDMS印模表面，直至完全覆盖。再用N2气体彻底干燥印模。根据PDMS印模的特征，选择进行步骤5a或5b。
-
- 将印模轻轻按压到金基底上，使单分子层形成15秒。
- 将金基底放入盛有18.2 MΩ去离子水的培养皿中，确保基底完全浸没。将印模轻轻按压到金基底上，使单分子层形成15秒。
- 用乙醇冲洗已印模的基底两次，每次冲洗后均用N2气体干燥，并将基底放入培养皿中。
- 用反填充溶液覆盖基底，并用封口膜密封培养皿以防止蒸发。
- 在避光条件下静置12–14小时，使背景单分子层形成。
- 从反填充溶液中取出已图案化的盖玻片，用乙醇冲洗两次，每次冲洗后均用N2气体干燥。
4. 将蛋白质和细胞施加到图案化基底上
- 将带有图案的盖玻片放入小型培养皿或细胞培养腔室中，并加入 500 μL 至 1 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。在蛋白质孵育过程中，DPBS 必须完全覆盖基底，以确保蛋白质均匀覆盖。
- 向 DPBS 中加入浓缩的蛋白质溶液，并通过反复吹打混匀。将蛋白质混合物与基底在 37°C 下孵育 1 小时。层粘连蛋白和纤连蛋白的终浓度通常分别为 12 μg/mL 和 20 μg/mL。蛋白质可用胺反应性荧光染料进行标记，以便于观察图案。然而，标记的蛋白质应与未标记的蛋白质按 1:1 混合使用，因为标记可能干扰蛋白质的生物学活性。
- 孵育结束后，用 DPBS 彻底冲洗基底（4–5 次），以去除未结合的蛋白质，注意避免使基底干燥或使其穿过气液界面。在前三次冲洗后，加入约 500 μL 完全细胞培养基，以保持基底湿润。
- 用新鲜培养基替换用于冲洗基底的培养基。
- 将细胞解离并计数，用于接种到基底上。可使用解离的原代细胞（如海马神经元）或永生化细胞系（如 CHO-K1 细胞）。
- 将解离的细胞接种到基底上。通常使用的细胞密度为 30 至 200 个细胞/mm2。
5. 代表性结果：
图1. 图案化模板光刻制备的通用示意图。该过程中，硅片经丙酮清洗后涂覆光刻胶，随后曝光于目标图案，并进行显影以形成图案。
图2. PDMS印章制备的一般示意图。该过程中，将图案化的模具覆盖Sylgard（10:1 树脂:固化剂），在真空干燥器中脱气，于60°C烘箱中固化，然后切割至所需尺寸。
图3. 基底图案化的通用示意图。该过程包括：使用电子束蒸发仪在玻璃基底上沉积钛层（50Å）和金层（150Å），利用PDMS印章通过微接触印刷技术将十六烷硫醇进行图案化，随后用乙二醇末端的烷基硫醇进行反向填充，并涂覆荧光标记的蛋白质。
图 4. 采用所述方法制备的图案化模板（A）和PDMS印章（B）。比例尺为100μm。
图5. 用AlexaFluor 647标记的纤连蛋白（A）和CHO-K1细胞限制（B）观察到的图案化自组装单分子层（SAMs）。比例尺为100 μm。
图6. 接种E18小鼠海马神经元4天后的图案化层粘连蛋白 体外AlexaFluor 350 标记的抗层粘连蛋白抗体用于模式可视化（A），E18 小鼠海马神经元用 MitoTracker Red 580 染色（B）。比例尺为 100 μm.
图7. 通过AlexaFluor 647标记的纤连蛋白吸附所观察到的图案化基底制备过程中的潜在问题。(A) 混合不充分导致蛋白质吸附不均匀。(B) 印迹过程中压力施加不均导致图案部分转移。(C) 印迹过程中压力过大可导致印章塌陷。(D) 图案化表面在清洗过程中暴露于气液界面，可能导致背景蛋白质吸附。比例尺为100 μm。
图8. 水下图案化可生成具有微小特征的图案，而这些特征在空气中通过传统微接触印刷难以实现。图像（A）和（B）显示了同一图案的不同区域，使用相同的PDMS印章在空气中（A）或去离子水中（B）印刷而成。在（A）中可见围绕图案的10 μm宽支撑线（用于帮助防止印章塌陷），但在（B）中所示的更小的点状特征则无法观察到。这表明，在空气中印刷适用于较大特征，而对于具有较小特征的图案，可能需要在水中进行印刷。比例尺为20 μm。
| 循环 | 加速度率 (rpm/s) | 最终转速 (rpm) | 时间 (s) |
| 1 | 500 | 1000 | 5 |
| 2 | 3800 | 3800 | 30 |
表1. 用于在硅片上制备4.5 μm厚AZ9245涂层的双循环旋涂程序。
为了制备用于形成图案化基底的PDMS印章，首先需要在光刻胶中制作模具（图1和图4A）。该模具是印章的反向结构，可通过直写光刻系统或掩模对准器制备。当使用正性光刻胶（如AZ9245）制作模具时，将涂有光刻胶的硅片以与最终基底上所需图案相同的图形进行光照曝光。尽管并不总是可行，已有文献报道PDMS印章模具的理想宽高比（特征尺寸与光刻胶厚度之比）为1:213。我们发现，根据图案的具体情况，可实现高达1:40的宽高比。在本实验条件下涂覆AZ9245的硅片可获得名义厚度为4.5 μm的光刻胶。我们发现，该厚度的AZ9245可用于制备特征尺寸范围从>100 μm至2 μm的PDMS模具。
使用光刻胶制作的模具（图2），通过Sylgard 182（或Sylgard 184）浇铸制备PDMS印章。光刻胶模具可多次使用，以制备多个相同的印章。PDMS固化后，用剃刀片将印章从模具上取下，然后将印章的图案面朝下放置在玻璃盖玻片上，即可在显微镜下观察所得印章（图4B）
适当的压印可产生清晰锐利的蛋白质图案，通过应用荧光标记的蛋白质即可观察到该图案（图3和图5）。或者，也可在细胞固定后采用免疫组织化学方法来观察蛋白质图案（图6）。无论是永生化细胞系还是原代细胞，细胞生长均能很好地局限于蛋白质图案区域内（图5和图6）。
尽管该技术易于掌握，但仍可能出现一些常见问题。在DPBS中，若浓缩蛋白溶液未充分混匀即进行蛋白涂布，可能导致蛋白图案不均匀（图7A）。印章转移操作不当可能导致图案部分转移或印章塌陷（图7B-C）。此外，将吸附有蛋白的图案化基底暴露于空气中，可能破坏单分子层，导致背景电阻降低（图7D）。由非常小的特征（< 5 μm）和高宽高比组成的图案通常需要采用浸没式微接触印刷技术。在此步骤（3.5b）中，水被用作屏障，以防止十六烷硫醇在图案以外的区域沉积到基底上（图8）14。
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讨论
在用于制备PDMS印章的模板光刻加工过程中，可能会出现多种问题。光刻胶涂层硅片曝光不足会导致图案模糊不清，而曝光过度则会导致特征结构变大或缺失。通常情况下，具有较大特征尺寸（>10 μm）的模板相对容易实现图案化和显影，而具有较小特征的模板则可能需要对光刻和显影参数进行大量优化（超出光刻胶制造商推荐的参数范围）。最难制备的模板是同时包含大尺寸和小尺寸特征的模板。
使用第2节中描述的方法从模具制备PDMS印章非常简便。然而，必须注意将Sylgard 184的两种组分充分混合。若混合不充分，将导致印章无法完全固化，并可能损坏模具。此外，在分离PDMS印章与模具时，若施加过大的力或发生扭转，模具可能发生碎裂。如果在取下印章的过程中模具发生破损，经过乙醇清洗后仍有可能继续使用该印章，但此印章所形成的图案可能出现缺陷位点。
尽管使用PDMS印章进行自组装单分子膜（SAMs）的微接触印刷技术具有多功能性，并可在许多应用中发挥作用，但必须遵循若干关键步骤才能实现成功的蛋白质和细胞限制。为了获得良好的蛋白质和细胞限制效果，金基底必须...
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致谢
我们感谢华盛顿大学Maurer课题组全体成员，他们的集体知识使本实验方案成为可能。本研究工作由美国国家心理健康研究所（1R01MH085495）提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅片 | 晶圆回收服务 | 2 英寸 | |
| 旋涂仪/加热板 | Brewer Science, Inc. | Cee 200CB 旋涂-烘烤系统 | |
| AZ9245 光刻胶 | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| 直写式光刻系统 | Microtech s.r.l. | LW325 激光直写系统 | |
| 掩模对准器 | HTG | 3HR | |
| AZ 400K 显影液 | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 硅橡胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | ||
| 25 mm 一号圆形玻璃盖玻片 | VWR international | 16004-310 | |
| 等离子体氧化仪 | Diener | Femto | |
| 钛片 Kamis | 公司 | 99.95% 纯度 | |
| 金颗粒 | Kamis Incorporated | 99.999% 纯度 | |
| 电子束蒸发仪 | Kurt J. Lesker | PVD 75 薄膜沉积系统 | 配备电子束附件 |
| 十六烷基硫醇 | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-巯基十一烷基)四(乙二醇) | Sigma-Aldrich | 674508 | |
| 乙醇 | Pharmco-AAPER | 111000200 | 200 证明，无水 |
| Parafilm 封口膜 | VWR international | 52858-000 | |
| DPBS | VWR international | 4500-434 | 不含钙和镁 |
| 小鼠层粘连蛋白 I | VWR international | 95036-762 | |
| 人血浆纤连蛋白 | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 羧酸琥珀酰亚胺酯 | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 羧酸琥珀酰亚胺酯 | Invitrogen | A-10168 | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Fisher Scientific | AB2034MI |
参考文献
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