笼锁化合物的光解能够产生快速且局部的多种生理活性化合物浓度升高。本文展示了如何获得膜片钳记录，并结合笼锁cAMP或笼锁Ca的光解，用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。
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摘要
摘要
笼锁化合物的光解可实现多种生理活性化合物浓度的快速、局部升高1. 笼锁化合物是一类通过化学“笼”结构使其生理活性暂时失活的分子，该“笼”结构可被一束紫外光脉冲打断而释放活性分子。本文介绍如何结合膜片钳记录与笼锁化合物光解技术，用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。嗅觉转导过程（图1）发生在嗅觉感觉神经元的纤毛中，当气味分子与受体结合后，引发cAMP水平升高，从而打开环核苷酸门控（CNG）通道2通过CNG通道的Ca²⁺内流可激活Ca²⁺依赖性Cl⁻通道。我们展示了如何从小鼠嗅上皮分离神经元3 以及如何通过光解笼锁cAMP来激活CNG通道或钙激活氯通道4 或笼锁Ca5. 我们使用闪光灯6,7 向纤毛区域施加紫外闪光以解笼cAMP或Ca，同时进行膜片钳记录，采用全细胞电压钳构型测量电流8-11.
方案
1. 仪器设备
- 为了测量嗅觉感觉神经元对笼锁化合物光解的反应，我们使用闪光灯结合典型的膜片钳记录系统，包括：膜片钳放大器、记录电极和连接到膜片钳放大器前端的参考电极、数据采集器、计算机、数据采集软件、显微操作器、落射荧光显微镜、灌流系统、防震台和法拉第笼（图2）。
- 为了产生高强度的紫外（UV）光脉冲，我们使用氙气闪光灯（Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit，图3A），其工作原理是通过短弧闪光管放电一个高电压电容器，该闪光管内充满氙气6-7。光脉冲可通过手动或计算机触发，使用与电生理信号采集相同的控制软件进行操作。
- 一个专为解笼应用优化的紫外短通滤光片（270–390 nm）被插入闪光灯的输出插槽中，一根石英光纤导光管连接至显微镜（见1.5）。
- 光脉冲的强度以及由此产生的光解程度可通过调节特定参数进行调整：
电压或电容6。实际上，光强与电容器中储存的能量相关，根据标准公式 0.5 CV2，其大小取决于电容值和电容器两端的电压。在我们闪光灯的前面板上可选择三种电容值（C1=1000 μF，C2=2000 μF，或 C3=3000 μF），电压可在100至385伏特之间调节（图3A），从而产生5至220焦耳范围内的储存能量。闪光持续时间在半峰全宽下为0.5至1毫秒，并随所选电容值而变化。在切换不同电容或降低电压前，必须通过选择闪光灯前面板上的放电模式对电容器进行放电（图3A）。
然而，由于气体放电的物理机制以及电路中随电能增加而出现的非线性损耗等多种因素，光能并不简单地与储存的电能成正比6。为测量单次闪光所对应的光能，可使用能量计，例如RappOptoElectronics提供的JM10型能量计。请注意，根据Rapp OptoElectronic闪光单元的用户手册，安装紫外滤光片后，石英导光管出口处的单次闪光能量约为1–15 mJ。
闪光灯单元配备有一个光电二极管组件（图3B），可用于估计光强随电容C和电压V的变化情况。实际上，光电二极管的输出信号与光强成正比。按照用户手册说明，将导光管连接至光电二极管组件的输入端，输出端则连接至示波器。图3C显示了在本实验所用闪光灯单元的三种电容值（C1、C2、C3）下，光电二极管峰值输出电压随施加电压的变化关系。随着闪光灯泡老化，这些数值会发生变化。定期使用光电二极管检测灯泡老化情况是一种良好的实验实践。
除了调节前面板上的电容或电压外，更精确且快速的光强控制方法是在闪光灯的第二个滤光片插槽中插入中性密度滤光片（图3A）。这种方法操作更快，且不会改变依赖于所选电容值的闪光持续时间。通过使用透光率从100%到0.1%的中性密度滤光片，可在大范围内快速调节闪光强度。 - 光脉冲通过石英光纤导光管引导至接种在玻璃底培养皿上的神经元（图2）。导光管通过适配器连接至倒置显微镜的落射荧光附件。修改后的滤光立方体中不包含激发滤光片，通过二向色镜将紫外光束引导至神经元。
- 光束通过100倍油浸物镜进行聚焦。通过将导光管插入提供可见连续光源的照明器中，可在显微镜上观察到闪光照射区域。图像（视频中以黄色表示）通过连接至显微镜的CCD相机在显示器上呈现。在显示器上绘制出照明区域的轮廓，以标定实验中紫外闪光的照射范围。在施加紫外闪光前，需将神经元的纤毛区域移至显示器上标记的区域内。
- 紫外光斑的尺寸由物镜放大倍数、导光管直径以及导光管在显微镜后端的位置共同决定。我们使用100倍油浸物镜。通过将照明器发出的光照射到放置在显微镜载物台上的微米尺上，测量圆形光斑的直径。在本实验装置中，当导光管直径分别为200、400、600或1250 μm时，光斑直径分别约为16、33、50或105 μm。
2. 溶液的配制
解剖
- 林格氏液：140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、10 mM 葡萄糖、1 mM 丙酮酸钠（用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.4）。
- 终止液：含 0.1 mg/ml BSA、0.3 mg/ml 亮抑蛋白酶肽和 0.02 mg/ml DNase I 的林格氏液。
- 无双价阳离子林格氏液：140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM HEPES、1 mM EDTA、10 mM 葡萄糖、1 mM 丙酮酸钠（用 1 M NaOH 调节 pH 至 7.4）。加入 200 μM 半胱氨酸和 2 U/ml 木瓜蛋白酶用于酶解离。
注意：用于解剖的溶液需经无菌过滤。
膜片钳记录溶液
细胞外溶液
- 细胞外Ringer溶液：140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸钠（用1 M NaOH调节pH至7.4）。
- 低钙Ringer溶液：140 mM NaCl、5 mM KCl、10 mM EGTA、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、10 mM葡萄糖、1 mM丙酮酸钠（用1 M NaOH调节pH至7.4）。
细胞内溶液
始终在昏暗的光线下配制和使用笼锁化合物溶液，以避免环境光导致笼锁化合物降解。使用铝箔包裹容器以避光。
笼锁型 cAMP：
- 配制一种细胞内溶液，其中包含 145 mM KCl、4 mM MgCl2、0.5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgATP 和 0.1 mM NaGTP（用 1 M KOH 调节 pH 至 7.4）。
- 将笼状 cAMP（BCMCM-cAMP4）溶于 DMSO 中，配制成 50 mM 的储备液。分装为每份 5 μl。于 -20°C 保存，最长可保存一年。
- 取一份笼状 cAMP 储备液，溶于细胞内溶液中，使笼状 cAMP 的终浓度为 50 μM。使用涡旋振荡器混匀。
- 将含笼状 cAMP 的细胞内溶液分装为每份 1 ml。于 -20°C 保存，最长可保存两个月，待用。
笼锁型 Ca：
我们制备含有3 mM DMNP-EDTA5 并以1.5 mM Ca负载50%的细胞内溶液。
- 配制一种细胞内溶液，其中含有 140 mM KCl（或 CsCl）、10 mM HEPES（用 1 M KOH 或 CsOH 调节 pH 至 7.4）。
- 打开一瓶 5 mg DMNP-EDTA，加入 52.8 μl 的 0.1 M 氯化钙标准溶液和 1 ml 细胞内溶液，使用涡旋振荡器混匀。
- 为避免环境光解笼化钙，将溶液转移至用铝箔避光的离心管中，再加入细胞内溶液至终体积为 3.5 ml，使用涡旋振荡器混匀。将笼化钙细胞内溶液分装成每份约 1 ml，于 -20°C 保存，可保存长达两个月，直至使用。
注意事项：实验过程中，使用铝箔避光保护笼锁化合物溶液，并将其置于冰上。 对细胞内溶液进行无菌过滤。
3. 小鼠嗅觉感觉神经元的解离
动物操作遵循意大利实验动物使用指南（1992年1月27日第116号立法令）和欧洲联盟动物研究指南（86/609/EEC号）。
- 准备三个涂有10 mg/ml刀豆蛋白A和10 mg/ml多聚-L-赖氨酸的玻璃底培养皿。
- 为解剖做准备，配制1 ml无二价阳离子的Ringer溶液。将两个50 mm涂有Sylgard的培养皿中加入Ringer溶液，并置于冰上。同时预冷木瓜蛋白酶-半胱氨酸混合液、0.5 ml终止液以及装有约10 ml Ringer溶液并带有0.22 μm滤器的注射器。
- 通过CO2窒息法处死小鼠，随后进行断头。去除覆盖颅骨的皮肤，沿下颌线剪开，将头部放入涂有Sylgard的培养皿中。
- 将培养皿置于体视显微镜下。使用解剖刀沿正中矢状面将头部一分为二。将其中一半头部翻转，使内侧面朝上。小心去除鼻中隔以暴露鼻甲（另见Cygnar et al., 201013）。
- 使用3号镊子和解剖刀，取下衬有嗅上皮的鼻甲组织，并转移至一个涂有Sylgard的培养皿中。
- 使用55号超细镊子，将嗅上皮组织从附着的鼻甲部分分离。将其转移至含有1 ml无二价阳离子Ringer溶液的离心管中。加入木瓜蛋白酶和半胱氨酸混合液。使用显微剪刀将上皮组织剪碎，在室温下孵育3分钟。再次用显微剪刀轻轻剪碎，继续孵育5分钟。
- 使用火焰抛光的巴斯德移液管，将组织转移至含有0.5 ml终止液的离心管中。
- 以300 g（1500 RPM）离心5分钟。弃去上清液，加入约1 ml过滤后的Ringer溶液。用火焰抛光的巴斯德移液管轻轻吹打重悬细胞。
- 将含有细胞的溶液约0.3 ml接种到三个玻璃底培养皿的中央。在+4°C下静置约1小时使细胞沉降，然后加入Ringer溶液。
4. 记录
- 使用硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片钳电极，当其充满细胞内液时，电阻应为 3-7 MΩ。
- 将一个含有分离的嗅觉感觉神经元的玻璃底培养皿置于倒置显微镜载物台上，并用任氏液持续灌流。
- 用铝箔包裹含有光笼合物的细胞内液注射器以避光，并将其置于冰箱中保存。操作时保持在弱光环境下，避免环境光导致光笼合物降解。
- 在 100 倍放大倍数下寻找具有完整纤毛的孤立嗅觉感觉神经元。移动显微镜载物台，使纤毛区域位于显示器上已绘制的圆圈内，以定位先前确定的紫外闪光区域。
- 使用柔性细针将含有光笼合物的细胞内液注入膜片钳电极中，并去除电极尖端的气泡。将电极插入膜片钳放大器头部的电极夹持器中。通过显微操作器将电极移向神经元胞体，施加轻柔负压以形成吉欧姆级封接。将电压设定为 -60 mV，并进一步施加负压，采用标准膜片钳技术进入全细胞记录模式12。
- 等待至少两分钟，使光笼合物扩散至纤毛区域。
- 在计算机上启动刺激程序并记录反应。使用 1 kHz 的低通滤波器，并以至少 2 kHz 的采样频率进行数字化采集。
- 典型的刺激程序将电压钳制在恒定值，同时触发闪光灯释放紫外闪光，以在纤毛区域进行光笼合物的光解反应。
5. 代表性结果：
应能够在分离的嗅觉感觉神经元的纤毛区域产生笼锁cAMP或笼锁Ca²⁺的局部解笼，同时在全细胞电压钳制模式下记录电流反应。
图4显示了在-60 mV电压下，使用细胞外低钙Ringer溶液时，由UV闪光引发cAMP笼锁化合物光解所产生的典型内向电流。在此条件下，内向电流由Na⁺通过CNG通道内流引起。电流的上升相迅速，可用单指数函数拟合，时间常数为3.4 ms。
图5A-B展示了另一种嗅觉感觉神经元在低钙溶液和含1 mM Ca的林格氏溶液中的反应。在-60 mV下，电流上升相明显变慢并呈现多相特征（图5 A-B）。这是由于Ca通过CNG通道进入纤毛并激活继发性Cl电流所致10。由于通透性Ca离子的阻断作用降低了总电流，因此在1 mM Ca林格氏溶液中，由CNG激活引起的较早阳离子电流成分比在低钙溶液中更小。
另一种减少纤毛内 Ca²⁺ 升高的方法是将神经元钳制在 +60 mV（图 5 C-D）。在 +60 mV 条件下，由 cAMP 解笼产生的反应上升相可很好地用单指数函数拟合，时间常数为 6.7 ms，表明仅存在一种电流组分。
通过在嗅觉感觉神经元的纤毛内光释放Ca，应能够测量到快速上升的电流。该电流由Cl离子携带。图6 A显示了在不同强度紫外光脉冲诱导下，笼锁Ca光释放所引起的-50 mV处的内向电流。Ca激活的Cl电流上升相可由单指数函数很好地拟合，时间常数介于3.8至5 ms之间（图6 B）。
图1. 嗅觉感觉神经元纤毛中的嗅觉转导。气味分子与气味受体（OR）结合，激活G蛋白，进而激活腺苷酸环化酶（ACIII），导致细胞内cAMP水平升高。cAMP打开环核苷酸门控（CNG）通道，允许Na⁺和Ca²⁺离子进入细胞。细胞内Ca²⁺浓度升高后激活Ca²⁺依赖性Cl⁻通道。可通过膜片移液管将笼锁型cAMP或笼锁型Ca²⁺引入纤毛。紫外光闪光可引发笼锁化合物的光解反应（修改自Pifferi et al. 20062，经许可）。
图2. 膜片钳记录与闪光光解系统。该装置包括膜片钳放大器、计算机、数据采集卡、落射荧光显微镜、氙灯闪光光源、CCD相机和显示器。蓝色和紫色线条分别表示可见光和紫外光的光路。
图 3. 氙气闪光灯。 （A）用于笼状化合物闪光光解的光源。（B）用于评估闪光强度的光电二极管模块。（C）将闪光灯的导光管连接至光电二极管的输入端，并在示波器上观察输出信号。在闪光灯前面板开关上选择三个可用电容值之一（C1、C2 或 C3），并通过旋转前面板旋钮调节电压。将光电二极管对不同闪光强度的响应输出电压，分别针对每个电容值作图：C1 = 1000 μF，C2 = 2000 μF，或 C3 = 3000 μF。实验中使用了直径为 600 μm 的导光管。
图 4. 在低细胞外 Ca 溶液中，对笼锁型 cAMP 光解反应的膜片钳记录。（A）在孤立的嗅觉感觉神经元中，由定位于纤毛的笼锁型 cAMP 光解诱导产生的全细胞电流响应。紫外光闪光在箭头所示时间释放。钳制电位为 -60 mV。（B）电流上升相通过单指数函数（虚线）拟合良好，时间常数为 3.4 ms。
图 5. 在低钙和任氏液中，由笼锁型 cAMP 光解诱导的电流反应。 （A）一个嗅觉感觉神经元浸没在含 1 mM 钙的任氏液或低钙溶液中，钳制电位为 -60 mV。在箭头所示时间施加紫外闪光。（B）在扩展的时间尺度上绘制的电流反应显示，在任氏液中上升相呈多相性，而在低钙溶液中记录的反应上升相则可很好地拟合为单指数函数（虚线），时间常数为 3.5 ms。（C）同一神经元（如 A 所示）浸没在任氏液中，在钳制电位为 -60 mV 和 +60 mV 时的电流反应。（D）在扩展的时间尺度上绘制的电流反应显示，在 -60 mV 时上升相为多相性，而在 +60 mV 时上升相可很好地由单指数函数拟合（虚线），时间常数为 6.7 ms。
图6. 钙笼合物光解的响应。 （A）在 -50 mV 下，通过光解钙笼合物诱导的全细胞电流。紫外闪光在箭头所示时间释放，闪光强度通过中性密度滤光片进行调节。（B）扩大时间尺度显示钙光释放后电流的快速上升。电流可被单指数函数（虚线）很好地拟合，时间常数分别为 5、4.8、3.8 ms。（经许可转载自 Boccaccio & Menini, 200710。）
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讨论
将笼锁化合物的闪光光解与膜片钳记录相结合，是一种用于在细胞内外实现生理活性分子浓度快速且局部跃升的有效技术。已有多种类型的笼锁化合物被合成，该技术可应用于多种类型的细胞，包括培养细胞——这些细胞表达的离子通道可被某些可用的笼锁化合物经光解后激活或调节11。
笼锁化合物的光解需要高强度的近紫外光脉冲，以便在短时间内释放足量的分子。可使用多种光源：通过快门控制并耦合到显微镜落射荧光端口的连续工作汞灯或氙灯弧光灯、氙闪光灯、紫外激光器，以及近年来发展的高功率紫外发光二极管（LED）。不同类型的光源根据具体应用和设备成本各有优缺点。与闪光灯相比，连续工作的光源光强较低，因此需要通过快门控制延长光照脉冲时间至数百毫秒，才能释放足够数量的游离分子。紫外激光器价格昂贵。用于闪光光解的高功率紫外LED14目前已可商业化获得，可能成为其他方法的良好替代方案。然而，闪光灯的一个优势在于其发射光谱比紫外LED更宽，因而可适用于多种具有不同光谱特性的笼锁化合物。在本研究的应用中，使用氙闪光灯进行解笼的主要优点包括：良好的时间分辨率，光脉冲持续时间约为1 ms；宽...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 适配器模块闪光灯连接显微镜 | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| 气浮台 | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| 数字化仪 | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| 数据采集软件 | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| 数据分析软件 | WaveMetrics | Igor | |
| 适配器模块用反射镜 | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| 电极夹持器 | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| 法拉第’s笼 | 定制 | ||
| 滤光片组 | Olympus Corporation | U-MWU | 已移除激发滤光片 |
| 闪光灯 | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| 镊子 Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| 玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| 玻璃底培养皿 | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| 照明器 | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| 倒置显微镜 | Olympus Corporation | IX70 | |
| 微操纵器 | Luigs & Neumann | SM I | |
| 微电极拉制仪 | Narishige International | PP-830 | |
| 显示器 | HesaVision | MTB-01 | |
| 中性密度滤光片 | Omega Optical | 不同规格 | |
| 物镜 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Zeiss 或 Olympus 均可 |
| 物镜 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Zeiss 或 Olympus 均可 |
| 光学紫外短通滤光片 | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| 膜片钳放大器 | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| 光电二极管组件 | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| 石英导光管 | Rapp OptoElectronic | 不同规格 | 我们使用直径为 600 μm 的导光管 |
| 银丝 | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| 银接地颗粒 | Warner Instruments | 64-1309 | |
| 氙弧灯 | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| 试剂 | 公司 | 目录号 | |
| BCMCM-笼锁cAMP | BioLog | B016 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl₂标准溶液 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| 笼锁Ca：DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| 半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| 刀豆球蛋白A V型（ConA） | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl₂ | Fluka | 63020 | |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | P2256 |
参考文献
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- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
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- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
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