嗅觉感觉神经元纤毛中笼锁化合物的闪光光解

摘要

笼锁化合物的光解能够产生快速且局部的多种生理活性化合物浓度升高。本文展示了如何获得膜片钳记录，并结合笼锁cAMP或笼锁Ca的光解，用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。

摘要

笼锁化合物的光解可实现多种生理活性化合物浓度的快速、局部升高¹. 笼锁化合物是一类通过化学“笼”结构使其生理活性暂时失活的分子，该“笼”结构可被一束紫外光脉冲打断而释放活性分子。本文介绍如何结合膜片钳记录与笼锁化合物光解技术，用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。嗅觉转导过程（图1）发生在嗅觉感觉神经元的纤毛中，当气味分子与受体结合后，引发cAMP水平升高，从而打开环核苷酸门控（CNG）通道²通过CNG通道的Ca²⁺内流可激活Ca²⁺依赖性Cl⁻通道。我们展示了如何从小鼠嗅上皮分离神经元³ 以及如何通过光解笼锁cAMP来激活CNG通道或钙激活氯通道⁴ 或笼锁Ca⁵. 我们使用闪光灯^6,7 向纤毛区域施加紫外闪光以解笼cAMP或Ca，同时进行膜片钳记录，采用全细胞电压钳构型测量电流^8-11.

方案

1. 仪器设备

1. 为了测量嗅觉感觉神经元对笼锁化合物光解的反应，我们使用闪光灯结合典型的膜片钳记录系统，包括：膜片钳放大器、记录电极和连接到膜片钳放大器前端的参考电极、数据采集器、计算机、数据采集软件、显微操作器、落射荧光显微镜、灌流系统、防震台和法拉第笼（图2）。
2. 为了产生高强度的紫外（UV）光脉冲，我们使用氙气闪光灯（Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit，图3A），其工作原理是通过短弧闪光管放电一个高电压电容器，该闪光管内充满氙气^6-7。光脉冲可通过手动或计算机触发，使用与电生理信号采集相同的控制软件进行操作。
3. 一个专为解笼应用优化的紫外短通滤光片（270–390 nm）被插入闪光灯的输出插槽中，一根石英光纤导光管连接至显微镜（见1.5）。
4. 光脉冲的强度以及由此产生的光解程度可通过调节特定参数进行调整：
   电压或电容⁶。实际上，光强与电容器中储存的能量相关，根据标准公式 0.5 CV²，其大小取决于电容值和电容器两端的电压。在我们闪光灯的前面板上可选择三种电容值（C1=1000 μF，C2=2000 μF，或 C3=3000 μF），电压可在100至385伏特之间调节（图3A），从而产生5至220焦耳范围内的储存能量。闪光持续时间在半峰全宽下为0.5至1毫秒，并随所选电容值而变化。在切换不同电容或降低电压前，必须通过选择闪光灯前面板上的放电模式对电....

讨论

将笼锁化合物的闪光光解与膜片钳记录相结合，是一种用于在细胞内外实现生理活性分子浓度快速且局部跃升的有效技术。已有多种类型的笼锁化合物被合成，该技术可应用于多种类型的细胞，包括培养细胞——这些细胞表达的离子通道可被某些可用的笼锁化合物经光解后激活或调节¹¹。

笼锁化合物的光解需要高强度的近紫外光脉冲，以便在短时间内释放足量的分子。可使用多种光源：通过快门控制并耦合到显微镜落射荧光端口的连续工作汞灯或氙灯弧光灯、氙闪光灯、紫外激光器，以及近年来发展的高功率紫外发光二极管（LED）。不同类型的光源根据具体应用和设备成本各有优缺点。与闪光灯相比，连续工作的光源光强较低，因此需要通过快门控制延长光照脉冲时间至数百毫秒，才能释放足够数量的游离分子。紫外激光器价格昂贵。用于闪光光解的高功率紫外LED¹⁴目前已可商业化获得，可能成为其他方法的良好替代方案。然而，闪光灯的一个优势在于其发射光谱比紫外LED更宽，因而可适用于多种具有不同光谱特性的笼锁化合物。在本研究的应用中，使用氙闪光灯进行解笼的主要优点包括：良好的时间分辨率，光脉冲持续时间约为1 ms；宽.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
适配器模块闪光灯连接显微镜	Rapp OptoElectronic	FlashCube 70
气浮台	TMC	MICRO-g 63-534
数字化仪	Axon Instruments	Digidata 1322A
数据采集软件	Axon Instruments	pClamp 8
数据分析软件	WaveMetrics	Igor
适配器模块用反射镜	Rapp OptoElectronic	M70/100
电极夹持器	Axon Instruments	1-HL-U
法拉第’s笼	定制
滤光片组	Olympus Corporation	U-MWU	已移除激发滤光片
闪光灯	Rapp OptoElectronic	JML-C2
镊子 Dumont #55	World Precision Instruments, Inc.	14099
玻璃毛细管	World Precision Instruments, Inc.	PG10165-4
玻璃底培养皿	World Precision Instruments, Inc.	FD35-100
照明器	Olympus Corporation	Highlight 3100
倒置显微镜	Olympus Corporation	IX70
微操纵器	Luigs & Neumann	SM I
微电极拉制仪	Narishige International	PP-830
显示器	HesaVision	MTB-01
中性密度滤光片	Omega Optical	不同规格
物镜 100X	Carl Zeiss, Inc.	Fluar 440285	Zeiss 或 Olympus 均可
物镜 100X	Olympus Corporation	UPLFLN 100XOI2	Zeiss 或 Olympus 均可
光学紫外短通滤光片	Rapp OptoElectronic	SP400
膜片钳放大器	Axon Instruments	Axopatch 200B
光电二极管组件	Rapp OptoElectronic	PDA
石英导光管	Rapp OptoElectronic	不同规格	我们使用直径为 600 μm 的导光管
银丝	World Precision Instruments, Inc.	AGT1025
银接地颗粒	Warner Instruments	64-1309
氙弧灯	Rapp OptoElectronic	XBL-JML
试剂	公司	目录号
BCMCM-笼锁cAMP	BioLog	B016
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A8806
CaCl₂标准溶液 0.1 M	Fluka	21059
笼锁Ca：DMNP-EDTA	Invitrogen	D6814
半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C9768
刀豆球蛋白A V型（ConA）	Sigma-Aldrich	C7275
CsCl	Sigma-Aldrich	C4036
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
KOH	Sigma-Aldrich	P1767
亮抑蛋白酶肽	Sigma-Aldrich	L0649
MgCl₂	Fluka	63020
木瓜蛋白酶	Sigma-Aldrich	P3125
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P1274
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881
丙酮酸钠	Sigma-Aldrich	P2256