笼锁化合物的光解能够产生快速且局部的多种生理活性化合物浓度升高。本文展示了如何获得膜片钳记录,并结合笼锁cAMP或笼锁Ca的光解,用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。
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笼锁化合物的光解能够产生快速且局部的多种生理活性化合物浓度升高。本文展示了如何获得膜片钳记录,并结合笼锁cAMP或笼锁Ca的光解,用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。
笼锁化合物的光解可实现多种生理活性化合物浓度的快速、局部升高1. 笼锁化合物是一类通过化学“笼”结构使其生理活性暂时失活的分子,该“笼”结构可被一束紫外光脉冲打断而释放活性分子。本文介绍如何结合膜片钳记录与笼锁化合物光解技术,用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。嗅觉转导过程(图1)发生在嗅觉感觉神经元的纤毛中,当气味分子与受体结合后,引发cAMP水平升高,从而打开环核苷酸门控(CNG)通道2通过CNG通道的Ca²⁺内流可激活Ca²⁺依赖性Cl⁻通道。我们展示了如何从小鼠嗅上皮分离神经元3 以及如何通过光解笼锁cAMP来激活CNG通道或钙激活氯通道4 或笼锁Ca5. 我们使用闪光灯6,7 向纤毛区域施加紫外闪光以解笼cAMP或Ca,同时进行膜片钳记录,采用全细胞电压钳构型测量电流8-11.
1. 仪器设备
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将笼锁化合物的闪光光解与膜片钳记录相结合,是一种用于在细胞内外实现生理活性分子浓度快速且局部跃升的有效技术。已有多种类型的笼锁化合物被合成,该技术可应用于多种类型的细胞,包括培养细胞——这些细胞表达的离子通道可被某些可用的笼锁化合物经光解后激活或调节11。
笼锁化合物的光解需要高强度的近紫外光脉冲,以便在短时间内释放足量的分子。可使用多种光源:通过快门控制并耦合到显微镜落射荧光端口的连续工作汞灯或氙灯弧光灯、氙闪光灯、紫外激光器,以及近年来发展的高功率紫外发光二极管(LED)。不同类型的光源根据具体应用和设备成本各有优缺点。与闪光灯相比,连续工作的光源光强较低,因此需要通过快门控制延长光照脉冲时间至数百毫秒,才能释放足够数量的游离分子。紫外激光器价格昂贵。用于闪光光解的高功率紫外LED14目前已可商业化获得,可能成为其他方法的良好替代方案。然而,闪光灯的一个优势在于其发射光谱比紫外LED更宽,因而可适用于多种具有不同光谱特性的笼锁化合物。在本研究的应用中,使用氙闪光灯进行解笼的主要优点包括:良好的时间分辨率,光脉冲持续时间约为1 ms;宽.......
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 适配器模块闪光灯连接显微镜 | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| 气浮台 | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| 数字化仪 | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| 数据采集软件 | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| 数据分析软件 | WaveMetrics | Igor | |
| 适配器模块用反射镜 | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| 电极夹持器 | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| 法拉第’s笼 | 定制 | ||
| 滤光片组 | Olympus Corporation | U-MWU | 已移除激发滤光片 |
| 闪光灯 | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| 镊子 Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| 玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| 玻璃底培养皿 | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| 照明器 | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| 倒置显微镜 | Olympus Corporation | IX70 | |
| 微操纵器 | Luigs & Neumann | SM I | |
| 微电极拉制仪 | Narishige International | PP-830 | |
| 显示器 | HesaVision | MTB-01 | |
| 中性密度滤光片 | Omega Optical | 不同规格 | |
| 物镜 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Zeiss 或 Olympus 均可 |
| 物镜 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Zeiss 或 Olympus 均可 |
| 光学紫外短通滤光片 | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| 膜片钳放大器 | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| 光电二极管组件 | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| 石英导光管 | Rapp OptoElectronic | 不同规格 | 我们使用直径为 600 μm 的导光管 |
| 银丝 | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| 银接地颗粒 | Warner Instruments | 64-1309 | |
| 氙弧灯 | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| 试剂 | 公司 | 目录号 | |
| BCMCM-笼锁cAMP | BioLog | B016 | |
| 牛血清白蛋白(BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl₂标准溶液 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| 笼锁Ca:DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| 半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| 刀豆球蛋白A V型(ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl₂ | Fluka | 63020 | |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | P2256 |
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