自体血管内皮祖细胞接种技术及心血管器械在大型动物模型中的生物相容性测试

摘要

介绍了一种在钛基血液接触性生物材料上接种自体细胞并检测其生物相容性的方法。该方法利用内皮祖细胞和钛管，在将钛管植入猪腔静脉后的数分钟内完成细胞接种。该技术可适用于多种其他可植入式 biomedical 设备。

摘要

植入式心血管器械由人工材料（如钛（Ti）、膨体聚四氟乙烯）制造，存在形成血栓栓塞的风险^1,2,3我们开发了一种利用自体血液来源的人或猪内皮祖细胞（EPCs）衬覆钛管内表面的方法⁴通过将含有融合猪内皮祖细胞（EPCs）层的钛管植入猪的下腔静脉（IVC），我们在大型动物模型的促血栓环境中测试了细胞接种表面的改善生物相容性，并将其与未经修饰的裸金属表面进行比较^5,6,7 (图1该方法可用于在植入后数分钟内实现装置的内皮化，并检测其抗血栓功能 体内.

从50公斤重的约克夏猪获取外周血，并培养其单个核细胞组分以分离内皮祖细胞^4,8。将钛管（内径9.4 mm）预先切割成三段长4.5 cm的纵向切片，并用热缩管重新组装。构建了一种接种装置，可实现钛管的缓慢旋转。

我们对猪进行了剖腹手术，并将肠管和膀胱外置。采用锐性与钝性分离技术，从下腔静脉（IVC）分叉处远端至右肾动脉近端进行游离。随后将钛管（Ti管）填充含荧光标记的自体EPC悬液，并以10转/小时旋转30分钟，以实现细胞均匀包被⁹。在给予100 USP/kg肝素后，夹闭下腔静脉两端及一条腰静脉。行4 cm静脉切开术，插入装置并用磷酸盐缓冲液充满。在用4-0 Prolene连续缝合关闭静脉切口的同时，松开一侧夹钳以排出下腔静脉内的空气。手术结束时，用0号PDS（聚对二氧环己酮缝线）缝合筋膜，2-0 Vicryl缝合皮下组织，皮肤则用缝钉闭合。

3至21天后，处死猪，整体取出装置并进行固定。拆卸钛管后，用荧光显微镜观察其内表面。

我们发现，未处理的金属钛管完全闭塞，而接种了内皮祖细胞（EPC）的管腔则保持通畅。此外，我们能够证实EPC在管腔内侧的血液接触表面形成了融合的单层细胞层。

总之，我们的技术可在植入后几分钟内利用自体EPC使钛管内皮化，从而防止装置发生血栓。我们的手术方法能够以最少的血液流失和EPC接种表面的损伤，来检测此类修饰装置的生物相容性改善效果。

方案

1. 内皮祖细胞的分离

1. 在内皮祖细胞（EPC）接种导管植入前30天，准备一支60 ml注射器，加入15 ml抗凝剂枸橼酸右旋糖酐溶液，并连接三通阀，用于从猪外周血中分离EPC。采血前24小时，用I型大鼠胶原（50 μg/ml，溶于0.02 N乙酸溶液）预包被两块12孔板。⁴.
2. 所有动物饲养和实验操作均须遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的规定，并在获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准后方可进行。
3. 使用 Acepromazine（1.1 mg/kg）和 Ketamine（22 mg/kg）通过 19 G 蝶形针经肌内注射对一头雌性约克夏猪（45 kg）进行镇静。
4. 使用气管插管（长度30 cm，内径8 mm）对猪进行插管，并通过面罩以潮气量4.5 %的异氟烷麻醉猪。
5. 在手术过程中通过监测血氧饱和度、心率和体温来监控猪的生理状态。使用自动加热手术台和加热毯，并对输注液体进行加温，以维持体温调节。
6. 将猪仰卧位固定于手术台上，将其后肢向尾外侧方向固定，用氯己定清洁，随后使用DuraPrep进行消毒。然后对手术区域进行铺巾。
7. 在可触及的股动脉搏动处内侧（位于股内侧肌内侧和缝匠肌外侧），使用5 F微穿刺套件中的21 G × 7 cm穿刺针穿入股静脉，采用Seldinger技术行静脉插管。将已准备好的60 ml注射器连接至血管内导管，抽取45 ml血液。
8. 对血管穿刺部位施加压力以止血（5 分钟），停止麻醉并使猪苏醒。动物需监测至完全恢复后送回其笼中。
9. 用不含 CaCl 的 Hank's 平衡盐溶液将血液样本按 1:1 比例稀释₂，MgCl₂，MgSO₄₄) 并加入等体积的 Histopaque 以形成清晰的分层。离心（30 分钟，740 g，低刹车设置），收集单个核细胞（MNC）层。将 MNC 重悬并用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 3 次（每次 10 分钟，515 g），随后将细胞接种至两块 12 孔板中，加入完全生长培养基（EBM-2 培养基含 2% 猪血清（PS）和 EGM-2 SingleQuots），于 37°C、5% CO₂ 条件下培养₂.
10. 在最初7天内每24小时缓慢更换培养基，之后每隔一天更换一次。在平均培养时间后鉴定EPC集落
    7天图2).
11. 当内皮祖细胞（EPCs）覆盖12孔板表面积的1/4时，在培养中进行扩增。通过流式细胞术检测表面标志物CD31的表达以及CD14和CD45的缺失，以确认EPCs的身份。其他可进行的检测包括细胞形态学观察以及在流体剪切应力作用后检测一氧化氮III活性。⁴.

2. 钛管组件

1. 在立式铣床上，使用安装在锯轴上的72齿高速钢切槽锯片，将一根钛管沿纵向均分为三个120度的等分段（每段长4.5 cm）。切割时转速保持在300 RPM，并在整个切割过程中持续用Tap Magic切削液充分润湿切割区域（图3）。
2. 使用台式砂轮机和Scotch-Brite金属研磨轮对钛管内表面进行抛光，然后用手持方式使用3M砂布进一步打磨，以使表面更加平滑均匀，去除所有可见的凹坑。
3. 先用Alconox洗涤剂溶液清洗钛部件，随后将其浸入王水（浓硝酸与浓盐酸按1:3体积比配制）中5分钟，再用数升去离子水彻底冲洗¹⁰。务必极度小心，王水具有强腐蚀性，且可能引发爆炸！
4. 将钛片在Alconox洗涤剂溶液中超声清洗16分钟，用去离子水冲洗30次，再在去离子水中超声清洗16分钟。随后置于层流罩中自然干燥。
5. 将PVC热缩管裁剪为4.5 cm长，并按照2.4节方法进行彻底清洁。
6. 用镊子将3个已清洁的钛片放置于支撑芯轴（由铝材加工而成，外径8.5 mm）上，并将一段PVC热缩管套在钛片外部（图4）。使用热风枪加热热缩管，同时旋转芯轴，使热缩管均匀收缩，紧密包裹钛片。

3. 接种装置及组件组装

1. 将硅胶管分别切割为2.5 cm和3.5 cm的长度。
2. 在5 cc塑料注射器的0.8 ml刻度处截断，保留带有鲁尔接头的一端作为“头部部件”。
3. 按照2.4节所述方法，通过超声处理彻底清洗两段硅胶管、注射器“头部部件”以及鲁尔帽。
4. 将硅胶管分别连接至2.5节组装好的钛管两端，每端延伸超出PVC管5 mm。
5. 将注射器“头部部件”的切割端插入较短的硅胶管中，使其与钛管紧密接触（图5）。
6. 将组装完成的钛管组件用鲁尔帽密封后装入特卫强袋中，并使用环氧乙烷气体灭菌（55°C下18小时）。
7. 将一台同步定时电机（10 RPH）安装在有机玻璃平台上，并将其轴连接至一个注射器夹持器（由铝材加工而成，适配5 cc注射器）（图6）。

4. 内皮祖细胞接种于钛管内表面

1. 将按1.中所述分离的EPCs扩增至3个汇合的T-75培养瓶（或至少9 × 10⁶个细胞）。
2. 手术当天，使用长效荧光染料（PKH26）¹¹对细胞进行标记。首先用无血清培养基冲洗培养的EPCs两次。标记过程中及标记后需注意避免光照，以保护细胞。
3. 在室温下用4 μM PKH26溶于稀释液C（染料溶液）中覆盖细胞，孵育4分钟。
4. 加入与染料溶液体积相等的猪血清以终止标记反应。1分钟后，用完全生长培养基将混合溶液按1:1比例稀释。
5. 吸除液体，并用完全生长培养基冲洗细胞3次。
6. 用DPBS（不含CaCl₂、MgCl₂）洗涤EPCs两次。
7. 加入胰蛋白酶覆盖细胞，在37°C孵育3分钟，并在光学显微镜下确认细胞脱落。加入相当于所用胰蛋白酶体积两倍的胰蛋白酶中和液。
8. 将细胞悬液合并至同一离心管中，通过移液混匀。取10 μl细胞悬液加入血细胞计数板两侧进行细胞计数。
9. 离心细胞悬液（1500 RPH，5分钟）。计数后，将细胞沉淀重悬于无血清培养基中，浓度为2–2.5 × 10⁶ EPCs/mL。注意填充管组件所需的最小体积为4.5 mL。
10. 在生物安全柜内铺设无菌巾以建立无菌区域。将经气体灭菌的Ti管组件和额外的5 mL注射器打开并置于无菌区域内。
11. 戴无菌手套，将5 mL注射器的活塞取出并保留在无菌区内以备后续使用。将鲁尔帽连接至该注射器上。
12. 将4.9中所述的4.5–5 mL EPC悬液用移液器加入打开的注射器筒内。将活塞牢固地重新插入注射器开口端。
13. 手持注射器使鲁尔帽朝上，取下帽盖。将注射器以鲁尔端先插入Ti管组件的开放硅胶管中直至紧密贴合；切勿进一步推入Ti管内部。
14. 缓慢推动注射器活塞，直至细胞悬液上升至截断的注射器“头端”顶部，以排除系统中的气泡。用鲁尔帽封闭，并将整个组件插入无菌护套中，用胶带密封开口端。
15. 将整个组件插入3.7中的机械注射器支架内。放入37°C培养箱中，并调节平台，使接种室的Ti管部分保持水平，使用水平仪进行校准（图6）。
16. 在植入前让Ti管组件旋转30分钟。

5. 将钛管植入猪下腔静脉

1. 手术前24小时，使用芬太尼透皮贴剂（100 μg/hr；贴剂持续使用72小时）对供体猪（EPCs来源猪）进行术前用药。
2. 术前一晚禁食禁水，并在手术当天开始术前给予拜耳锐（恩诺沙星）（5 mg/kg，肌内注射），此后每24小时给药一次，连续使用7天，作为抗生素预防。
3. 按照1.3所述方法对猪进行镇静、气管插管和麻醉（潮气量10–15 ml/kg），并将猪仰卧位固定于手术台上。术中持续监测血氧饱和度、心率和体温。使用自动加热手术台和加热毯维持体温，并对输注液体进行加温以维持体温调节。
4. 在猪耳缘静脉插入18 G静脉导管，并使用Vetropolycin眼药膏保护猪的眼睛。
5. 按照1.6的方法清洁、准备并铺巾猪的腹部区域。使用#15手术刀片沿腹中线切开，从第二对乳腺向前至倒数第二对乳腺向后。
6. 使用电凝设备逐层分离至腹膜筋膜层。
7. 用蚊式钳提起腹膜，用梅岑鲍姆剪刀小心切开。
8. 将膀胱外翻，于膀胱壁上缝置3-0薇乔荷包缝线。在其中央做一小切口，插入16 F Foley导尿管。术中静脉输注乳酸林格液，调节尿量至>/= 1 ml/kg/hr。
9. 随后将小肠和大肠外翻，放置两个巴尔弗手术拉钩以暴露腹膜腔后部，辨认下腔静脉（IVC）。
10. 使用锐性与钝性分离技术，小心地将下腔静脉从周围组织中游离，从右肾动脉近端至下腔静脉分叉远端进行血管骨骼化。在分离下腔静脉时需格外小心，因即使微小的血管破损也可能导致快速大出血及动物失血性死亡。
11. 结扎下腔静脉段的所有侧支血管，以确保植入钛管周围无出血。注意通常存在两条较大的腰静脉后支，需仔细分离并结扎。此外，需注意在下腔静脉分叉近端后内侧常有一条较大的腰静脉，必须小心游离，并使用血管环控制，为后续钳夹做好准备。
12. 同时按照4.所述步骤进行钛管的细胞接种。
13. 在夹闭下腔静脉前立即给予肝素100 USP/kg。先在下腔静脉远端及腰静脉处以45度角放置血管钳，随后在近端放置血管钳。
14. 使用#11手术刀片在近端与远端血管钳之间做纵向静脉切开（4 cm），再用Potts剪刀扩大切口。
15. 清除下腔静脉内的血液，并用无菌DPBS冲洗其管腔。
16. 将接种了EPC的钛管（或裸金属对照管）插入下腔静脉，并用含CaCl₂和MgCl₂的DPBS充满管腔，以防止细胞干燥并排除空气。
17. 使用4-0 Prolene连续缝合关闭静脉切口，松开近端一个血管钳，通过少量反向出血排出下腔静脉内空气。在静脉壁与PVC导管之间缝置“固定缝线”，以防止植入物随时间发生移位。
18. 使用O-PDS缝线在CT针上缝合筋膜层，使用2-0薇乔缝线（连续缝合）缝合皮下组织，皮肤使用钉皮器闭合。
19. 沿切口皮下注射最多20 ml的0.25% Marcaine（布比卡因），并用纱布和Tegaderm敷料覆盖伤口。根据需要皮下注射氟尼辛（2.2 mg/kg，每24小时一次）和氧吗啡酮（0.15 mg/kg，每3–4小时一次）以控制疼痛。
20. 停止麻醉，监测猪直至清醒后送回笼中。每日两次观察猪是否有痛苦或不适迹象、能否站立和行走、排便及排尿情况，以及皮肤颜色是否提示正常灌注。

6. 钛管的取出

1. 3 周后，按照 1.3 - 1.4 中所述方法对猪进行镇静、插管和麻醉。
2. 按照 5.5 - 5.8 中所述方法进行剖腹手术。
3. 注意瘢痕将遮盖植入部位，但可触诊到原位的刚性钛管（Ti tube）in situ。
4. 按照 5.9 - 5.11 中所述方法游离下腔静脉（IVC），并用大型剪刀将钛管连同周围下腔静脉整块切除。
5. 使用 Euthasol 安乐死溶液（390 mg/ml 戊巴比妥钠和 50 mg/ml 苯妥英钠，剂量为 1 ml / 10 磅）对动物实施安乐死。

7. 钛内表面的固定与成像

1. 用Ti管在DPBS溶液中冲洗切除的静脉段，并用高分辨率数码相机拍摄其管腔（通畅或闭塞）照片（图7）。
2. 随后将样本浸入3.7%多聚甲醛中固定，时间不少于15分钟。再用DPBS溶液冲洗样本。
3. 极为小心地切开静脉周围组织及PVC管，打开Ti管。将3个样本段置于荧光显微镜下，使内表面朝向物镜/光源，在550 nm激发波长下成像，以观察呈红色/橙色的PKH26标记的EPCs（图8A）。如需要，可对细胞进行进一步染色（例如，血小板内皮细胞黏附分子（PECAM）染色以显示细胞边界（图8B）、DAPI染色以显示细胞核等）。

8. 代表性结果：

在执行本方案后，医生和科研人员能够在大动物模型中利用自体血液来源的内皮祖细胞对实心管状结构进行内皮化。图2显示，采用本方法分离的内皮祖细胞在培养约7天后呈现为具有鹅卵石样形态的细胞集落。如图5和图6所示，我们设计的接种装置可使装有内皮祖细胞悬液的钛管缓慢旋转，从而在无菌条件下实现细胞对管腔内表面的均匀覆盖⁹。

我们的植入手术可用于在大型动物模型中测试生物材料（如钛）发生血栓形成的风险。我们发现，猪对该手术耐受良好，且该植入过程仅造成极少的失血，不会破坏内皮祖细胞层。

图7显示，裸露的钛管完全发生闭塞，而我们的EPC衬覆管即使在下腔静脉的促血栓形成低剪切环境中仍保持通畅。此外，荧光标记细胞形成的融合层的存在证实了该方法的成功，如图8所示。

图1. 自体血管内皮祖细胞（EPC）接种实验示意图。首先，从一头猪体内采集外周血。随后，从血液中分离EPC并在体外进行扩增。接着，将EPC用于包被钛（Ti）管装置，然后通过手术将该装置植入提供细胞的同一头猪的下腔静脉中。

图 2. 体外培养的内皮祖细胞（EPCs）代表性克隆，约在分离操作后 7 天（使用配备成像相机和 QCapture 软件的倒置 Leica DMIL 显微镜拍摄）。

图3. 钛管段在组装前的状态。将钛管沿纵向切成三个等长的部分，然后截成4.5 cm的长度。使用台式砂轮机和砂布对钛管段的内表面进行抛光，以去除可见的凹坑。

图 4. 使用PVC热缩管（蓝色）和热风枪组装钛管段。钛管段支撑在精密加工的铝制芯轴上，芯轴贯穿钛管段，且尺寸与钛管内径相匹配。

图5. 钛管组件，显示所有部件：鲁尔帽、注射器“头部件”、硅胶管以及带PVC包裹（蓝色）的钛管。该组件在灭菌用于手术前完成组装。

图6. 培养箱内的钛管接种装置，显示电机、平台、加工成型的铝制注射器支架、钛管组件和5 cc注射器。注意：为便于观察，图中组件未显示保护性无菌护套。

图7. 植入手术的代表性大体结果。(A) 在猪下腔静脉（IVC）植入后，对照组裸金属钛管的端面观。管腔被固体血栓完全阻塞。(B) 内皮祖细胞（EPC）接种钛管植入后的端面观。管腔完全通畅且清晰。(C) 植入3天后对照组（裸）钛管的剖开视图，显示血栓形成范围（实验最长持续至3周，结果相同）。

图8. 内皮祖细胞（EPCs）在钛管表面植入3天后的观察结果（使用Leica DMRB直立显微镜、QImaging QICAM黑白数字相机及Image Pro Plus软件成像）。(A) 表面融合生长的细胞，显示术前PKH26标记。 (B) EPCs形成的融合层。红色：术前PKH26标记；绿色：EPCs的PECAM染色。

讨论

本文介绍的细胞接种钛管方法可使医生和科研人员快速且均匀地实现可植入器械血液接触表面的内皮化。由于我们从外周血样本中分离并扩增内皮祖细胞（EPCs），因此无需通过重大侵入性操作来获取这些细胞。此外，EPCs为自体来源，从而消除了对细胞接种植入物产生任何免疫反应的风险。本方案中展示的原理不仅可用于钛管，还可应用于心血管医学中使用的多种其他生物材料。

本方案中的关键步骤包括对钛管进行细致的清洗，因为我们发现任何残留的污染物薄膜都会影响细胞的贴附。此外，在接种过程中，缓慢的旋转速度（与管径成反比）至关重要，以确保内皮祖细胞能够随着钛管的移动缓慢沉降并贴附于表面。

我们采用在植入前立即接种的方法，避免了不切实际的操作 离体 培养时间；细胞单独贴壁，随后形成融合的单层细胞层 体内，避免在血流恢复后立即发生栓塞。我们先前的研究表明，一旦内皮祖细胞（EPCs）生长形成融合单层，便会分泌细胞外基质并牢固黏附其上，从而进一步最大限度地减少内皮细胞片脱落的可能性。尽管仍不能完全排除栓塞性脱落的风险，但其风险似乎远低于该疗法旨在预防的整个装置表面血栓形成的问题。

将植入物置入低剪切力、促血栓形成的下腔静脉环境，是研究器械血液相容性和血栓形成最为可靠的大型动物模型之一^5,6。请注意，所有动物护理和实验均依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，并在获得杜克大学机构动物护理与使用委员会批准后实施。

为了成功利用该植入方法测试生物材料和器械，必须耐心地剥离下腔静脉（IVC）节段并结扎所有静脉分支血管，为器械植入做好准备，以确保器械周围无“假腔”来源的出血。另一步骤至关重要，即向器械管腔内加入DPBS，以保证在关闭静脉切口及开始再灌注之前，管腔内表面的细胞保持湿润。如果在原植入位置未能找到该器械，则可能已沿下腔静脉“上游”迁移。可通过将缝线（4-O Prolene）穿过静脉壁及PVC管的一段2–3 mm区域，将管体牢固锚定于当前位置，从而防止此情况发生。若研究人员在取出后于原本通畅的管腔中难以发现图8所示的荧光预标记细胞，则可能是细胞以完整片层形式脱落所致。为避免此现象，可在将静脉与管体一同固定后，轻柔解剖周围静脉组织，并小心拆解3个钛管部分。

我们的技术通过内皮祖细胞接种为预防心血管器械血栓形成提供了概念验证。该技术可用于开发内衬患者自体内皮祖细胞的“生物源性”植入物。我们在猪动物模型中开展的可行性研究为将这种“个性化医疗”转化为临床实践迈出了第一步。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰丙嗪	Boehringer Ingeheim	BIC670025	NAC# 10280002
Alconox 粉末精密清洁剂	Alconox, Inc.	1104
Balfour 外科牵开器	Adler	N/A
拜耳灵	Bayer AG	APVMA 46028/0705
蝶形针（19G）	Terumo Medical Corp.	SV19CLK
氯己定	3M	9200
钳子（45度）	Aesculap	FC339T
DPBS (-/-)	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
DPBS (+/+)	GIBCO, by Life Technologies	14040-133
DuraPrep	3M	8635
EBM-2 培养基	Lonza Inc.	CC-3156	无血清和完全生长培养基的基础成分
EGM-2 SingleQuots	Lonza Inc.	CC-3162	与 EBM-2 联用，用于无血清和完全生长培养基
电灼器	Valleylab	SurgII-20
砂布	3M	60-0700-0425-8	240 目
Euthasol 安乐死溶液	Virbac Animal Health		ANADA #: 200-071
芬太尼贴剂	Actavis		NDC # 67767-120-18
氟尼辛	Merck & Co.		NAC #: 10470183
导尿管（16F）	Bard	730116
HBSS	Sigma-Aldrich	H8264-500ML
热风枪	Milwaukee	8988-20
肝素			NDC #: 25021
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	H8889-500ML
插管导管	Mallinckrodt Baker Inc.	86113
异氟烷	MWI Veterinary Supply		NDC #13985-030
静脉导管（18G）	BD Biosciences	381547
氯胺酮	Fort Dodge Animal Health		NDC #0856-2013
水平仪	Swanson	LLA001
鲁尔锁头盖	CML Supply	909-001
盐酸布比卡因	Hospira Inc.		NDC #: 0409-1560-10
梅岑鲍姆剪刀	Adler	N/A
微型导入器（5F）	Galt	KIT 002-01
蚊式止血钳	Adler	N/A
电机	Herbach and Rademan	H1-08
氧吗啡酮	Endo Labs		NDC: 63481-624-10
PKH26 荧光染料试剂盒	Sigma-Aldrich	PKH26GL-1KT
猪血清	Gemini Bio Products	100-115	在完全生长培养基中浓度为 2%
Potts 剪刀	Adler	N/A
Precise Vista 皮肤缝合器	3M	3998
PVC 管	McMaster-Carr	7132K117	扩张后内径 15.88 mm， 恢复后内径 7.95 mm
直角中号钳	Adler	N/A
手术刀片（#10-15）	Bard	373910
硅胶管	McMaster-Carr	51735K26	外径 16.64 mm，内径 9.52 mm
注射器（5 cc）	BD Biosciences	309603
透皮膜	3M	90001
三通阀	Kendall	170060
钛管	Tico Titanium	N/A	规格为 ½" 外径，.065" 壁厚，.370" 内径，.1737 磅/英尺
胰蛋白酶	Lonza Inc.	CC-5012
胰蛋白酶中和液（TNS）	Lonza Inc.	CC-5002	0.03%
维特波尔林	Pharmaderm Animal Health		NAC #: 12920110
薇乔缝线（3-0）	Ethicon Inc.	J808T
水浴超声仪	Branson	B200