本文介绍了一种从脊髓中分离小鼠胚胎运动神经元的替代方法。该方法基于以下原理：凝集素能够与低亲和力神经生长因子受体p75NTR结合。这种基于凝集素的预铺板技术可实现与针对p75NTR的特异性抗体相似的纯化效果。
本文内容
摘要
摘要
脊髓运动神经元在早期胚胎神经系统发育过程中逐渐进入终末分化阶段，随后长出树突和轴突。表达 Nkx6.1 的神经管神经上皮细胞是脊髓运动神经元唯一的前体细胞1。尽管终末分化的运动神经元会迁移至其最终位置，并沿脊髓纵轴排列成柱状结构2,3，但超过90%的已分化并定位的运动神经元均表达转录因子 Islet 1/2。它们支配四肢、躯干以及内脏器官的肌肉。运动神经元通常表达脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素-3（NT-3）的高亲和力受体，即原肌球蛋白受体激酶B和C（TrkB、TrkC）。它们不表达原肌球蛋白受体激酶A（TrkA）4。除了这两种高亲和力受体外，运动神经元也表达低亲和力神经营养因子受体 p75NTR。p75NTR 能以相似但低于高亲和力受体结合成熟神经营养因子的亲和力，与所有神经营养因子结合。在胚胎脊髓中，p75NTR 仅由脊髓运动神经元特异性表达5。这一特性已被用于开发运动神经元分离技术，以从大量周围细胞中纯化出运动神经元6。利用针对 p75NTR 胞外域的特异性抗体（免疫黏附法）分离运动神经元是一种成本较高的方法，因为在免疫黏附过程中所用培养板较大，单次实验需要消耗大量抗体。一种更为经济的替代方法是使用凝集素。已有研究表明，凝集素同样能够特异性结合 p75NTR7。以下方法描述了一种替代技术，即使用麦芽凝集素（wheat germ agglutinin）进行预铺板处理，以取代 p75NTR 抗体。凝集素相比 p75NTR 抗体极为廉价，且使用凝集素所达到的纯化效果与使用 p75NTR 抗体相当。通过该方法可从胚胎脊髓中分离出运动神经元，这些细胞能够存活并长出神经突起。
方案
特殊试剂：见表1。所列其他试剂均为 Sigma Aldrich 公司提供的细胞培养级产品。
1. 培养皿/盖玻片的 PORN-H/层粘连蛋白包被
- 在 pH 8.35 的 150 mM 硼酸盐缓冲液中配制 0.5 mg/ml 的多聚-DL-鸟氨酸氢溴化物（PORN-H）工作液。
- 可预先配制 50 mg PORN/1 ml 硼酸盐缓冲液的储存液，并于 -20°C 保存。
- 将玻璃盖玻片在 100% 乙醇中灼烧灭菌，然后使其自然晾干。
- 在 4°C 条件下，用足量的 PORN-H 溶液覆盖表面过夜。
- 次日用无菌水洗涤三次，并将盖玻片自然晾干。
- 在 HBSS 中配制 2.5 μg/ml 的层粘连蛋白工作液
- 分装后可于 -20°C 保存。使用前在 4°C 解冻。
- 用层粘连蛋白溶液覆盖已包被 PORN-H 的盖玻片表面，室温孵育至少 2 小时，直至使用。
2. 纯化板的凝集素包被
- 用无菌水配制 10 mM Tris 溶液，pH 9.5。
- 将凝集素（用 HBSS 溶解凝集素（Sigma L9640）粉末）加入至终浓度为 10 μg/ml。
- 用 8 ml 凝集素溶液涂覆 10 cm 细胞培养皿表面，在室温下孵育至少 30 分钟。
- 用 HBSS 洗涤培养皿三次，并保存在 HBSS 中待用。
- 配制含 30 mM KCl、0.8% (w/v) NaCl 的去极化溶液，过滤除菌后室温（RT）保存。
3. 运动神经元培养基
- 在4°C下过夜解冻马血清，并于55°C灭活30分钟，分装为5 ml每份，保存于-20°C。使用前在室温下直接解冻分装液。
- B27添加剂以1 ml分装保存于-20°C。使用前立即在室温下解冻B27添加剂。避免反复冻融。
- 将GlutaMAX分装为0.5 ml每份，保存于-20°C，并以1:100比例使用。
- 用含0.1% BSA的无菌水配制10 μg/ml CNTF的储存液。保存于-20°C。
- 使用前立即混合46 ml神经基础培养基、2.5 ml马血清、1 ml B27添加剂和0.5 ml GlutaMAX。
- 加入CNTF至终浓度为10 ng/ml培养基，并将培养基预热至37°C。
4. 脊髓解剖
- 处死一只E12.5的怀孕小鼠，小心取出胚胎。加入足量的室温HBSS以完全浸没胚胎。
- 去除头部和尾部，将胚胎背部朝上放置，四肢分开。
- 用一把镊子固定胚胎，用另一把镊子去除外层皮肤。
- 用镊子从脊髓下方穿入，以锯切样动作在脊髓两侧轻轻抬起，从而取出脊髓。
- 将分离的脊髓转移至含有HBSS的新培养皿中，并从背侧打开脊髓的中央管。
- 去除脊髓周围包被的脑膜，以分离背根神经节。
- 在每个凝集素板中，收集最多6个胚胎的腰段脊髓，放入已装有1 ml HBSS的离心管中，置于冰上保存，直至完成制备。
5. 基于凝集素纯化法富集运动神经元
注意：在开始下一步之前，最迟在此处准备并预热培养基（见步骤 3）。
- 将1 g胰蛋白酶溶解于100 ml HBSS中，配制胰蛋白酶溶液，于-20°C保存，并在4°C下解冻。
- 将1 g胰蛋白酶抑制剂与98 ml HBSS和2 ml 1 M HEPES（pH 7.4）混合，分装为1 ml每份，于4°C保存。
- 将装有脊髓的离心管转移至细胞培养超净台，小心移除700 μl HBSS。
- 加入7.5 μl胰蛋白酶溶液，通过轻轻翻转离心管混匀。
- 在37°C条件下消化8分钟。
- 加入30 μl胰蛋白酶抑制剂终止反应，使用1000 μl移液枪头轻柔吹打10–15次，直至无可见细胞团块；再使用20–200 μl移液枪及相应枪头重复吹打操作。
- 将细胞悬液转移至含HBSS的凝集素包被板中，通过轻轻旋转培养板使细胞分散均匀。
- 将凝集素板置于室温、无振动的台面上静置60分钟，并加盖以防止污染。
- 极其轻柔地移除HBSS，并用预热的HBSS小心洗涤4次，以去除细胞碎片及未贴壁细胞。
- 最后一次洗涤后立即加入500 μl去极化溶液，孵育1分钟。
- 通过轻轻振荡和轻敲培养板，促进凝集素结合细胞的脱落。
- 加入2 ml预热的培养基至培养板中，转移至15 ml离心管。
- 使用血球计数板对细胞数量进行计数。
- 根据实验需求，将适量细胞接种至经层粘连蛋白包被的盖玻片或培养板中。
- 在第1天进行换液，之后每隔两天小心更换50%旧培养基；始终使用预热且新鲜配制的培养基。
6. 代表性结果：
可在小鼠胚胎发育第12至14天（E12至E14）获取胚胎运动神经元。腰段脊髓总细胞群中约有2-3%为运动神经元，而背根神经节神经元同样表达p75NTR，因此在开始凝集素介导的预贴壁操作前，必须去除这些细胞（总体流程参见图1和图2）。其次，脑膜中含有增殖活跃的细胞，这些细胞同样需要被排除，因为它们无法通过凝集素介导的预贴壁步骤有效去除（图2和图3）。在严重情况下，这些细胞可能过度生长并占据整个培养皿。图3B和3D中的代表性图像也展示了洗涤操作后细胞密度降低的情况（见实验方案第5.9步）。小鼠胚胎运动神经元的培养通常维持不超过五至七天。在此期间，细胞会延伸出神经突，长度可达最大值（图4）。神经突长度显著依赖于培养板上的基质成分8。常用的基质为层粘连蛋白（laminin），其通常包被在多聚鸟氨酸-氢溴酸（PORN-H）覆盖的培养皿上。运动神经元也可在其他或定义不明确的基质上生长，例如通过水解法制备的细胞外基质8。当包被条件不理想时，神经突长度和生长锥面积均会减小，且细胞死亡通常增加。营养支持在维持小鼠胚胎运动神经元体外存活中起关键作用。若无营养支持，接种后第七天的细胞存活率将降至10%至20%6。脑源性神经营养因子（BDNF）和睫状神经营养因子（CNTF）是最常用的营养因子，但其他因子也可促进存活[如白血病抑制因子（LIF）、心肌营养素-1（CT-1）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子1（IGF-1）9]。
图1. 胚胎小鼠运动神经元制备的流程图。示意图展示了小鼠胚胎运动神经元分离与培养的各个步骤。缩写：SC：脊髓；HBSS：Hanks平衡盐溶液；MN：运动神经元。
图 2. 从 E12.5 小鼠胚胎中分离腰段脊髓。A： E12.5 小鼠胚胎。下一步需切除头部和尾部，并将躯体置于背侧向上的位置。B： 背侧向上的胚胎。左右两侧的镊子固定脊髓两侧的胚胎躯体。随后，其中一侧的镊子用于剪开皮肤并沿脊髓下方剪切，另一侧镊子则用于固定胚胎位置。C： 从 E12.5 小鼠胚胎中分离出的脊髓。图中标识了脊髓的不同部分（颈段、胸段、腰段）。脊髓周围包绕着脑脊膜，部分背根神经节仍附着其上。D： 沿背侧纵向切开脊髓，使其向中央管方向展开。E： 从展平的脊髓腹侧去除脑脊膜。注意：去除过程中，腰段部分通过一个小切口进行标记。F： 随后仅取脊髓的腰段部分用于后续实验操作。
图 3. 从小鼠胚胎 E12.5 腰段脊髓中鉴定并分离 Islet 阳性细胞。A： Islet-1/2 抗体标记胚胎腰段脊髓内的运动神经元柱（红色，箭头），Hoechst 标记切片中所有细胞核。图为 E12.5 胚胎腰段脊髓的横切面。E12.5 小鼠胚胎经 4% 多聚甲醛浸渍固定 6 小时，用磷酸盐缓冲液洗涤 3 次，并按标准流程进行蔗糖处理。使用冷冻切片机获取 20 μm 冷冻切片，并按标准流程进行免疫组织化学染色11。随后用 Hoechst 对切片染色以定位细胞核。请注意，背根神经节神经元也呈 Islet-1/2 阳性，但在组织制备过程中已排除该部分组织，不参与后续分离操作。B： 来自 E12.5 胚胎的 Islet-1/2 标记（红色，箭头）的离散腰段脊髓细胞，左侧为凝集素预贴壁前，右侧为预贴壁后。细胞经 Hoechst 共染色以显示所有细胞核。C： 凝集素预贴壁前后 Islet-1/2 阳性细胞的定量分析。D： E12.5 胚胎来源的运动神经元在培养一天后表达 Nkx6.1。细胞经 Hoechst 共染色以可视化所有细胞核。请注意，90% 的细胞呈 Nkx6.1 阳性。缩写：SC：脊髓；MN：运动神经元；DRG：背根神经节。
图4. E12.5小鼠运动神经元的表征 A 和 B： 富集分离的 E12.5 小鼠腰段脊髓运动神经元表达 p75NTR 0天时 体外 （第0天）和第2天 体外 (2分之2)。细胞用4%多聚甲醛固定，随后进行p75染色NTR 按照标准操作流程进行。使用Hoechst对细胞进行复染，以显示所有细胞核。 C: 5天后富集的运动神经元 体外 在PORN-H和层粘连蛋白作为培养基质并添加CNTF的条件下培养5天后，对β-III-微管蛋白进行免疫染色。可见细胞已长出较长的神经突，呈现出典型的运动神经元形态，具有一条较长（分支状）的突起和一条或多条较短的突起（轴突和树突）。缩写：MN：运动神经元；div：天 体外.
| 未进行凝集素预贴壁解离后的结果 | |||
| 每干细胞的总细胞数 | 台盼蓝阳性细胞 [%] | Islet-1/2 阳性细胞 [%] | |
| 1 | 995.0 | 13,1 | 9,5 |
| 2 | 889.4 | 8,0 | 10,0 |
| 3 | 1.180.0 | 11,0 | 10,8 |
| 平均值 ± SD | 1.021.0 ± 147.1 | 10,7 ± 2,6 | 10,1 ± 0,7 |
| 采用凝集素预贴壁处理 | |||
| 预贴壁后每干细胞的细胞数 | 台盼蓝阳性细胞 [%] | Islet-1/2 阳性细胞 [%] | |
| 1 | 189.6 | 9,9 | 70,5 |
| 2 | 168.8 | 3,7 | 76,1 |
| 3 | 125.0 | 0,0 | 72,5 |
| 平均值 ± SD | 161.1 ± 33.0 | 4,5 ± 5,0 | 73,0 ± 2,8 |
表1. 从小鼠胚胎E12.5阶段分离运动神经元的代表性方法总结。 针对此目的的3种不同分离方法的结果以总数或百分比±标准差（SD）表示。缩写：SC：脊髓；SD：标准差。
| 经 p75 亲和筛选的 Islet-1/2 阳性细胞 [%] | 经凝集素亲和筛选的 Islet-1/2 阳性细胞 [%] |
| 92,0 ± 3,5 1 | 73,0 ± 2,8 |
表2. 基于凝集素和基于p751的筛选运动神经元细胞数量比较。 结果以百分比数值±标准差（SD）表示。
讨论
这种基于凝集素的预铺板技术的优点在于，它比基于p75NTR抗体的平皿筛选法更经济，且凝集素比抗体更稳定。图2和表1中列出的富集结果显示，该方法能够纯化出数量相似的细胞，其中大多数细胞表达运动神经元标志物Islet-1/2。最关键的步骤是腰段脊髓的分离过程。去除脑脊膜和背根神经节（DRGs）（见图2）对于后续基于凝集素的预铺板纯化步骤至关重要。如果此步骤操作得当，几乎所有细胞均表达p75NTR（代表性图像见图3a）。Islet-1/2与p75NTR表达差异的最可能原因是腰段运动神经元对Islet-1/2的表达水平存在高低差异10。当Islet-1/2表达水平较低时，在免疫细胞化学染色及后续计数过程中可能被忽略，因为我们对阳性与阴性细胞的判断标准较为严格（见表1）。此外，表1清楚表明，分离获得的细胞在操作后仍保持良好的存活状态，因为仅有极少数细胞呈台盼蓝阳性，提示细胞未发生不可逆损伤。该替代方法还允许从单个胚胎中分离运动神经元，因此可用于分离来自胚胎小鼠的混合基因型窝仔中的运动神经元。总之，这一替代p75NTR抗体平皿筛选法6的方法在应用范围方面具有相似甚至相同的效能，为小鼠胚胎运动神经元提供了一种廉价且高效的替代性纯化手段。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢Sandra Bargen提供的出色技术支持。本工作由蛋白质研究部门（PRD，项目编号A1.2（R.C.和T.S.））以及鲁尔大学研究基金（RUB Research Fond，校长计划——青年科研人才项目（A.K.））资助。单克隆抗体39.4D5和F55A10购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank，DSHB，美国爱荷华州爱荷华城）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚-DL-鸟氨酸氢溴酸盐 | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| 层粘连蛋白 | Invitrogen | 23017-015 | |
| HBSS | GIBCO，Life Technologies 公司 | 14170 | |
| 玻璃盖玻片 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 10 或 14 mm | |
| 凝集素 | Sigma-Aldrich | L5142 | |
| 细胞培养皿 | Nalge Nunc International | 150350 | Nunclon Delta 表面 |
| 马血清 | Linaris | SHD3250ZK | 每批均需测试是否适用于运动神经元培养 |
| B27 添加剂 | GIBCO，Life Technologies 公司 | 17504-044 | |
| Glutamax | GIBCO，Life Technologies 公司 | 35050-038 | |
| CNTF | Sigma-Aldrich | N0513 | |
| BSA | Applichem | A1391 | |
| Neurobasal 培养基 | GIBCO，Life Technologies 公司 | 21103-041 | |
| 镊子 | 不锈钢，4 或 5 号 | ||
| 胰蛋白酶 | Worthington Biochemical | LS003707 | |
| 胰蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| 抗-Islet-1 抗体 | DSHB | 39.4D5 | 细胞培养上清液 |
| 抗-Nkx6.1 抗体 | DSHB | F55A10 | 细胞培养上清液 |
| 抗-p75NTR | Abcam | Ab8874 | |
| 表 3. 特异性试剂与设备列表。 |
参考文献
- Vallstedt, A. Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification. Neuron. 31, 743-755 (2001).
- Tsuchida, T. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79, 957-970 (1994).
- Lin, J. H. Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression. Cell. 95, 393-407 (1998).
- Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons. Acta Neurochir. , 21-35 (2004).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Bullen, A. Microscopic imaging techniques for drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).
- Hazelwood, K. L. Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope. Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).
- Hickey, M. J. L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo. J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).
- Cara, D. C., Kubes, P. Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).
- Liu, L. LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration. J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).
- Heit, B. PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP. J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).
重印与许可
