预测HIV-1的共受体使用情况对于使用一类新型抗逆转录病毒药物（即共受体拮抗剂）的治疗至关重要。该预测可通过分析env基因序列，并借助基于互联网的解释系统（geno2pheno[coreceptor]）进行后续解读来实现。
本文内容
摘要
摘要
马拉韦罗（Maraviroc，MVC）是首个获批上市的趋同受体拮抗剂类抗逆转录病毒药物。它可结合宿主细胞的趋同受体CCR5，而大多数HIV毒株利用该受体感染人类免疫细胞（图1）。其他HIV分离株则使用另一种趋同受体CXCR4。病毒所使用的受体类型由其Env蛋白决定（图2）。根据所使用的趋同受体不同，病毒分别被归类为R5型或X4型。MVC通过结合CCR5受体，抑制R5型病毒进入靶细胞。在疾病进展过程中，X4型病毒可能逐渐出现并取代R5型病毒的优势地位。因此，在使用MVC前，必须检测病毒的趋同受体使用情况（也称为嗜性），此要求由欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）明确规定。
关于MVC疗效的MOTIVATE、MERIT和1029研究均采用美国旧金山Monogram公司提供的Trofile检测法进行。该检测基于精密的重组病毒试验，具有较高的质量标准。然而，该检测在美国以外地区日常临床实践中的接受度较低，因为欧洲的医生更倾向于使用经过认证的分散式专业实验室，这些实验室同时可提供伴随的耐药性检测。这些实验室已通过多次质量保证评估，最近一次评估结果于2011年公布1。
多年来，我们一直基于HIV env-V3基因区域（V3）的序列分析进行嗜性测定2。该区域包含足够的信息以实现可靠的预测。 通过基因型方法确定病毒共受体使用具有多项优势，例如：周转时间更短（与耐药性检测相当）、成本较低、可根据患者需求调整结果，以及能够分析病毒载量（VL）极低甚至无法检测的临床样本，尤其是近年来病毒载量<1000 拷贝/μl 的样本数量显著增加（图3）。
本视频展示的嗜性检测主要步骤（图4）：
1. 采集血液样本
2. 从血浆中分离HIV RNA和/或从外周血单个核细胞中分离HIV前病毒DNA
3. 扩增env 区域
4. 扩增V3区域
5. 对V3扩增产物进行测序反应
6. 纯化测序样本
7. 对纯化后的样本进行测序
8. 序列编辑
9. 测序数据分析与嗜性预测
方案
该方案总结于图4中。
1. 血液样本的采集
- 在临床采样点，使用 EDTA 管采集至少 3 ml 血液。
- 样本可在 4°C 下保存最多一周。
- 应尽快通过普通邮件将 EDTA 抗凝血样本寄送至实验室。
2. HIV RNA 和/或 DNA 的分离
- 使用 MagNA Pure Compact 核酸分离 I 试剂盒 I 和 MagNA Pure Compact 系统，从 1000 μl 全血、血清或血浆中提取病毒 RNA 和/或 DNA。
- 用 50 μl TE 缓冲液洗脱获得的 RNA 或 DNA。也可采用其他核酸纯化方法。
3. env 区域的扩增
从血浆RNA或前病毒DNA中扩增env区域（图2和图4）。扩增产物长度为1245 bp，包含Env蛋白的大部分序列（根据HXB2编号，对应核苷酸6556-7811）。
- RNA 样本：RT-PCR 反应
- 病毒 RNA 具有非常复杂的二级结构（图 4），可能阻碍逆转录（RT）反应。为避免此问题，将 10 μl RNA 在 PCR 管中放入 PCR 仪，于 65°C 孵育 10 分钟，随后将温度降至 50°C。
- 加入 40 μl 含引物 Env-F 和 Env-R 的 PCR 主混合液（Master Mix）。
自制 RT-PCR 系统主混合液配方：
每反应体积（μl） 终浓度 无 RNase 水 H2O 14.4 5x 缓冲液（Qiagen OneStep RT-PCR Kit） 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP 混合液（各 10 mM） 2 每种 dNTP 400 μM 酶混合液（Enzym-Mix，Qiagen OneStep RT-PCR Kit） 2 引物 Env-F（100 μM） 0.3 0.6 μM 引物 Env-R（100 μM） 0.3 0.6 μM RNase 抑制剂（RNasin） 1 5 单位/反应
Env-F：5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3'（根据 HXB2，nt 6556→6586）
Env-R：5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3'（nt 7785←7811） - 在 50°C 下运行 RT 反应 30 分钟。
- 按以下条件进行第一轮 PCR：
95°C，15 分钟 1 次 95°C，30 秒
50°C，30 秒
72°C，2 分钟1 次 95°C，30 秒
56°C，30 秒
72°C，2 分钟38 次 72°C，10 分钟
4°C 保存
- DNA 样本：PCR 反应
对于前病毒 DNA 样本，无需初始 RT 反应，可直接开始 PCR 反应。- 向 10 μl 前病毒 DNA 中加入 40 μl PCR 主混合液（Master Mix）。
自制 PCR 系统主混合液配方：
每反应体积（μl） 终浓度 无 RNase 水 H2O 15.4 5x 缓冲液（HotStarTaq DNA 聚合酶） 10 1x 5x Q-Solution 10 1x dNTP 混合液（各 10 mM） 2 每种 dNTP 400 μM 酶混合液（Enzym-Mix，HotStarTaq DNA 聚合酶） 2 引物 Env-F（100 μM） 0.3 0.6 μM 引物 Env-R（100 μM） 0.3 0.6 μM
Env-F：5'- CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3'（nt 6556→6586）
Env-R：5'- AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3'（nt 7785←7811） - PCR 条件与 RNA 样本（步骤 3.1.4）中所述相同。
- 向 10 μl 前病毒 DNA 中加入 40 μl PCR 主混合液（Master Mix）。
4. V3 区域的扩增：巢式 PCR
- 进行巢式 PCR 时，取第一次 PCR 反应的 5 μl 产物（无需事先进行琼脂糖凝胶分析）作为模板，并加入 95 μl PCR 总混合液。
巢式内部 PCR 总混合液配方每反应体积 (μl) 终浓度 H2O 61.9 10x PCR 缓冲液 10 1x 5x Q-Solution 20 1x dNTP 混合液（各 10 mM） 2 每种 dNTP 200 μM 引物 Env-2F（100 μM） 0.3 0.6 μM 引物 Env-2R（100 μM） 0.3 0.6 μM HotStarTaq DNA 聚合酶 0.5 2.5 单位/反应
Env-2F：5'- GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC -3'（nt 6838→6864）
Env-2R：5'- CACCACTCTTCTCTTTGCCTTGGTGGGTGC -3'（nt 7712←7742） - 按以下条件运行 PCR：
93°C，15 分钟1 次 95°C，30 秒
50°C，30 秒
72°C，90 秒1 次 95°C，30 秒
56°C，30 秒
72°C，90 秒43 次 72°C，10 分钟
4°C 保存 - 在 1% 琼脂糖凝胶上分析 PCR 产物（图 4）。预期产物长度为 902 bp。
- 测序样品的纯化。
- 使用 Qiagen PCR 纯化试剂盒，按照供应商提供的操作流程、溶液和微型柱对 PCR 产物进行纯化。根据条带强度，用 30–100 μl PE 缓冲液洗脱。
- 或者，可使用 Exonuclease I 和 Fast AP（Thermo 碱性磷酸酶）对样品进行纯化。具体操作为：向 15 μl PCR 产物中加入 6 μl Exo-AP 混合液，37°C 孵育 15 分钟。
580 μl H2O 66 μl fast AP 13.4 μl Exo I
5. V3 扩增子的测序反应
- 测序反应包含一个PCR反应，仅使用以下引物之一：
Env-2: 5'- GTACAATGYACACATGGAATTAGGC -3 (nt 6959→6980)
Env-5: 5'- AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3' (nt 7352←7371)
Env-6: 5'- GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3' (nt 6979→7000)
Env-7: 5'- TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3' (nt 7530←7549)
Env-10: 5' - GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3' (nt 7478←7507)
Env-11: 5' - TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3' (nt 7638←7664)
首选引物为：Env-2、Env-6 或 Env-7、Env-11 - 取1 μl纯化的V3扩增产物作为模板，加入9 μl PCR主混合液。
测序主混合液：4 μl 测序混合液（HIV基因分型试剂盒） 4 μl H2O 1 μl 引物（100 pmol/μl） - 按以下程序运行测序反应：
96°C，10 秒 50°C，10 秒 36 次 60°C，45 秒 4°C ∞
6. 测序样品的纯化
使用 Sephadex G-50 超细树脂纯化序列。
- 在“列加样器”中加入适量的 Sephadex G-50 超细介质。通过倒置将 Sephadex 转移至滤板 MAHVN4510 中。
- 向滤板的每个孔中加入 300 μl Milli-Q H2O，并在 2–8°C 下孵育至少 3 小时。
- 在 910×g 和 4–15°C 条件下离心 5 分钟。弃去穿滤液。
- 向测序产物中加入 10 μl H2O，然后用移液器将测序样品加至溶胀后的 Sephadex 滤板上。
- 为获得纯化产物，在 910×g 和 4–15°C 条件下离心 5 分钟，并收集穿滤液。
7. 在 ABI Prism 3130 XL 测序仪上对纯化样品进行测序
- 每次运行前，更换缓冲液并检查聚合物（POP7）的体积。如有需要，更换旧的聚合物瓶为新瓶。
- 使用已保存的运行条件，包括18秒的进样时间。
- 在此仪器中，使用16个测序样本的一次运行信号数据采集需要约60分钟（36 cm毛细管）或150分钟（50 cm毛细管）。
8. 序列编辑
- 使用 Lasergene（DNA-Star）程序对序列进行比对和编辑（图5）。也可使用其他序列编辑程序。以“V3-Consensus B”和env共识序列作为参考序列。
- Lasergene 利用所有可用的原始数据生成分析样本的共识序列，并将其保存为 FASTA 文件。FASTA 文件是一种文本文件，包含样本名称的标题信息以及核苷酸序列。
9. 测序数据分析与嗜性预测
- 测序数据的解读由基于网络的解读系统 geno2pheno[coreceptor]（http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php）完成。在进行嗜性预测时，可选择不同的错误阳性率（FPR）阈值。默认设置遵循德国-奥地利治疗指南。当 FPR ≥ 20% 时，病毒被归类为 R5 型；当 FPR < 12.5% 时，归类为 X4 型。
- 将 FASTA 文件上传至服务器。该服务器会将核苷酸序列翻译为氨基酸序列，与 V3-Consensus B 序列进行比对，并生成亚型分类结果。此外，系统还会生成以错误阳性率（FPR）表示的共受体使用预测结果（图 4）。
10. 代表性结果
geno2pheno[coreceptor] 的输出结果对嗜性提供了分级解释。根据共受体使用可能性的不同，其解释文本及背景色从绿色（FPR <20%）到黄色，再到红色变化：绿色表示可安全使用马拉韦罗（MVC）；黄色表示存在较低风险，可能可以使用；红色则提示不应处方MVC。此外，服务器会生成一份PDF报告，可供打印、填写患者及样本信息后发送给医生。geno2pheno[coreceptor] 输出结果的示例如图6所示。
图1. HIV复制过程示意图。 病毒颗粒必须结合细胞表面的CD4受体以及CCR5或CXCR4共受体。CCR5共受体可被CCR5拮抗剂（如马拉韦罗（Maraviroc, MVC, Celsentri, Selzentry））阻断。病毒膜与细胞膜融合后，病毒核衣壳释放至细胞质中。核衣壳解离，释放病毒RNA复合物进入细胞质。病毒逆转录酶（RT）将基因组RNA转录为前病毒DNA，随后该DNA被转运至细胞核，并由HIV整合酶将其整合到宿主基因组中。细胞RNA聚合酶从前病毒基因组转录出病毒基因组RNA和信使RNA。病毒蛋白在细胞质中合成后转运至细胞膜表面。病毒颗粒以未成熟的非感染性病毒形式从细胞膜出芽。HIV蛋白酶切割前体蛋白，形成成熟的感染性病毒颗粒。抑制其中任一环节均可中断病毒复制周期。
抑制病毒复制步骤的抗逆转录病毒药物及其作用环节以红色标出。
病毒RNA和前病毒DNA（用于嗜性或耐药性分析的材料）用绿色标出。
图 2. HIV 前病毒基因组。HIV 病毒颗粒由多种结构蛋白构成，并包含来源于病毒和宿主细胞的各种酶和蛋白质。该图显示了病毒基因组中各基因的位置。表面蛋白 gp120 和 gp41 构成病毒颗粒表面的刺突结构，可与人类细胞接触并介导膜融合。图的下部展示了本实验方案中使用的 PCR 扩增产物及引物。
图 3. 德国科隆大学病毒学研究所对药物耐药性或嗜性测定进行分析的患者中，病毒载量（VL）检测结果处于低水平的比例。
图4. 实验总体方案。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 使用Lasergene进行序列编辑。 V3扩增子至少使用一个正向引物和一个反向引物进行测序。Lasergene将测序仪获得的“.abi”文件与参考序列“V3-Consensus B”和env进行比对。Lasergene利用所有可用的原始数据生成一条共识序列。参考序列可以被标记（标记后以灰色显示），从而不参与样本共识序列的构建。
图6. 由 geno2pheno[coreceptor] 工具生成的嗜性预测报告。报告以 PDF 文件格式生成，可在计算机上保存并进一步填写。可使用 PDF 编辑程序手动添加患者姓名、采血日期等额外信息，也可添加特定注释。这些数据仅保存在用户计算机上，不会上传至 geno2pheno[coreceptor] 服务器。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
V3序列能够实现可靠的病毒嗜性预测，这一点已在临床研究中得到证实3-9。事实上，目前的欧洲以及德奥指南均已考虑采用基因型检测方法10。
与表型检测相比，基因型检测不仅周转时间更短（相当于耐药性检测），成本也更低。此外，基因型检测的一个主要优势在于其结果以假阳性率（FPR）进行分级，因此可根据患者的具体需求进行调整。而 Trofile 检测结果仅提供 R5 或 X4 的报告，无法获取原始数据。
目前，欧洲指南建议将FPR临界值设为20%10，而奥地利-德国指南则允许根据每位患者的具体需求调整FPR临界值11。据此，对于可选抗逆转录病毒药物范围较广的患者，建议采用较高的FPR临界值（> 20%）；相反，对于既往接受过大量治疗且治疗选择有限的患者，可采用较低的FPR临界值（> 5%）。目前，针对核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）、非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）、蛋白酶抑制剂（PIs）和整合酶抑制剂（INIs）的耐药性检测正在持续提供此类治疗指导，对于治疗选择较少的患者，可将部分有效的药物纳入治疗方案。此外，随着基因型指导治疗方案调整的病例不断增多，生物信息学家、病毒学家和临床医生组成的专家组正在持续调整具有临床意义的FPR临界值。
基因型嗜性检测的另一个重要优势是能够分析病毒载量（VL）极低甚至无法检测的临床样本。在这种情况下，当血浆RNA无法扩增时，仍可对前病毒DNA进行测序并用于可靠的预测9,12。值得注意的是，近年来病毒载量低或无法检测的患者数量显著增加。目前，Trofile检测仅允许分析病毒载量<1000 拷贝/mL的患者样本。然而，初步研究表明，前病毒DNA也可能适用于Trofile检测13。
披露
本视频文章由 ViiV Healthcare 和 GlaxoSmithKline 赞助。
致谢
作者的研究经费来自 Corus、MedSys Cell Entry、CHAIN 和 Resina 项目。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MagNA Pure Compact 核酸分离试剂盒 I | Roche集团 | 04 802 993 001 | |
| MagNA Pure Compact 系统 | Roche集团 | 03731146001 | |
| T3000 梯度PCR仪 | Biometra | 050-723 | |
| 一步法RT-PCR试剂盒 | Qiagen | 210215 | |
| HotStarTaq Master Mix 试剂盒 | Qiagen | 203445 | |
| QIAquick PCR 纯化试剂盒 | Qiagen | 28106 | |
| 外切酶 I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
| FastAP 热敏碱性磷酸酶 | Fermentas | EF0651 | |
| BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒 | Applied Biosystems | 4337457 | |
| Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
| ABI Prism 3130 XL 毛细管测序仪 | Applied Biosystems | 3130XL |
参考文献
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重印与许可
