使用基因型的方法预测HIV-1辅助用途（归经）的序列分析

Summary

预测HIV-1的辅助受体的使用需要管理的一类新的抗逆转录病毒药物，即辅助受体拮抗剂。它可以通过序列分析环境）。

Abstract

Maraviroc（MVC）是第一家持牌的抗逆转录病毒药物的辅助受体拮抗剂类。它绑定到主机的辅助受体CCR5，它是由多数的艾滋病毒菌株感染人体免疫细胞（图1）。其他的艾滋病毒菌株使用不同的辅助受体，CXCR4。使用哪一个受体，被确定的Env蛋白（图2）中的病毒。根据所使用的辅助受体，这些病毒是分类为R5或X4分别。 MVC的绑定到CCR5受体抑制R5病毒进入靶细胞的条目。在疾病的过程中，X4病毒的出现和长大的R5病毒。测定的辅助受体的使用（也称为嗜性），因此前必须进行管理的MVC，EMA和FDA所要求的。

已进行的研究MVC效率的激励，MERIT和1029的Trofile分析会标，美国旧金山，这是一个高品质分析的基础上sophisticated重组的测试。接受本次测试的日常是相当低的，因为美国以外的欧洲的医生，而往往与分散的专家实验室，这也提供伴随性测试。这些实验室已经经历了几次的质量保证评估，最后在2011年^1。

几年来，我们已进行趋向性测定HIV的^{env-V3（V3）2}基因区域序列分析的基础上。这个地区进行足够的信息来进行可靠的预测。的辅助受体的基因型确定使用的优势，如:更短的周转时间（相当于电阻测试），更低的成本，可能适应的结果，患者的需求和临床样本进行分析的可能性非常低，甚至检测不到病毒载量（VL ），特别是因为与VL的分析样品的数量<1000拷贝/μl大致在过去几年中增加（图3）。

嗜性测试的主要步骤（图4）在这个视频演示:

1。采集的血液样本
2。从血浆和/或从血液中单核细胞的HIV前病毒DNA的HIV RNA的分离
3。 env区的扩增
4。扩增的V3地区，
5。测序反应的V3扩增子
6。测序的样品纯化
7。测序的纯化样品
8。序列编辑
9。测序数据的解释和取向预测

Protocol

该协议被总结在图。 4。

1。采集血样

1. 在EDTA管收集至少3毫升的血液在临床的网站。
2. 可将样本存储在一个星期，在4℃下
3. 只要可能的实验室通过普通邮件发送EDTA血液样本。

2。艾滋病毒的RNA和/或DNA的分离

1. 获取从1000微升的全血，血清或血浆中的病毒RNA和/或DNA，使用在MagNA Pure契约核酸隔离I包我在MagNA Pure紧凑型系统。
2. 洗脱获得的RNA或DNA在50μlTE缓冲液中。或者，其他的核酸纯化程序可以被使用。

3。 env区的扩增

扩增的env无论从等离子体RNA或原病毒DNA的区域（图2和图4）。一个长1245 bp的产品，包括大多数的Env蛋白（新台币6556-7811 according至HXB2）被生成。

1. RNA样品的RT-PCR反应
   1. 病毒RNA呈现一个非常复杂的二级结构（图4），可能会阻碍反转录（RT）反应。为了避免这个问题，在65℃下孵育10μlRNA提取10分钟（已经在PCR管中，并在PCR机器），然后将温度降低至50℃。
   2. 加入40μl的PCR扩增预混试剂，包括引物env-F的和Env-R。
      
      预混RT-PCR在内务系统:
      

      	体积/反应（微升）	终浓度
      无RNA酶H 2 O	14.4
      5×缓冲液（Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒）	10	1个
      5倍Q-解决方案	10	1个
      dNTP混合物（10毫米）	2	400μM的每种dNTP
      体酶混合物混合（Qiagen公司的一步法RT-PCR试剂盒）	2
      入门ENV-F（100μM）	0.3	0.6μM
      入门ENV-R（100μM）	0.3	0.6μM
      RNase抑制剂（RNA酶抑制剂）	1	5单位/反应

      
      
      的env-F:的5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3'（核苷酸6556→6586根据HXB2）
      
      ENV-R:的5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3"（nt的7785←7811）
   3. 运行反转录（RT）反应在50℃下30分钟。
   4. 运行第一PCR如下:
      
      

      95°C，15分钟	1个
      95°C，30秒 50℃，30秒 72°C，2分钟
      95°C，30秒 56℃，30秒 72°C，2分钟	38×
      72°C，10分钟 4°C∞

      1个
2. DNA样品PC​​R反应
   
   对于原病毒DNA样本，需要没有初始的反转录（RT）反应，PCR反应可以直接启动。
   1. 加入40μl的PCR主要混合液至10微升provial脱氧核糖核酸。
      
      
      PCR反应混合液在内务系统:
      

      	体积/反应（微升）	终浓度
      无RNA酶H 2 O	15.4
      5×缓冲液（HotStarTaq DNA聚合酶）	10	1个
      5倍Q-解决方案	10	1个
      dNTP混合物（10毫米）	2	400μM的每种dNTP
      体酶混合物混合（HotStarTaq DNA聚合酶）	2
      入门ENV-F（100μM）	0.3	0.6μM
      入门ENV-R（100μM）	0.3	0.6μM

      
      
      ENV-F:的5'-CAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAA -3"（nt的6556→6586）
      
      ENV-R:的5'-AGTGCTTCCTGCTGCTCCTAAGAACCC -3"（nt的7785←7811）
   2. 如先前所述的RNA样品（步骤3.1.4）运行的PCR条件。

4。巢式PCR扩增的V3区:

1. 巢式PCR，用5微升的第一次PCR反应（不包括前面的分析中琼脂糖凝胶电泳）为模板，加入95微升的PCR MAS后混合。
   
   嵌套在内务PCR预混

   	体积/反应（微升）	终浓度
   H 2 O	61.9
   10×PCR缓冲液	10	1个
   5倍Q-解决方案	20	1个
   dNTP混合物（10毫米）	2	200μM的每种dNTP
   引物ENV-2F（100μM）	0.3	0.6μM
   引物ENV-2R（100μM）	0.3	0.6μM
   HotStarTaq DNA聚合酶	0.5	2.5单位/反应

   
   
   ENV-2F:5'-GTCCAAAGGTATCCTTTGAGCCAATTC的3'（新台币6838→6864）
   
   
2. 运行的PCR如下:

   93°C，15分钟	1个
   95°C，30秒 50℃，30秒 72°C，90秒	1个
   95°C，30秒 56℃，30秒 72°C，90秒	43×
   72°C，10分钟 4°C∞

3. 分析的PCR产物在1％琼脂糖凝胶（图4）。预期的产品为902 bp的长。
4. 测序的样品纯化。
   1. 用Qiagen公司的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，使用的协议，由供应商提供的解决方案和微柱。在30-100微升PE缓冲液洗脱，根据带的强度。
   2. 或者，可将样本用外切核酸酶我和快速AP（热碱性磷酸酶）。为了这个目的，添加6微升外AP混合到15微升的PCR产物，并孵育15分钟，在37℃。

      580微升H 2 O

      66微升的快速AP

      13.4微升埃克索我

5。测序反应的V3扩增子

1. 测序反应由仅使用其中一个下列引物的PCR反应:
   
   ENV-2:5'-GTACAATGYACACATGGAATTAGGC的的-3（nt的6959→6980）
   ENV-5:5'-AAAATTCCCCTCCACAATTA - 3'（nt的7352←7371）
   ENV-6:5'-GGCCAGTAGTATCAACTCAAC - 3'（新台币6979→7000）
   ENV-7:5'-TGTCCACTGATGGGAGGGGC - 3'（nt的7530←7549）
   ENV-10:5 - GCAGAATAAAACAAATTATAAACATGTGGC - 3'（nt的7478←7507）
   信封-11:5' - TACATTGCTTTTCCTACTTTCTGCCAC - 3'（nt的7638←7664）
   首选引物分别是:ENV-2，ENV-6或env-7，ENV-11
2. 加入1μl纯化的V3扩增产物为模板，并添加9μl的PCR主混合。
   
   测序主混音:

   4μL的顺序混合（艾滋病毒基因分型试剂盒）

   4微升H 2 O

   1μl引物（100皮摩尔/微升）

3. 运行序列反应如下:

   96°C，持续10秒
   50℃，10秒	36×
   60℃，45秒
   4°C∞

6。测序的样品纯化

净化序列USI吴经Sephadex G-50超细。

1. 在"列装载器"，用Sephadex G-50超细填写适当数量的井。转移交联葡聚糖滤板MAHVN4510的翻身。
2. 在过滤板，每孔加入300μl的Milli-Q H _{2 O，}下培养至少3小时，在2-8°C。
3. 离心5分钟的板在910Xg和4-15℃。丢弃流过。
4. 加入10μlH _{2 O}至序列的产品，然后移液管上的序列的溶胀的交联葡聚糖板。
5. 为了获得纯化的产物，离心5分钟的板。在910Xg和4-15°C，并收集流过。

7。测序的测序仪ABI PRISM 3130 XL的纯化样品对

1. 每次运行之前，改变缓冲液和检查的聚合物（POP7）的体积。如果需要的话，由一个新的更换旧的聚合物烧瓶。
2. 使用所保存的运行条件，包括注射时间为18秒。
3. 在这台机器，采集的信号有16个序列样本数据的一个运行大约需要60分钟（36厘米毛细管）或150分钟（50厘米毛细管）。

8。序列编辑

1. 使用该程序Lasergene（DNA明星）对齐和编辑的序列（图5）。可以使用其他序列编辑程序。使用一个"V3-共识"B"和作为参考的 env一致序列。
2. Lasergene创建一个的共识序列分析样品所有的原始数据，并将其存储FASTA文件。的FASTA文件是一个文本文件，该文件包括一个标题用的样品和核苷酸序列的名称。

9。测序数据的解释和取向预测

1. 测序数据解释执行的基于Web的解释系统geno2pheno _{辅助受体（} http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/的index.php）。对于嗜性预测，可以选择不同的FPR设置。默认设置是根据德国和奥地利的治疗指引。对于FPR≥20％，该病毒被归类时，作为R5 FPR≥20％和X4为FPR <12.5％。
2. FASTA文件上传到服务器。此服务器的核苷酸序列翻译成氨基酸，它与V3-共识B序列对齐，并产生一个亚型分类。此外，它会产生一个预测的辅助受体的使用（图4）为假阳性率（FPR）表示。

10。代表性的成果

geno2pheno _{辅助受体输出}显示了一个渐变的解释取向。根据使用的辅助受体的可能性，解释文本和背景颜色变化从绿色（FPR <20％），安全管理提出了MVC，地黄，暗示可能，风险低，最后到红色。红色是颜色建议ING不规定MVC。此外，服务器生成一个PDF格式的报告可以打印，填写病人的样本数据，发送给医生。的geno2pheno _{[辅助受体]}输出的实施例描绘在图6。

图。 1。原理的HIV的复制。病毒颗粒细胞CD4受体结合，无论是作为辅助受体CCR5或CXCR4。辅助受体CCR5基因可以阻止CCR5拮抗剂如Maraviroc（MVC，Celsentri，Selzentry）。病毒和细胞的膜融合后，病毒核衣壳在细胞质中被释放。核衣壳拆卸和病毒RNA复合物被释放到细胞质中。病毒的逆转录酶（RT）的基因组RNA转录成原病毒DNA，然后被输送到细胞核，并整合入宿主基因组中的HIV整合。细胞RNA聚合酶TRAnscribe的前病毒基因组中的病毒基因组和信使RNA。产生的病毒蛋白在细胞质中，并输送到细胞表面。不成熟的，非感染性的病毒颗粒从细胞中的病毒颗粒芽。 HIV蛋白酶切割传染性微粒的蛋白质的生产。抑制的步骤之一导致中断的复制周期。

抗逆转录病毒药物和复制的步骤，他们抑制被标记为红色。

病毒RNA和绿色标记的前病毒DNA（所用材料趋向性或耐药性分析）。

图2。建立HIV前病毒基因组的 HIV颗粒具有不同的结构蛋白和房屋的各种酶和蛋白质，病毒和细胞。下图展示S的病毒的基因组内的基因的位置。表面蛋白gp120和gp41的病毒粒子的表面上，构成尖峰人体细胞联系来执行膜融合。的PCR扩增产物和我们的协议中使用的引物，在该图的下部，示出。

图3。低病毒载量（VL）的患者比例测量分析研究所病毒学大学，科隆（德国）的耐药性或嗜性的判断。

图4。总体方案的实验 ..请点击这里看到一个更大的版本，这个数字。

图5。序列编辑Lasergene V3的扩增子与至少一个正向和一个反向引物测序。 lasergene alignes"。阿比"的文件从音序获得与参考序列"V3-共识"B"和env。 ，Lasergene创建一个共识序列使用的所有行数据。可以被标记的参考序列（和然后以灰色显示），以便它们不有助于样品一致序列。

图6。归经预测报告所产生的geno2pheno _{[辅助受体}工具。报告生成的PDF文件可以保存在电脑上完成。附加数据例如患者的姓名，血液提取，日期等，可手动包括使用的pdf作家程序。还可以添加具体意见。帖E数据完全是在用户的计算机和不上geno2pheno的_{[辅助受体]}服务器。请点击这里看到一个更大的版本，这个数字。

Discussion

的V3序列允许可靠的病毒嗜性预测，在临床研究中^3-9所示。事实上，基因型确定拟在目前的欧洲，德国和奥地利的指引^10。

表型检测相比，不仅是周转时间更短（相当于电阻测试），但也有成本。此外，基因型检测的一个主要优点是，结果评定为FPR和因此，可以适应患者的需求。另一方面，trofile结果，简单地R5或X4报告，还没有给定的原始数据的访问。

目前，欧洲指南建议FPR截止的^20％10，而奥地利和德国的指引，允许适应 ​​的FPR截止专门的每个病人的需要^11。在这条线，具有广泛的抗逆转录病毒药物的选择，更高的FPR开口销（> 20％）的患者RECOMM结束。相反的，对于重预治疗的患者的治疗选择有限，低级的FPR切割冲销（> 5％）可以被使用。这种治疗指导目前正在进行的NRTI类药物，NNRTI类药物，督察和INIS，其中局部活性药物可被包括在与减少的治疗选择的患者治疗的电阻测试。此外，基因型引导治疗的变化，越来越多的临床相关的FPR切的平衡不断被调整，由一组生物信息学家，病毒学家和临床医生。

的基因型的嗜性测试的另一个重要的优点是非常低，甚至检测不到病毒载量（VL）的临床样本分析的可能性。在这种情况下，当等离子体RNA是不扩增，原病毒DNA可以被测序，并用于可靠的预测^9,12。值得注意的是，低或不可检测的病毒载量的患者的数量急剧增加在最近几年。至目前为止，在T从VL <1000拷贝/ ml的患者，只允许rofile分析样品的分析。然而，初步研究表明，前病毒DNA，也可以由Trofile ¹³ adecuate要测试。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
麦格纳的纯紧凑型核酸提取试剂盒我	罗氏诊断	04 802 993 001
的MagNA Pure Compact系统	罗氏诊断	03731146001
T3000热循环仪	Biometra	050-723
一步法RT-PCR试剂盒	Qiagen公司	210215
HotStarTaq预混试剂盒	Qiagen公司	203445
QIAquick PCR纯化试剂盒	Qiagen公司	28106
核酸外切酶I（埃克索我）	Fermentas公司	EN0582
的Fastap热敏碱性磷酸酶	Fermentas公司	EF0651
BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒	美国应用生物系统公司	4337457
葡聚糖凝胶G-50超细	GE医疗集团	17-0041-01
ABI棱镜3130 XL毛细管测序	美国应用生物系统公司	3130xl基因分析