利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

摘要

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。

摘要

目前医疗领域迫切需要一种适用于临床的人类神经元细胞来源，以修复或再生受损的中枢神经系统（CNS）结构与神经环路。基于细胞的治疗策略在恢复CNS疾病中丧失的神经组织与功能方面具有广阔前景。然而，源于中枢神经系统的神经干细胞在体外培养中扩增能力有限，且经过多次传代后可塑性下降，导致其在临床应用中面临供应受限和使用困难等问题。^1-3尽管取得了一些有益的效果，但源自中枢神经系统的人源神经干细胞（hNSCs）似乎主要通过其非神经元谱系细胞发挥治疗作用，即通过分泌神经营养和神经保护分子来挽救内源性细胞。^1-3或者，多能性人类胚胎干细胞（hESCs）可通过提供发育中的中枢神经系统中多种多样的人类神经元细胞类型，用于再生治疗，从而为多种神经系统疾病提供治愈可能。^1,4-7然而，如何高效且可预测地引导多能性人胚胎干细胞（hESCs）广泛的分化潜能向特定表型定向分化，一直是发育生物学研究和临床转化应用面临的主要挑战。传统方法依赖于多能性细胞通过自发的胚层分化产生多谱系倾向，导致谱系定型效率低下且不可控，常伴随表型异质性和不稳定性，因而具有较高的致瘤风险。^7-10此外，通常用于hESC分离、扩增和分化过程中的未明确定义的外源性/动物源性生物添加剂和/或饲养层细胞，可能使此类细胞特化移植物在患者中的直接应用变得困难^11-13为克服这些障碍，我们已确定并解决了维持人胚胎干细胞上胚层多能性所必需且充分的限定培养体系的各个组分，为后续研究提供了平台 从头合成 通过小分子诱导获得临床适用的hESCs并有效、均一地将其定向分化为临床相关谱系¹⁴ （请参见示意图） 图1）。视黄酸（RA）不能诱导在饲养层上维持的未分化hESCs发生神经元分化^{1, 14}而且与小鼠胚胎干细胞不同，对人胚胎干细胞分化形成的拟胚体（EBs）进行处理仅能略微提高其神经元的低产量^{1, 14, 15}然而，在筛选了多种小分子和生长因子后，我们发现这种确定的条件使得视黄酸（RA）足以高效地直接从多能性hESCs诱导神经外胚层的特化，并进一步发育为神经母细胞，最终在发育中的中枢神经系统中生成人类神经前体细胞和神经元。图 2我们定义了直接从多能性hESCs诱导神经母细胞的条件，无需经过多谱系拟胚体阶段，从而能够高效、可控地获得大量处于不同发育阶段的人类神经细胞，用于细胞治疗。

方案

1. 溶液与培养基的配制

1. 明胶包被液：0.1% (w/v) 明胶溶于ddH₂O中，经高压灭菌后于4°C保存。
2. Matrigel包被液。储存液：于4°C过夜缓慢解冻Matrigel（10 ml），加入10 ml冰浴预冷的DMEM或DMEM/F12，充分混匀，在无菌细胞培养超净台中分装为1 ml/管，-20°C保存。工作液：使用前于4°C缓慢解冻1 ml Matrigel分装液1–2小时，立即转移至14 ml预冷的DMEM或DMEM/F12中，在无菌细胞培养超净台中充分混匀后使用。
3. 人源层粘连蛋白包被液：使用前，在无菌细胞培养超净台中将1 ml人源层粘连蛋白溶液（0.5 mg/ml，溶于Tris缓冲NaCl溶液中，-80°C保存，使用前于4°C缓慢解冻1–2小时）用冰浴预冷的DMEM或DMEM/F12稀释至12.5 ml工作液（终浓度40 μg/ml）。
4. 生长因子储存液（500–1000倍浓缩液）：将生长因子以10 μg/ml浓度溶解于无菌缓冲液（0.5% BSA，1.0 mM DTT，10%甘油，1×PBS）中，分装为50–100 μl/管，-80°C保存。
5. 全反式维甲酸工作液（1000倍浓缩液）：10 mM溶于DMSO中，分装后-80°C保存。
6. 人胚胎干细胞培养基（hESC培养基）：DMEM/F12或KO-DMEM（80%）、KO血清替代物（20%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺（2 mM）、MEM非必需氨基酸（MNAA，1×）、β-巯基乙醇（100 μM），过滤后4°C保存，使用前添加20 ng/ml bFGF。或使用确定成分替代“敲除（KO）血清替代物”：DMEM/F12或KO-DMEM（100%）、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺（2 mM）、MNAA（1×）、MEM必需氨基酸（MEAA，1×）、β-巯基乙醇（100 μM），过滤后4°C保存，使用前添加bFGF（20 ng/ml）、人胰岛素（20 μg/ml）、抗坏血酸（50 μg/ml）、人激活素A（50 ng/ml）、人白蛋白/Albumax（10 mg/ml）、人转铁蛋白（8 μg/ml）。
7. 神经干细胞培养基（NSC培养基）：DMEM/F12（100%）、N-2添加剂（1×）、肝素（8 μg/ml）。

2. 包被平板

1. 用明胶包被培养板：向6孔板中每孔加入2.5 ml明胶溶液，在37°C恒湿培养箱中孵育过夜。
2. 用层粘连蛋白包被培养板：将已包被明胶的培养板冷却后去除明胶，向预冷的明胶包被6孔板中每孔加入2.5 ml Matrigel或人源层粘连蛋白工作液，在4°C孵育过夜。

3. 在确定条件下传代和接种未分化的人胚胎干细胞

1. 让 hESC 克隆生长至 5–7 天，将 hESC 培养板转移至解剖显微镜下（解剖台预热至 37°C），并在解剖用无菌罩内操作。
2. 选择待传代的 hESC 克隆。从形态学上看，这些克隆应含有 >75% 未分化的 hESC（细胞小而致密），通常略呈半透明（非白色堆积状细胞，非透明的已分化细胞），在解剖显微镜下具有清晰的边界。仔细勾勒所选克隆的轮廓，并使用 P2 无菌移液枪头边缘或拉制的玻璃毛细管去除克隆周围的分化成纤维细胞层及克隆中所有已分化的部分（如有）。请注意，多能性 hESC 处于一种短暂状态，即使在最佳培养条件下也会发生自发分化；尽管理想情况下希望细胞完全未分化，但在解剖显微镜下很难确认其 100% 未分化，通常认为 >75% 未分化即达到传代标准。已分化的细胞通常无法贴壁并继续生长，会在传代过程中被淘汰。
3. 通过抽吸去除含有漂浮脱落的已分化细胞的旧培养基。用不含 bFGF 的 hESC 培养基洗涤一次。每孔加入 3 ml 含 20 ng/ml bFGF 的新鲜 hESC 培养基。
4. 将未分化的 hESC 克隆切割成小块，并使用无菌移液枪头或拉制的玻璃毛细管使其脱离。
5. 将含有脱离克隆片段的培养基收集至 50 ml 锥形管中。用每孔 1 ml 含 20 ng/ml bFGF 的 hESC 培养基洗涤培养板一次，并将洗液一并收集。
6. 从包被好的新培养板中吸除 Matrigel 或人层粘连蛋白溶液。将含有克隆片段的 hESC 培养基按 4 ml/孔分装至 6 孔板中。轻柔地将培养板转移至培养箱，避免震荡，在湿润、37°C、含 5% CO₂ 的培养箱中静置过夜，使克隆片段贴壁，期间勿扰动。

4. 在含视黄酸的限定培养体系中对人胚胎干细胞进行神经诱导

1. 接种后第3天，吸除培养板每个孔中的大部分旧培养基，保留足够浸没hESC集落的培养基（切勿使hESC干燥）。每孔加入4 ml含有20 ng/ml bFGF和10 μM视黄酸的新鲜hESC培养基。
2. 每隔一天用含有20 ng/ml bFGF和10 μM视黄酸的新鲜hESC培养基更换旧培养基，继续培养至第7或第8天。集落内的所有细胞将发生形态学变化，转变为体积较大的分化细胞，并持续增殖。至第7或第8天，集落显著增大，覆盖培养孔表面，部分区域的细胞开始堆积成层。

5. 悬浮培养中持续的神经元分化

1. 将hESC培养板置于解剖显微镜下（预先将解剖载物台加热至37°C），并在解剖用无菌罩内操作。使用P2无菌移液枪头边缘或拉制的玻璃毛细管小心勾勒出克隆集落轮廓，并去除围绕集落的成纤维细胞层（即从集落迁移出的已分化细胞）。
2. 吸除含有漂浮脱落成纤维细胞的旧培养基。用不含bFGF的hESC培养基洗涤一次，每孔加入3 ml新鲜的不含bFGF的hESC培养基。
3. 将经神经诱导的hESC集落切割成小块，并使用无菌移液枪头或拉制的玻璃毛细管使其脱离。
4. 将含有脱离集落碎片的培养基收集至50 ml锥形管中。用1 ml/孔不含bFGF的hESC培养基洗涤培养板一次，并将洗液一并收集。
5. 将含有集落碎片的无血清hESC培养基按每孔4 ml分装至6孔超低吸附培养板中，置于37°C、湿润的培养箱内培养4–5天，以促进悬浮细胞团簇（神经母细胞）的形成。

6. 黏附培养条件下神经元表型的成熟

1. 将含有悬浮神经母细胞的培养基收集至一个50 ml锥形管中。以1400 rpm离心5分钟。尽可能吸除旧培养基，并加入等体积的新鲜神经干细胞培养基，其中含有VEGF（20 ng/ml）、NT-3（10 ng/ml）和BDNF（10 ng/ml）。
2. 用移液器反复吹打以混匀悬浮的神经母细胞，并将4 ml/孔分装至6孔板中。也可将神经母细胞接种于含VEGF（20 ng/ml）、NT-3（10 ng/ml）和BDNF（10 ng/ml）的无血清神经干细胞培养基中的层粘连蛋白/胶原（Matrigel）或人源层粘连蛋白聚合的三维基质中。将培养板置于37°C、湿润的培养箱中，过夜培养以使神经母细胞贴壁。
3. 每隔一天更换一次含有VEGF（20 ng/ml）、NT-3（10 ng/ml）和BDNF（10 ng/ml）的神经干细胞培养基。持续培养约2周后，开始出现大量带有神经突的神经元细胞网络及色素细胞，其数量随时间逐渐增加，可维持培养超过3个月。

7. 代表性结果：

视黄酸（RA）足以诱导在确定培养体系中维持的hESCs从多能性完全转变为神经外胚层表型图 2A）。当未分化的hESCs暴露于视黄酸（RA）时，集落内的所有细胞均会经历形态学变化，转变为较大的分化细胞，停止表达与多能性相关的标志物（如Oct-4），并开始表达多种与神经外胚层相关的标志物，例如HNK1、AP2和TrkC（图 2B）。这些大型分化细胞将继续增殖，克隆体积随之增大，并自发表达早期神经元标志物 β-III-tubulin（图 2B）。更成熟的神经元标志物Map-2将开始出现在细胞堆积的克隆区域图 2B）。随着神经外胚层细胞的出现及神经元分化，与多巴胺能神经元分化以及酪氨酸羟化酶（TH）基因激活相关的神经元特异性转录因子 Nurr1 也开始表达。¹⁶，将转位至细胞核（图 2B）。脱离后，经RA处理的hESCs将在悬浮培养中形成漂浮的细胞簇（神经母细胞），以继续神经分化过程。在去除bFGF后，将神经母细胞转移至组织培养板上使其贴壁，或接种于层粘连蛋白/胶原聚合的三维基质中，并在无血清的限定培养基中培养，随后将开始出现表达β-III-微管蛋白和Map-2、具有神经突的细胞以及色素细胞，其分化效率显著高于未经处理的hESCs在相同时间内的自发多谱系分化，且该状态可维持超过3个月。图 2C).

图1 通过添加小分子，高效且精确地将人多能干细胞定向诱导为特定临床相关谱系的示意图。

图 2 在确定条件下，视黄酸可直接从多能性诱导神经谱系特化及神经元进展。 （A）示意图显示了人胚胎干细胞（hESCs）定向神经元分化的实验方案时间线。（B）在确定的培养体系中，未分化的hESCs经视黄酸（RA）处理后，集落内出现大量Oct-4（红色）阴性分化细胞，而对照组（模拟处理，DMSO）则无此现象。RA诱导产生的Oct-4阴性分化细胞开始表达HNK-1（红色）、AP2（红色）、TrkC（绿色），随后表达β-III-微管蛋白（红色），符合早期神经外胚层分化的特征。这些细胞进一步成熟，最终表达神经元标志物Map-2（绿色），通常出现在细胞堆积的区域。伴随着神经外胚层细胞的出现和神经元分化，与多巴胺能神经元分化及酪氨酸羟化酶（TH）基因激活相关的神经元特异性转录因子Nurr1（绿色）发生核转位。所有细胞的细胞核均通过DAPI染色显示为蓝色。（C）RA处理高效诱导细胞向神经元谱系分化，表现为广泛存在的表达β-III-微管蛋白（红色）和Map-2（绿色，显示于三维基质中）的神经突网络。箭头指示具有中枢神经系统特征的色素细胞。插图中所有细胞的细胞核均通过DAPI染色显示为蓝色。比例尺：0.1 mm。

讨论

将多能性人类干细胞广泛而多样的分化潜能高效且可预测地导向特定表型，一直是发育研究和临床转化面临的主要挑战之一。尽管这类细胞能够自发分化 体外 通过多谱系聚集体阶段向所有胚层的细胞分化，但仅有少数细胞会选择特定谱系^1,4在这些由hESC衍生的细胞聚集体中，常同时出现大量广泛分化的非目标细胞类型，这些细胞可能来源于三个胚胎胚层，使得目标表型的出现不仅效率低下，而且难以控制且不可靠。尽管已有文献报道成功获得了心肌和神经谱系细胞，但通过多能细胞的胚层诱导生成特化细胞的效率低下，以及移植后存在较高的致瘤风险，阻碍了其进一步的临床转化。

人类胚胎干细胞系最初是在与经生长阻滞的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）共培养的条件下建立并维持的⁴。尽管目前已开发出多种人类饲养层、无饲养层以及化学成分明确的培养体系用于培养人类胚胎干细胞（hESCs）^11-13，但维持人类多能细胞自我更新所必需且充分的因子仍未完全阐明。这些外源性饲养细胞和生物制剂虽然有助于维持未分化hESC的长期稳定生长，但同时也掩盖了多能细胞对发育信号的响应能力。在一种定义明确且不含生物制剂的培养体系中维持未分化的hESC，使其能够可靠扩增并可控地定向分化，是实现其治疗应用潜力的关键之一。在既往报道的含有外源性饲养细胞的培养条件下，视黄酸（RA）不足以诱导未分化hESC向神经细胞分化。尽管神经谱系在hESC分化过程中较早出现，但用RA处理多谱系分化的hESC聚集体（类胚体）仅能略微提高神经元的低产量^{1, 14, 15}。为了实现将人类多能干细胞高效、均一地转化为特定谱系，我们采用了一种定义明确的培养体系，该体系可确保未分化hESC的增殖，从而筛选出仅通过添加小分子即可高效、可控地将多能hESC特异性诱导为特定临床相关谱系的条件（图1，图2）。未来的研究将揭示在人类中枢神经系统发育中起遗传与表观遗传调控作用的分子，这些发现可能为利用小分子直接调控hESC多能性命运提供替代策略，从而推动临床相关谱系在再生治疗中的应用。在不使用RA处理的情况下，仅有1-5%的hESC会自发分化为神经元^{1, 14, 15}。而在使用RA处理后，我们能够在定义明确的无饲养层培养体系中，将hESC转化为超过>95%的胚胎神经前体细胞和神经元，该过程可能模拟了人类胚胎发育过程¹⁴。最近，已知的决定神经命运的基因被用于将小鼠成纤维细胞直接转分化为成体神经前体细胞和神经元，但效率较低，仅为0.5-8%^{17, 18}。然而，重编程的体细胞历来存在异常基因表达和加速衰老的问题，限制了其治疗应用价值^19-21。最后，本研究建立的方案仅适用于来源于人类囊胚内细胞团（ICM）或上胚层的多能hESC⁴，可能不适用于其他类型的多能细胞，包括动物来源的胚胎干细胞、来源于更早期桑葚胚（八细胞期）胚胎的ESC²²，以及人工重编程的细胞²³。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
明胶	Sigma-Aldrich	G1890
Matrigel	BD Biosciences	356231	生长因子减少型
人层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L6274
全-反式-维甲酸	Sigma-Aldrich	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out 血清替代物	Invitrogen	10828028
MEM 非必需氨基酸溶液（MNAA，100X）	Invitrogen	11140050
MEM 氨基酸溶液（MEAA，100X）	Invitrogen	11130050
β-巯基–乙醇	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4403
人转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T8158
人 bFGF	PeproTech Inc	AF-100-18B
人胰岛素	Invitrogen	12585014
人激活素 A	PeproTech Inc	120-14E
人 BDNF	PeproTech Inc	AF-450-02
人 VEGF	PeproTech Inc	AF-100-20
人 NT-3	PeproTech Inc	450-03
肝素	Sigma-Aldrich	H5284
N-2 添加剂（100X）	Invitrogen	17502048
6 孔超低吸附培养板	Corning	3471
6 孔培养板	Corning	3516