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肿瘤中蛋白质表达异质性的定量免疫荧光图谱绘制

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DOI：

10.3791/3334

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2011年10月25日

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1Division of Pathology, University of Edinburgh, 2HistoRx Inc.

本文内容

摘要

本文介绍一种利用定量免疫荧光、图像分析及异质性统计度量方法，在肿瘤组织病理切片中量化分子异质性的技术。该方法适用于临床生物标志物的开发与分析。

摘要

在个体肿瘤内部存在的形态学异质性，已在外科实践中被病理学家广泛认知。这种异质性常表现为可识别的组织学亚型中出现不同分化区域，或病理分级不同；但有时也存在更为细微的表型差异，难以进行准确分类（图1）。最终，由于形态学特征由潜在的分子表型决定，因此具有明显形态差异的区域很可能伴随有调控细胞功能与行为的蛋白质表达差异，从而导致外观上的不同。目前，形态可见与不可见（分子层面）的异质性对预后的影响尚不明确，但最近的研究证据表明，至少在遗传水平上，原发性肿瘤中确实存在异质性1,2，其中部分亚克隆可发展为转移性（因而具有致死性）疾病。

此外，某些蛋白质被用作生物标志物，因为它们是治疗的靶点（例如，他莫昔芬的靶点为ER，曲妥珠单抗（赫赛汀）的靶点为HER2）。如果这些蛋白质在肿瘤内的表达具有异质性，则治疗反应也可能存在差异。目前广泛使用的免疫组织化学组织病理学评分系统，要么忽略了蛋白表达的量化，要么仅以数值方式对其进行均质化处理。同样，在破坏性技术中，肿瘤样本被均质化处理（如基因表达谱分析），虽可获得定量信息，但空间信息会丢失。胰腺癌中的遗传异质性图谱研究，以往依赖于单细胞悬液的制备3，或宏观解剖分离技术4。最近一项研究利用量子点对前列腺癌组织中的形态学和分子异质性进行图谱绘制5，证明了形态学与分子图谱绘制的可行性，但未能实现对异质性的定量分析。由于免疫组织化学最多仅为半定量方法，且易受观察者间和观察者内偏差的影响，因此需要更敏感、更定量的方法，以准确地在原位（in situ）对组织异质性进行图谱绘制和定量分析。

我们开发并应用了一种实验与统计方法，以基于全自动定量分析（AQUA）系统6，对肿瘤组织切片中蛋白质表达的异质性进行系统性量化。组织切片使用特异性抗体进行标记，这些抗体靶向细胞角蛋白及感兴趣的靶点，并与荧光标记的二抗偶联。载玻片通过全切片荧光扫描仪进行成像。图像被划分为数百至数千个图块，每个图块均被赋予一个AQUA评分，该评分用于衡量组织上皮（肿瘤）成分内蛋白质的浓度。通过采用最初源于生态学的统计学异质性度量方法——基于辛普森多样性指数7，生成热图以表示蛋白质在组织中的表达情况，并计算相应的异质性评分。

迄今为止，尚无研究系统地在组织学样本中同步绘制并量化这种变异性与蛋白质表达的关系。本文展示了该方法首次应用于卵巢癌中ER和HER2生物标志物表达的分析。通过此方法，可在转化医学研究中将异质性作为独立变量来分析生物标志物的表达，从而确立异质性在预后判断及治疗反应预测中的重要意义。

方案

1. 组织制备

  1. 切片
    1. 使用旋转式切片机将福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织块切成 4 μm 厚的切片。
    2. 将切片转移至带正电荷的显微镜载玻片上。
    3. 将载玻片置于 37 °C 烤箱中孵育过夜。
  2. 储存
    1. 将切片储存在 -18 °C 至 -25 °C 的冷冻箱中，以防止抗原性丧失。

2. 组织切片的免疫荧光染色

  1. 脱蜡与复水
    1. 将切片在二甲苯中脱蜡两次，每次 5 分钟。
    2. 依次在 99%、99%、80%、50% 乙醇及流动自来水各中复水 2 分钟。
  2. 抗原修复
    1. 使用 0.15 mM 柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0），在压力锅中微波加热进行抗原修复，持续 5 分钟。
    2. 室温冷却切片 20 分钟。
    3. 在摇床上用 0.05% PBST 清洗切片 5 分钟。
  3. 封闭步骤
    1. 用 3% 过氧化氢处理切片 10 分钟。
    2. 在摇床上用 0.05% PBST 清洗切片 5 分钟。
    3. 将切片置于 Sequenza 免疫染色架中。
    4. 用无血清蛋白封闭液处理切片 10 分钟。
  4. 一抗孵育
    1. 将一抗用 Dako 抗体稀释液按最佳稀释比例稀释后，室温孵育 1 小时。
    2. 用 0.05% PBST 清洗三次，每次 5 分钟。
  5. 上皮细胞标记物（细胞角蛋白）孵育
    1. 将小鼠抗广谱细胞角蛋白抗体（mouse anti-pan cytokeratin）用 Dako 抗体稀释液按 1:50 稀释，4 °C 过夜孵育。
  6. 上皮细胞标记物显色
    1. 将羊抗小鼠 Alexa555 二抗按 1:25 稀释于预稀释的 Envision 羊抗兔 HRP 抗体溶液中，避光孵育 1.5 小时，室温。
    2. 用 0.05% PBST 清洗三次，每次 5 分钟。
  7. 目标信号显色
    1. 将切片从 Sequenza 架转移至湿盒中。
    2. 将信号放大稀释液（HistoRx 管 E）与 Cy5 酪胺（HistoRx 管 F）按 1:50 混合，涡旋充分混匀，避光孵育 10 分钟，室温。
    3. 用 0.05% PBST 清洗三次，每次 5 分钟。
    4. 用 80% 乙醇脱水 1 分钟。
    5. 避光自然晾干切片。
  8. 复染与封片
    1. 在盖玻片上滴加 DAPI 封片剂，覆盖于组织切片上。
    2. 切片避光过夜干燥。
    3. 切片干燥后，用指甲油封固以确保长期保存，并置于 4 °C 冰箱中保存。

3. 使用全切片扫描进行图像采集

  1. 将最多五张载玻片装入 Aperio ScanScope FL 扫描仪的载玻片盒中。
  2. 对于每张载玻片，使用 ScanScope 控制台界面选择需要成像的大致区域。所选区域应包含载玻片上的全部组织，无论其染色模式或样本的其他可观测特征如何。
  3. 使用 ScanScope 控制台，针对每个通道（DAPI、Cy3 和 Cy5）确定最佳曝光时间，步骤如下：
    1. 选择一个待检测的组织区域——理想情况下，该区域应位于组织的肿瘤区域，以提供最具代表性的结果。
    2. 利用 ScanScope 控制台的自动曝光功能，评估每个通道建议的曝光时间，并同时检查图像聚焦情况。
    3. 在每个样本的最多 3–5 个不同区域重复上述步骤，以确认该曝光值的稳定性。
  4. 在组织区域之外、但仍处于盖玻片覆盖范围内的区域中，选择一个额外的区域（在 ScanScope 控制台图像中以蓝色菱形显示），用于定义背景区域，以便为每个滤光片采集平场校正图像。
  5. 在正式成像前请先审阅这些图像。如果图像显示背景过高或其他成像伪影，则应移动图像区域并重新采集新图像。
  6. 采集的数字切片图像将自动上传至 Aperio Spectrum 数据库。

4. AQUA 自动化图像分析

  1. 在 Spectrum 数据库中查看数字全切片图像，并结合整个组织及染色模式标注感兴趣的肿瘤区域。
  2. 在 Spectrum 数据库的数字切片列表中，通过双击缩略图图像（或者选中图像旁边的复选框，然后从列表顶部菜单中选择“View Images”）选择要使用 AQUAnalysis 分析的切片。此操作将自动打开 ImageScope 软件并加载组织样本的彩色融合图像。
  3. 使用该软件提供的工具浏览图像。
  4. 根据配套的 H&E 染色图像（可以是实物切片或已标注的图像），在荧光图像上标注感兴趣的区域。单个样本上可选择多个感兴趣的区域，即多个独立圈选的区域。软件还提供“negative”工具，用于排除所选区域内的特定部分（例如受损组织、组织学质量差的区域、非肿瘤区域、碎片等）。
  5. 保存图像上的标注图层。
  6. 返回 Spectrum 主菜单，选中刚刚完成标注的图像旁边的复选框，然后从列表顶部的菜单栏中选择“Analyze”。
  7. 在弹出的分析窗口中，从下拉菜单中选择“HistoRx AQUA Analysis”。
  8. 如果存在多个标注图层，请使用复选框选择用于分析的合适图层。
  9. 准备就绪后，点击“Analyze”按钮开始分析。
  10. 此时，Windows 任务栏中将出现一个最小化的控制台窗口，显示图像从 Spectrum 数据库传输到本地计算机的进度（即“pull”操作）。
  11. 数据传输完成后，AQUAnalysis 将自动启动。用户可使用该软件的所有内部功能查看、浏览和分析图像。
  12. 来自 Spectrum 数据库的图像标注区域将被分割为 512×512 像素的图像瓦片，每个瓦片将被单独评分。
  13. 本研究采用基于数据聚类的无监督 AQUA 评分算法8。该算法生成 AQUA 评分的步骤如下：
    1. 对泛细胞角蛋白图像信号进行高于背景的阈值处理，利用这些像素定义肿瘤“掩膜”（mask），用于后续计算。高表达的泛细胞角蛋白像素同时界定肿瘤细胞的胞质/非核区域。
    2. 在肿瘤掩膜内，DAPI 通道信号较强的像素被识别为核内区域。
    3. 聚类算法还会分析 DAPI 染色或细胞角蛋白表达强度较低的像素，并尝试将其部分归类至核区、胞质区或背景。
    4. 当所有像素均被分配至某一肿瘤区室或背景后，计算目标蛋白（ER 或 HER2）在各区域内的信号强度，并根据区域大小进行归一化，从而生成 AQUA 评分。
    5. 对于肿瘤区域代表性不足的图像（定义为肿瘤像素占比低于 5%）不予评分，这些区域的“Final Result”值标记为“Fail”，可在后续统计分析中予以剔除。
    6. 此外，若操作人员在复查时发现某些视野因样本或成像伪影（如组织折叠、碎片等）而不适合评分，则将这些视野从评分中剔除，并将其“Final Result”标记为“Fail”。
  14. AQUA 评分的结果是以表格形式呈现的分数，对应于整个组织切片样本中每个感兴趣区域内的 512×512 像素瓦片。这些 .CSV 格式的文件可用于后续统计分析。

5. 统计学分析：所有统计学分析均在 SPSS (IBM) 中进行

  1. 在可能的情况下，对于大规模操作，生成 SPSS 语法代码文件（.sps）以执行数据处理和分析步骤。示例语法代码作为补充文件提供。
  2. 将数据文件读入 SPSS。删除原始数据中未使用的变量（例如仪器特定参数、未使用区室的 AQUA 评分）。
  3. 对于区域“最终结果”为“失败”的情况（见上文），将这些值标记为 SYSMIS，从而将其从数值分析中排除。
  4. 将每个标志物（ER 或 HER2）所有切片的数据汇总为一个 SPSS 格式的主数据集。后续所有计算均使用此主文件。
  5. 使用 SPSS 语法文件（每种标志物各一个：ER 或 HER2（参见补充语法文件）），进一步验证数据并按如下方式计算 Simpson 多样性指数：
    1. 生成一个主分析文件，以防止修改先前生成的主数据集。
    2. 将主数据集与生成的原始数据和图像进行比对验证。
    3. 为每个样本的 AQUA 评分生成描述性统计量（视野数量、平均评分、中位数评分、最低评分、最高评分以及样本评分的标准差）。
    4. 随机抽取部分结果，与原始输出文件及评分所依据的原始图像数据进行核对。
  6. 为生成热图图像（见图 2 和图 3）：
    1. 使用 SPSS 中的“可视化分段”（Visual Binning）功能，将 AQUA 评分数据划分为八个独立等级。对于 ER，使用核评分；对于 HER2，使用胞质评分。
    2. 划分等级时，确保每个等级代表整个数据集中相同比例的病例。
    3. 使用 SPSS 的“拆分文件”（Split File）功能，使所有后续输出均按“每张切片/样本”进行。
    4. 根据每个区域的 x、y 坐标（对应 512×512 的图块）进行绘图，并根据其所属的等级赋予相应颜色（见图 2 和图 3）。
  7. 为生成异质性评分，编写代码以基于 AQUA 评分计算 Simpson 多样性指数。
    1. 本文所用的 Simpson 多样性指数定义如下：
      Simpson 多样性指数公式，静态平衡方程，教育数学概念。
      其中 N 表示某个样本所使用的评分/视野总数，n 表示某一组标准化评分中包含的评分/视野数量（按如下所述生成）。
  8. 使用上述描述的主分析文件作为数据源。在所示示例中，所有 ER 计算均使用核 AQUA 评分，HER2 计算均使用胞质 AQUA 评分。对每个样本/切片执行以下计算。
  9. 由于荧光数据存在方差不稳定性，误差幅度随信号强度增加而增大，因此对所有 AQUA 评分进行以 2 为底的对数归一化处理。
  10. 进一步将归一化后的（对数转换后）数据转换为 z-（标准）分数。
    1. z-分数转换的计算公式如下：Z =（AQUA 评分 - 某一样本所有评分的平均值）/ 该样本评分的标准差。该转换将评分分布转化为以零偏差为中心值的偏差分布。
  11. 将这些 z-分数值划分为六个组（<-2、-2 至 -1、-1 至 0、0 至 1、1 至 2、>2）。
  12. 计算分配至每个组的数值数量，并对每组求和。结合总视野数，利用该值计算用于指数的六个组各自的数值。
  13. 将这些数值求和后从 1 中减去，得到多样性指数。
  14. 多样性指数反映了特定样本评分围绕均值的离散程度。因此，较高的指数表示评分分布更广，即表达异质性更高；相反，较低的指数表示表达测量值变异较小，样本中表达更均一。这一点在图 2 和图 3 中有所体现。

6. 代表性结果：

对于卵巢癌患者而言，靶向治疗（如他莫昔芬和曲妥珠单抗等毒性相对较低的药物）尚未成为标准治疗方案。已有充分证据表明，以铂类-紫杉烷类药物作为一线化疗方案在治疗卵巢癌方面优于其他化疗方案9-13。尽管最初有70%-80%的患者对治疗产生应答，但大多数患者最终会复发并死于该疾病。检测可能预测对替代疗法应答情况的生物标志物，有助于为每位患者选择个体化治疗方案。由于化疗对肿瘤施加了选择压力，存活下来的肿瘤细胞可能具有不同的特征，代表了治疗前肿瘤中的一个亚群；因此，量化这种变化可能具有重要意义。我们应用异质性图谱分析方法，对卵巢癌患者在化疗前后组织样本中ER和HER2的表达情况进行分析，以测量其表达水平的定量变化，并评估治疗前后生物标志物表达之间的关系。ER和HER2在单个肿瘤内部均表现出显著的异质性；在某些肿瘤中，治疗后辛普森指数由较高的异质性转变为较低的异质性，表现为辛普森指数评分下降（见图2和图3）。这一结果支持了细胞毒化疗可引发克隆选择的观点；更重要的是，这一现象可被利用于针对残留肿瘤细胞群的靶向治疗，从而更有效地实现癌症患者的个体化治疗。

显微镜下的乳腺组织病理学；病理检查中的细胞形态。
图1. 同一例卵巢癌不同区域的苏木精-伊红染色显微照片，显示形态学差异。（A）×40倍显微照片显示肿瘤两个相邻区域具有不同的形态。高倍视野（×200）显示肿瘤上部区域（B）细胞胞质透明，呈实性生长模式；而组织下部区域（C）胞质呈较均一的嗜酸性，呈乳头状生长模式。然而，该肿瘤在后续治疗中将被归类为浆液性乳头状组织学亚型。

雌激素受体分析；治疗影响热图；数据比较；高到低表达。
图 2. 卵巢癌细胞角蛋白阳性组织中雌激素受体（ER）蛋白表达在治疗前（上图）和治疗后（下图）的异质性热图。

治疗前后以热图显示的HER2蛋白表达水平；颜色编码的强度图。
图3. 治疗前（上图）和治疗后（下图）细胞角蛋白阳性卵巢癌组织中HER2蛋白表达的异质性热图。

讨论

本文所述方法可用于对肿瘤组织的标准福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中的分子异质性进行量化。该方法能够为组织切片中异质性的程度赋予一个数值，从而可在生物标志物的开发与分析中将此作为变量加以考虑。通常情况下，组织生物标志物的表达越均一越理想，因为这会使检测对取样误差或偏差的敏感性降低；但在某些情况下，将异质性本身作为一个参数进行量化也可能是有意义的。例如，在雌激素受体（ER）和人表皮生长因子受体2（HER2）的示例中可见，常见的生物标志物在表达上表现出显著的异质性，而目前尚不清楚这种异质性是否分别独立地影响临床预后或对治疗的反应。同样，如图所示，治疗本身可能动态改变细胞亚群的组成，因此对靶标富集程度的测量可能有助于指导治疗决策。

然而，该技术受到与传统组织病理学或生物标志物（如免疫组织化学）分析相同的因素限制。结果依赖于所分析组织的类型、大小和质量，因此单个组织切片可能无法代表整个肿瘤。事实上，辛普森指数可能因组织大小（捕获的图像帧数和测量的AQUA评分）而产生偏差。所检测表位的免疫原性可能受不可控的分析前因素影响，导致其在组织切片中的表达出现人为改变（如冷缺血时间、固定时间长短以及边缘伪影）。这一问题对于磷酸化表位尤为突出，因其稳定性极差14, 15。因此，该技术可能更适用于手术切除标本而非小活检样本，并且应基于多个切片而非单一切片进行分析。最终，三维成像技术可能为更准确地量化该参数提供新的机会。

该技术的应用也可能受到生物学因素的限制，例如细胞角蛋白掩蔽表位表达的变异性。在某些经历上皮-间质转化（EMT）或富含非上皮成分或干细胞的癌症（包括卵巢癌和乳腺癌）中，这一问题可能尤为突出16，最近已在接受化疗的卵巢癌中观察到此类现象 体外17，以及乳腺癌患者对治疗的反应18这一局限性可通过使用替代的封闭抗体（或抗体混合物）来克服，例如细胞角蛋白联合波形蛋白抗体，后者在上皮-间质转化（EMT）过程中表达上调。16此外，由于组织的其他组分（微环境），如成纤维细胞或血管内皮细胞也逐渐成为生物治疗的靶点，该技术还可进一步拓展用于评估这些组分，通过针对特定区域的特异性标记物（如使用 PECAM/CD31 标记血管内皮细胞）生成相应的掩模进行评分。

尽管由于辛普森指数（Simpson's index）的简便性，本方案中已将其调整后用作异质性的度量指标，但也可采用其他异质性度量方法，例如对集中趋势的简单测量（均值、方差、中位数等）。此外，辛普森指数的计算方法也可根据特定的测试群体进行调整以更适配实际需求。使用Z分数转换可使评分更适用于多重标记物分析，因为此类方法基于数据集均值的偏离程度来评估异质性。然而，这种转换方式在评分的整体范围上可能存在局限性。某些实验设计可能更适合直接将特定标记物组所有样本的实际AQUA评分进行分箱处理。分箱数量及截断值的选择同样会限制最终得分值的范围，因此可能需要针对不同的实验设计进行优化。

在本研究中，我们选用雌激素受体（ER）和人表皮生长因子受体2（HER2）作为候选生物标志物，因为它们已在临床中应用，有助于回答有关靶向治疗疗效的临床问题，并且已知在原发性和远处病变中表现出显著的异质性及动态变化19。然而，最佳的异质性标志物仍有待确定。其他可能的标志物包括克隆性的细胞遗传学标志物，例如既往在间期FISH研究中使用过的标志物20。该方法还需在大规模、注释完善的临床队列或临床试验中进一步验证，以确立该参数在肿瘤生物学中的相关性。

披露

JC、MG、CJ 和 CS 是 HistoRx, Inc. 的员工。

致谢

本工作部分得到了苏格兰资助委员会（资助编号 HR07005；http://www.sfc.ac.uk/）、苏格兰医学研究基金会（http://www.medicalresearchscotland.org.uk/）、英国癌症研究基金会实验癌症医学中心（http://www.cancerresearchuk.org/）以及突破性乳腺癌基金会（http://breakthrough.org.uk/）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ScanScope FLAperio TechnologiesScanScope FL按供应商配备使用
SpectrumAperio TechnologiesSpectrum配置和目录编号将根据各本地机构的数据库和IT结构设置而有所不同
AQUAnalysis，联合使用 AQUAjustmentHistoRxV2.3AQUAjustment 软件包可使 AQUAnalysis 使用存储在 Spectrum 中的图像
HER2DakoA04851:400 稀释
小鼠抗全角蛋白抗体（mouse anti-pan cytokeratin）DakoM35151:50 稀释
抗体稀释液DakoS0809
Envision 羊抗兔 HRPDakoK4003
蛋白封闭剂DakoX0909
羊抗小鼠 Alexa555InvitrogenA21422
DAPI 封片介质InvitrogenP36931
Cy5 酪胺HistoRxAQ-EMR1-00001
Sequenza 免疫染色中心Thermo Fisher Scientific, Inc.73300001本研究中用于台式免疫荧光染色

参考文献

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