传统的二维细胞培养技术通常会导致分化标志物、细胞因子和生长因子等特性的改变。在旋转细胞培养系统（RCCS）中进行三维细胞培养可重建许多此类因子的表达，本文以绒毛外滋养层细胞系为例展示了这一效果。
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方法文章
用于人类细胞培养的旋转细胞培养系统：以人类滋养层细胞为模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人类滋养层研究领域有助于理解胎盘形成过程中所建立的复杂环境。由于这些研究的特性，人类 体内 实验无法进行时，可结合使用原代培养、外植体培养和滋养层细胞系1 支持我们对子宫壁侵袭过程的理解2 子宫螺旋动脉的重塑3,4 由滋养层外滋养细胞（EVTs）介导，这对于成功建立妊娠至关重要。尽管从这些模型中已获得大量知识，但人们普遍认为 体外 使用EVT样细胞系的细胞培养模型与其原始细胞相比表现出改变的细胞特性 体内 对应物5,6在旋转细胞培养系统（RCCS）中培养的细胞表现出更接近分化中滋养层样细胞系的形态学、表型和功能特性 在子宫内 EVTs中，介导侵袭（如基质金属蛋白酶（MMPs））和滋养层细胞分化的基因表达上调7,8,9圣乔治医院胎盘细胞系-4（SGHPL-4）（由Guy Whitley博士和Judith Cartwright博士惠赠）是一种类似滋养层外细胞（EVT）的细胞系，用于在RCCS中进行测试。
RCCS 培养容器的设计基于器官和组织在三维（3-D）环境中发挥功能的原理。由于容器内具有动态的培养条件，包括生理相关的剪切力，细胞在三维环境中生长时会依据天然的细胞亲和性形成聚集体，并分化为类器官组织样结构。 关键词：RCCS 培养容器，三维培养，剪切力，细胞聚集体，类器官组织样结构10,11,12 维持流体轨道可提供低剪切力、低湍流的环境，类似于所发现的条件 在体内 通过调节RCCS的旋转速度以抵消培养细胞的沉降，确保细胞持续处于自由下落状态。气体交换通过生物反应器后部的透性疏水膜进行。与其亲本组织相似 在体, 在多孔微载体珠表面培养的细胞能够响应三维空间中的化学和分子梯度（即在其顶面、底面和侧面），因为细胞生长于这种支持结构的表面。当细胞在塑料等不可渗透的表面上以二维单层形式生长时，其底面的重要信号交流受到限制。因此，培养环境施加的空间限制深刻影响细胞感知和解码周围微环境信号的方式，提示三维环境在细胞行为调控中具有重要作用13.
我们已利用RCCS构建了多种人体上皮组织的具有生物学意义的三维模型7,14,15,16。事实上，许多先前的研究已证明，在RCCS中培养的细胞能够呈现出其他模型无法实现的生理相关表型10,17-21。总之，在RCCS中进行培养是一种简便、可重复、高通量的技术平台，可获得大量已分化的细胞，适用于多种实验操作。 在以下实验方案中，我们以EVTs为例，详细描述了在RCCS中进行贴壁细胞三维培养所需的操作步骤。
方案
1. 胶原蛋白珠制备
- 在接种 EVT 进行三维细胞培养之前，需要先准备 Cytodex-3 微载体珠：
- 称取实验所需适量的 Cytodex-3 珠。本方案适用于 10 mL RCCS 培养器，需使用 0.05 g 珠。对于 50 mL RCCS 培养器，应按比例调整。在 50 mL 可高压灭菌的锥形管中，将 250 mg Cytodex-3 珠与 12 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）混合。此量足以用于 5 个 RCCS 培养器。
- 确保锥形管中有足够的液体体积，因为高压灭菌过程会导致蒸发。将管盖松松盖上，于 110°C 高压灭菌 10 分钟。
- 高压灭菌程序结束后取出锥形管，使 Cytodex-3 珠溶液冷却。
- 待锥形管冷却至室温后，采用无菌操作技术，用 1× DPBS 将总体积补至 12.5 mL。
- 盖紧管盖，将制备好的 Cytodex-3 珠于室温下储存。使用前应让珠充分溶胀并恢复至室温。上述制备方法可满足五个 10 mL RCCS 培养器的需要。我们观察到，Cytodex-3 珠在室温下长期储存会导致性能下降，因为胶原在约一个月后会变得不稳定。Cytodex-3 珠的粒径范围为 133–215 μm。
2. 培养基制备
准备1L适用于RCCS的优化GTSF-....
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讨论
本文介绍的培养技术可为研究人员提供具有高度侵袭性的类似EVT的细胞。目前人们已认识到，由于抑制了细胞对三维环境（顶端、基底和侧向细胞表面）中化学和分子信号的响应，单层培养中会出现细胞分化丧失的现象。10,13该技术反映了所观察到的特征 在子宫内 在侵袭性EVT细胞上。由于该操作模拟了传统的单层组织培养的时间动力学，但可提供差异表达的细胞，因此可采用比较分析实验。细胞簇可在任意时间收获并用于实验，既可直接作为细胞簇使用，也可通过胶原降解获得单细胞悬液。Cytodex-3微载体珠可替换为其他涂有不同细胞外基质（ECMs）的支架或微载体珠，以更好地满足不同实验室的特定研究需求。此外，还有多种其他三维培养平台可能更适用于特定细胞类型的培养条件，例如细胞培养插入物和旋转烧瓶。10,23需要注意的是，在这些条件下，培养动力学可能有所不同，应针对具体情况分别确定。可通过定期从RCCS中取出样品，检测特异性分化标志物的表达、增殖情况及细胞活力，以简便地评估培养动力学。15通过随时间推移与传统单层组织培养技术进行比较，可确定最佳的增殖与分化动力学。以 SGHPL-4 细胞.......
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助，资助号为 NIH/NICHD #HD051998（授予 C.A.M.）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞微载体珠（Cytodex microcarrier beads） | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| 旋转式细胞培养系统（Rotating Cell Culture System, RCCS） | Synthecon | RCCS-D | 包含转子底座、电源、4个一次性RCCS单元 |
| RCCS一次性单元（RCCS Disposable Units） | Synthecon | 联系Synthecon | |
| 3 ml鲁尔锁式针筒（3ml Luer-Lock tip syringe） | BD Biosciences | 309585 | |
| 10 ml宽口移液管（10ml wide-tip serological pipette） | BD Biosciences | 357504 | |
| MEM α培养基（MEM Alpha） | Invitrogen | 12561-072 | |
| Leibovitz’s L-15培养基粉末（Leibovitz’s L-15 medium, powder） | Invitrogen | 41300-039 | |
| 无内毒素水（H2O, Endotoxin free） | Fisher Scientific | MT-25-055-CM | |
| 碳酸氢钠（Sodium Bicarbonate） | Sigma-Aldrich | S-7795 | |
| 蛋白胨（Peptone） | Fisher Scientific | BP1420-100 | |
| 果糖（Fructose） | Sigma-Aldrich | F3510-100 | |
| 半乳糖（Galactose） | Sigma-Aldrich | G5388-100 | |
| 葡萄糖（Glucose） | Sigma-Aldrich | G7528-250 | |
| HEPES缓冲剂（HEPES） | Invitrogen | 15630-080 | |
| L-谷氨酰胺（L-Glutamine） | Invitrogen | 25030 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠添加剂（Insulin-Transferrin-Sodium Selenite, ITS） | Sigma-Aldrich | I1884 | |
| 胎牛血清（FBS） | Invitrogen | 10437 | |
| 青霉素-链霉素双抗（Penicillin-Streptomycin） | Invitrogen | 15140 |
参考文献
- Knofler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. Int. J. Dev. Biol. 54, 269-269 (2010).
- Cartwright, J. E. Remodelling at the maternal-fetal interface: relevance to human pregnancy disorders.....
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