我们提供了一种示踪剂递送的实用指南 体内 并以脊髓小脑通路为模型系统，演示在小鼠中成功进行神经环路分析的关键步骤。我们详细描述了一种灵活的示踪方案，该方案利用与Alexa荧光染料偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）。
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摘要
摘要
神经回路被组织成功能性的拓扑图谱。为了可视化复杂的回路结构，我们开发了一种可可靠地标记多种拓扑投射全局模式的方法。小脑是研究神经回路有序排列的理想模型。例如，脊髓小脑苔藓纤维的区室化组织已被证明是研究苔藓纤维投射模式不可或缺的系统。我们最近发现，与Alexa 555和488偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）可用于示踪发育期和成年小鼠中的脊髓小脑苔藓纤维投射（Reeber等，2011年）。我们发现WGA-Alexa示踪剂具有三个重要特性，使其成为标记神经投射的理想工具。第一，Alexa荧光染料亮度高，强度大，可在示踪后直接进行整体成像。第二，WGA-Alexa示踪剂能够标记发育期和成年神经投射的完整路径。第三，WGA-Alexa示踪剂可在顺行和逆行方向上快速运输。本文中，我们将详细描述如何制备示踪剂及其他所需工具、如何进行脊髓小脑示踪手术，以及如何最佳地对示踪后的投射进行三维成像。总之，我们提供了一套逐步操作的示踪方案，不仅有助于解析小脑中功能图谱的组织与连接性，也适用于大脑皮层、脑干和脊髓的功能图谱研究。
方案
1. 示踪剂的递送 体内 采用无菌手术（第1.1–1.16节）
在整个操作过程中，建议采用标准的无菌外科技术。这包括使用无菌手套、手术衣和面罩。器械应在使用前进行高压灭菌，或先用清水彻底清洗，再用乙醇消毒。在手术过程中，尤其是在每只动物之间，应清除器械上的组织碎片，并使用热珠灭菌器对器械进行干热灭菌（Steri 250 货号 # 18000-45，Fine Science Tools）。此外，必须合理组织工作区域，设置专门用于动物准备（如剃毛等）、手术操作以及术后恢复的区域，以便于监测动物状态、提供保温措施并根据需要给予镇痛药物。成功开展可存活手术的关键在于降低感染风险，并实施积极的术后护理策略。有关本实验方案所需全部设备和试剂的详细信息，请参见下表。
- 通过腹腔注射（i.p.）给予新鲜配制的 Avertin（2,2,2-三溴乙醇，Sigma，St. Louis MO；货号 # T48402）以麻醉成年小鼠，剂量为每10克体重0.2 ml。其他麻醉剂如异氟烷或氯胺酮/甲苯噻嗪同样有效，但在使用前请确保您的实验室已获得必要的机构和联邦批准。若使用幼鼠（P0–P10），可将其置于碎冰上麻醉10–15分钟。确保每只幼鼠的皮肤不直接接触冰块（例如，可将其置于乳胶手套的指端内），因为冷水会迅速导致致命性低体温。通过用镊子或手指夹捏动物后肢脚趾进行痛觉反射测试，确认动物已达到可接受的麻醉深度。若存在屈肌反射，需继续等待直至动物对该刺激无反应，表明已进入更深的麻醉状态。
- 待动物完全麻醉后，将其仰卧于无菌纱布垫上，头部朝远离操作者方向，尾部朝向操作者。使用毛发剪剃除手术区域的毛发，以获得足够宽广且清晰的手术视野，便于进入中枢神经系统。用两组酒精棉片擦拭剃毛区域，随后使用70%酒精/碘伏，最后再用酒精棉片清洁一次。清洁手术区域时应采用由内向外的环形擦拭方式。您可选择将一块无菌纱布垫中央剪出小孔，并将该开口覆盖于已剃净并消毒的手术部位，以明确标示手术区域。尽管在小型动物上维持无菌手术环境较为困难，但这样做有助于降低感染风险。
- 用镊子提起皮肤，在下胸段–上腰段脊柱正上方的中线处用剪刀做一纵向切口。可通过手指沿椎骨滑动感知椎列上的隆起结构来定位下胸段–上腰段区域（图1）。
- 切开筋膜及浅层脊柱肌肉。如有必要，可用电凝止血（Fine Science Tools，Foster City，CA；货号 # 18000-00）。在幼鼠中，用棉签对切口周围施加轻柔压力即可有效止血。
- 在椎弓两侧、关节突与背侧棘突之间的中点处剪断椎弓后，切除一至两个下胸段–上腰段脊髓节段的棘突，完成背侧椎板切除术（图2）。操作时需小心避免剪刀损伤脊髓，并随时清除产生的小骨碎片，以防其划伤脊髓。需注意，新生早期幼鼠的椎柱尚未完全骨化，骨骼非常柔软，极易被剪断。因此，操作时应避免过深切割，以免损伤脊髓。
- 若您不希望在成年小鼠中进行背侧椎板切除术，我们发现可通过切开椎体节段之间的软组织暴露脊髓的小部分区域，而无需切割任何骨组织。尽管两种方法均可有效进入脊髓，但避免背侧椎板切除术可确保脊髓不受损伤。
- 使用微量注射器（0.2 mL；Gilmont Instruments 货号 # GS-1100）或等效递送装置，将示踪剂注入拉制的玻璃电极（硼硅酸盐玻璃毛细管；货号 # 300056，Harvard Apparatus，Holliston，MA；Narishige 双阶段玻璃微电极拉制仪型号 001-PC-10）中。
- 将玻璃微电极固定于显微操作仪上，并将其插入脊髓，插入深度为0.1–0.5 mm，位置位于下胸段–上腰段脊髓的中线与脊髓侧缘之间的中点处。可将动物固定于立体定位仪中（Kopf Instrumentation 小动物立体定位仪型号 940-A 及电极操作仪型号 960），以准确定位注射位点并稳定动物体位。或者，若您的麻醉方案可调节至维持稳定麻醉平面且无深呼吸引起的显著移动，则轻轻将动物固定亦可满足要求。
- 在3–5分钟内向脊髓内加压注射约0.5 μl的2% WGA-Alexa 488（麦芽凝集素，Alexa Fluor 488偶联物；货号 #W11261，Invitrogen，Carlsbad，CA）、WGA-Alexa 555（麦芽凝集素，Alexa Fluor 555偶联物；货号 #W32464，Invitrogen，Carlsbad，CA）、WGA-Alexa 350（麦芽凝集素，Alexa Fluor 350偶联物；货号 #W11263，Invitrogen，Carlsbad，CA）、WGA-HRP（麦芽凝集素-辣根过氧化物酶；Sigma，St. Louis，MO 货号 # L7017）或0.5 μl的10% BDA（生物素化葡聚糖胺；货号 #D1956，Invitrogen，Carlsbad，CA）的磷酸盐缓冲液（PBS；Sigma，St. Louis，MO；货号 # P4417）溶液。注射此类体积的示踪剂可标记大量神经纤维。若需靶向较小核团（或单个核团的亚区），则需注射更小体积，各研究者应通过实验确定最佳注射体积。对于精确的纳升级递送，建议采用离子电渗法。
- 在注射前，每10 μl BDA溶液中加入1 μl玉米油（Sigma，St. Louis，MO；货号 # C8267），以防止混合液粘附于拉制毛细管管壁。若示踪剂难以从移液管中推出，可缓慢回撤针尖在组织中形成一个小腔隙，再尝试注射。微电极尖端堵塞属常见现象。在多数情况下，该腔隙亦有助于形成一个储液区，使周围神经元可吸收示踪剂。请始终缓慢推出示踪剂，以避免针头周围组织发生严重损伤。
- 使用伤口夹和组织胶水轻轻闭合皮肤。或者，也可使用缝线关闭伤口。
- 请注意，随着操作熟练，该手术步骤（至少至此阶段）通常可在20分钟内完成。
- 将动物置于恢复舱（Harvard Apparatus Vetcare 舱型号 9.16.0，货号 # 340508）内的加热垫（加热垫货号 # 341241，Harvard Apparatus）上，以防止低体温并加快恢复。或者，也可使用多种型号的加热舱。密切监测呼吸频率，并观察动物是否出现试图移动的迹象。大多数动物通常在术后10–15分钟内恢复反应能力。
- 动物从麻醉中恢复后，应自由提供饮水和食物，并根据需要给予镇痛剂。术后护理期间必须密切观察动物状态，这是至关重要的。应常规检查疼痛、不适、感染、摄食饮水是否充足等指标。请再次与您所在机构的动物福利官员和兽医讨论具体需求，制定最佳方案，以成功完成实验并确保所有动物得到必要护理。
- WGA-Alexa 555、WGA-Alexa 488 和 WGA-HRP 在神经元中可快速转运，我们发现无论在新生早期还是成年小鼠中，Alexa偶联示踪剂均能在24小时内 robustly 标记长距离纤维束（Reeber 等，2011）。WGA-Alexa 350 同样可快速转运，但其可见性相较于其他Alexa染料，高度依赖于滤光片组的质量和灵敏度（未显示数据；Reeber 等，2011）。
- BDA 通常需要较长的存活时间才能完整示踪神经投射，因此为全面绘制脊髓-小脑投射图谱，动物需在注射后约11天处死。
2. 顺行示踪苔藓纤维的检测
- 在相应存活期结束后，使用 Avertin（或您偏好的麻醉剂）对小鼠进行麻醉。
- 待小鼠无任何反射反应后，通过心脏灌注 0.1 M PBS（pH 7.2）冲洗血液。随后，用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 对动物进行灌注固定。除您将要分析的脑区外，还必须获取注射部位的组织，以进行回溯性分析，评估注射范围大小、电极造成的组织损伤程度，并识别可能存在的穿行纤维标记（图 3；参见 Mesulam, 1982；Reeber et al. 2011）。
- 将灌注后的小鼠脑组织在 4% PFA 中后固定 24–48 小时，然后将其置于 PBS 配制的缓冲蔗糖溶液中进行冷冻保护（15% 蔗糖溶液浸泡约 2 小时，或直至组织沉入容器底部，随后转移至 30% 蔗糖溶液中过夜，或直至组织下沉）。取出蔗糖处理后的组织，用纸巾轻轻吸干表面液体，随后将其浸入含有 OCT（Optimal Cutting Temperature；Sakura Finetech USA Inc, CA）的组织模具中。将组织置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻，并在相同温度下保存，直至准备切片。
- Alexa 荧光染料在标记后可直接显影，无需额外染色。因此，WGA-Alexa 示踪组织在灌注后可直接切片并封片用于成像，或以整体装片（wholemount）形式在 4% PFA 中直接成像。我们发现，在 4% PFA 中成像可提供最佳折射率，有利于观察整体装片中示踪投射的拓扑结构。对于切片样本，使用恒冷切片机连续切取 40 μm 厚的冠状切片，并将切片以游离漂浮形式收集于 PBS 中。鉴于 PFA 具有毒性，操作过程中应佩戴适当的防护面罩，保持环境通风良好，不使用时应立即将 PFA 或 PFA 固定的组织放回密封容器中。若显微镜位于合适的通风橱内，则更为理想。
- WGA-HRP 标记的纤维可通过四甲基联苯胺（TMB）作为显色底物进行显影。本文不详细描述 HRP 染色流程，因其已有详尽报道（Vogel 和 Prittie 1994；Sillitao 等，2010）。
- 对于 BDA 标记的纤维，将游离漂浮的组织切片在 Streptavidin-CY3（货号 #434315，Invitrogen, Carlsbad, CA）或 Streptavidin-Alexa Fluor 488 或 555（货号 #S11223 对应 488，货号 #S21381 对应 555，Invitrogen, Carlsbad, CA）中孵育 2 小时，PBS 洗涤后用 FLUORO-GEL 封片。对于 DAB 显色，将组织切片在 ABC 反应缓冲液（货号 #PK-4000，Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA）中过夜孵育，PBS 漂洗 3 次后，在 DAB 溶液（0.5 mg/ml，Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA）中反应 5–10 分钟，每 50 ml DAB 溶液中添加 10 μl 30% H2O2。
3. 免疫组织化学
- 免疫组织化学操作按先前所述方法进行（Sillitoe 等，2008）。简言之，将组织切片在含10%正常山羊血清（NGS；Sigma，St. Louis MO）、0.1% Tween-20 及一抗（见下文）的0.1 M PBS中孵育16–18小时（室温）。用PBS洗涤组织切片三次，随后加入二抗（见下文）孵育，室温下最长不超过2小时。再次漂洗组织切片，并按以下说明显色以显示免疫反应性。
- 为确定浦肯野细胞与苔藓纤维之间的关系，我们采用传统的双重染色方法对游离漂浮的组织切片进行共标记。使用WGA-Alexa 555进行示踪，同时使用Alexa 488标记的驴抗小鼠二抗（Invitrogen/Molecular Probes Inc.，Carlsbad, CA）检测ZebrinII（1:250；由加拿大卡尔加里大学Richard Hawkes博士惠赠）。ZebrinII为小鼠单克隆抗体，直接使用杂交瘤培养上清液。荧光标记的二抗稀释比例为1:1500。染色完成后，将组织切片贴附于带电荷的玻璃载片上，随后用含Tris缓冲液的FLUORO-GEL（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA）或含DAPI的Vectashield Hardset封片介质（货号 # H-1200，Vector Laboratories, Burlingame, CA）封片，用于三色荧光成像。
- 我们通过在不加一抗的条件下处理组织切片，检测二抗的特异性。对照实验中未检测到任何信号，表明所观察到的染色结果并非来自Alexa标记抗体的非特异性结合（数据未显示）。
4. 显微镜观察与数据分析
- 我们使用安装在 Leica DM5500 显微镜上的 Leica DFC360 FX（荧光）和 DFC490（DAB 和 TMB 反应的组织切片）相机拍摄组织切片的显微照片。
- 我们使用 Leica Application Suite 和 Leica Application Suite FX 软件包采集并分析组织切片的图像。
- 整体标本的显微照片通过安装在 Leica MZ16 FA 体视显微镜上的 Leica DFC3000 FX 相机拍摄，该显微镜运行 Leica Application Suite FX 软件。
- 我们的两台显微镜均配备了 Leica CY3（型号 # 11600231）和 FITC（型号 # 11513880）滤光片，DM5500 显微镜另配有 A4 DAPI/UV 滤光片（型号 # 11504162）。
- 根据 Leica 软件判断的曝光不足或过度情况优化后采集图像。我们将所有原始数据导入 Adobe Photoshop CS4，如有必要，仅对每幅图像的整个视野进行锐度、亮度、对比度或色阶的校正。也可根据需要选用其他图像编辑软件。
- 本文所示的示意图使用 Adobe Illustrator CS4 绘制。
- Alexa 555 和 CY3 标记的神经元在我们的滤光片下呈红色，在本文所有图像中被伪彩着色为品红色。
动物
所有动物实验均根据阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的动物实验方案，依照机构指导原则进行。实验所用雄性和雌性远交系 Swiss Webster 小鼠（Taconic, Albany, NY）或近交系 C57BL6J 小鼠（JAX, Bar Harbor, ME）均维持于本实验室动物种群中，并用于所有研究。以检测到阴道栓的当天中午定为胚胎发育第 0.5 天。
5. 代表性结果：
脊髓小脑传入纤维在小脑中终止于矢状旁带状区域（图3；Voogd 等，1969；Grishkat 和 Eisenman，1995；Vogel 和 Prittie，1994；Vig 等，2005；Apps 和 Hawkes，2009；Sillitao 等，2010；Reeber 等，2011）。我们将 WGA-Alexa 示踪剂注入下胸段至上腰段脊髓，以证明：1）这些示踪剂可稳定地标记小脑中特定亚群的终末结构（图3；Reeber 等，2011）；2）WGA-Alexa 示踪剂荧光强度高，可用于整体可视化整个小脑中的苔藓纤维拓扑分布模式（图3；Reeber 等，2011）；3）WGA-Alexa 488 与 555 可联合使用，以在同一动物体内同时示踪多条神经通路（图4）；以及 4）WGA-Alexa 示踪剂可与免疫组织化学染色兼容（图5）。在近期的研究中，我们发现 WGA-Alexa 示踪剂在向脊髓注射后仅 6 小时即可标记小脑中的终末结构，是示踪发育中神经通路结构的极佳选择（Reeber 等，2011）。
图1。 示踪剂递送设备的设置 体内. A. 手术区域的图像。 B. 胸下段至腰上段可通过手指沿椎骨滑动以触诊椎列中的隆起部位来确定。背侧椎板切除术应大致在该“隆起”的中部进行，该位置由黄色箭头指示。
图 2. 下胸段—上腰段椎骨节段在背侧椎板切除术前后的示意图。A. 小鼠脊柱下胸段—上腰段完整椎骨节段的示意图。B. 通过切除一个或两个椎骨节段的棘突进行背侧椎板切除术，切口位于关节突与背侧棘突之间的椎板中点处。
图 3. WGA-Alexa 示踪剂荧光强烈，可用于高分辨率下观察传入神经投射的拓扑结构。A. 示意图显示了 WGA-Alexa 555 标记的脊髓小脑神经元的起源与终止区域。B. 将 WGA-Alexa 555 注射至成年脊髓下胸段上腰段区域后的注射部位图像。C. 向脊髓下胸段-上腰段区域注射 WGA-Alexa 555 后，前部小叶的整装组织图像。D. WGA-Alexa 555 对脊髓小脑束的顺行示踪显示了冠状组织切片上可见的苔藓纤维条带。小叶以罗马数字标记，数字表示中线两侧的苔藓纤维条带（适用于所有图像）。比例尺：B，500 μm；C，500 μm；D，200 μm。
图4. WGA-Alexa示踪剂可高效地标记同一动物体内多条神经通路。A. 小鼠小脑的全组织示意图，总结了脊髓小脑苔藓纤维带的整体分布模式。将WGA-Alexa 555注射至腰段脊髓右侧，同时将WGA-Alexa 488注射至左侧相同节段。 B. 在穿过后部小叶的冠状组织切片上可见，两种WGA-Alexa示踪剂均被运输至小脑，并成功标记了不同的终末神经元亚群（另见Reeber等，2011）。缩写：分子层（ml）；浦肯野细胞层（pcl）；颗粒细胞层（gcl）；白质（wm）。比例尺：B，100 μm。
图5. WGA-Alexa 示踪剂可与免疫组织化学和组织学结合使用，实现神经元及投射的三重标记。A. WGA-Alexa 555 被沉积在小脑第三叶的苔藓纤维末梢中。 B. ZebrinII 染色揭示了第三小叶中浦肯野细胞条带的排列。 C. 神经元和胶质细胞核的DAPI染色 D. 各图组合成的图像 A，B，以及 C 显示传入纤维带、浦肯野细胞条带和总体细胞结构的三重标记。 E-H方框区域的高倍放大图像 A-D. 普肯耶细胞条带编号沿用先前描述的方法（参见综述 (Apps and Hawkes 2009)）。缩写：分子层 (ml)；普肯耶细胞层 (pcl)；颗粒细胞层 (gcl)。比例尺： D, 500 μm （适用于 A-C）； H, 500 μm （用于 E-G).
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讨论
我们介绍了利用一种新型荧光标记方法，在发育期和成年小鼠中成功进行轴突和树突示踪所需的手术与技术细节。通过使用WGA-Alexa，我们展示了如何利用示踪剂和标记物以高分辨率和三维方式分析神经环路的投射图谱。
目前有多种示踪剂可用于神经环路的示踪，包括霍乱毒素亚单位B（Cholera toxin subunit B）、生物胞素（Biocytin）、神经生物素（Neurobiotin）、菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris leucoagglutinin, PHAL）、荧光金（fluororuby）、荧光翠绿（fluoremerald）和荧光金（fluorogold）。此外，近年来基于遗传学和病毒的示踪技术表明，分子特征 distinct 的神经元亚群能够以高度精确的方式在拓扑结构上与其靶区相连。需要注意的是，尽管某些神经示踪剂主要沿顺行或逆行方向运输（例如分子量为10,000的BDA与分子量为3,000的BDA），但示踪分子通常在两个方向上均有运输。在我们的研究中，我们引入了WGA-Alexa系列示踪剂，作为分析拓扑投射模式的可靠神经解剖学工具。我们证明，WGA-Alex...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作获得了叶史瓦大学阿尔伯特·爱因斯坦医学院向 RVS 提供的新研究者启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 微珠灭菌器 | Fine Science Tools | 型号 Steri 250 货号 # 18000-45 | |
| 电灼器 | Fine Science Tools | 货号 # 18000-00 | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | 货号 # 300056 | |
| 双级玻璃微量移液器拉制仪 | Narishige International | 型号 001-PC-10 | |
| 微量注射器 | Gilmont Instruments | 货号 # GS-1100 | |
| 小型动物立体定位仪 | Kopf Instruments | 型号 940-A | |
| 电极操纵器 | Kopf Instruments | 型号 960 | |
| 兽用护理舱 | Harvard Apparatus | 货号 # 340508 | |
| 加热垫 | Harvard Apparatus | 货号 # 341241 | |
| Leica DFC360 FX 相机 | Leica Microsystems | DFC360 FX | |
| Leica DFC490 相机 | Leica Microsystems | DFC490 | |
| Leica DM5500 显微镜 | Leica Microsystems | DM5500 | |
| Leica DFC3000 FX 相机 | Leica Microsystems | DFC3000 FX | |
| Leica MZ16 FA 显微镜 | Leica Microsystems | MZ16 FA | |
| CY3 滤光片 | Leica Microsystems | 型号 # 11600231 | |
| FITC 滤光片 | Leica Microsystems | 型号 # 11513880 | |
| A4 DAPI/UV 滤光片 | Leica Microsystems | 型号 # 11504162 | |
| 麦芽凝集素，Alexa Fluor 488 标记 | Invitrogen | 货号 #W11261 | |
| 麦芽凝集素，Alexa Fluor 555 标记 | Invitrogen | 货号 #W32464 |
参考文献
- Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
- Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
- Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. , Wiley. New York. (1982).
- Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. , (2011).
- Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
- Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
- Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
- Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
- Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
- Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).
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