脱壳是HIV-1生命周期早期阶段的关键步骤，定义为衣壳壳体的解离以及病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的释放。本文展示了从HIV-1病毒颗粒中分离完整核心以及定量其脱壳过程的技术 体外.
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本文内容
摘要
摘要
逆转录病毒的基因组被包裹在由脂质包膜包围的衣壳内。对于慢病毒（如HIV-1），其锥形衣壳由CA蛋白以六边形晶格结构排列组成。该衣壳的宽端和窄端分别由7个五聚体和5个五聚体封闭1, 2。此衣壳内部包裹着病毒核糖核蛋白复合物，二者共同构成病毒核心。
在病毒膜与靶细胞膜融合后，HIV-1被释放到细胞质中。随后，衣壳解离，以可溶形式释放出游离的CA蛋白3，该过程称为脱壳。目前对HIV-1脱壳的细胞内发生位置和时间尚不明确。CA蛋白中单个氨基酸的替换若改变了衣壳的稳定性，也会损害HIV-1感染细胞的能力4。这表明衣壳的稳定性对HIV-1感染至关重要。
HIV-1脱壳由于缺乏灵敏且可靠的检测方法，其研究一直较为困难。本文介绍了一种用于研究脱壳过程的定量方法 体外 利用从具有感染性的HIV-1病毒颗粒中分离的病毒核心进行研究。该方法包括在低温条件下，将浓缩的病毒颗粒通过去垢剂层沉降至线性蔗糖梯度中，从而分离病毒核心。为定量分析脱壳过程，将分离得到的病毒核心在37°C下孵育不同时间，随后通过超速离心沉淀。脱壳程度通过测定上清液中CA蛋白所占比例进行分析。该方法已被用于分析病毒突变对HIV-1衣壳稳定性的影响4, 5, 6它也可用于研究细胞因子在HIV-1脱壳过程中的作用。
方案
1. HIV-1 病毒颗粒的制备
在开始实验前，您必须获得所在机构生物安全办公室的许可，并遵循其指南，在经批准可进行传染性HIV操作的生物安全设施中开展工作。您必须确保在生物安全实验室工作期间遵守适当的防护和安全措施。
HIV-1病毒颗粒的制备通常通过使用磷酸钙转染法，将HIV-1前病毒DNA瞬时转染293T细胞来实现7, 8。通过感染的T细胞培养获得的高滴度病毒储备液也同样适用。
- 在含有10%胎牛血清（FBS）并添加抗生素[青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 μg/ml）]的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO2条件下培养293T细胞。
- 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA将接近汇合的培养皿中的细胞消化下来，并在转染前一天将2×106个细胞接种于9 ml培养基中，每100 mm培养皿接种一皿，共接种六皿用于病毒颗粒的生产。若需要制备浓缩的核心组分，可增加转染所用的培养皿数量。
- 次日，细胞单层应达到约25%汇合度，适合进行转染。对于六皿待转染的细胞，将120 μg前病毒DNA用无菌水定容至2.7 ml。向该混合液中加入0.3 ml的2.5 M CaCl2和3 ml的2XBBS，通过反复吹打充分混匀。室温静置10–20分钟。
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讨论
此处所述用于纯化 HIV-1 核心以研究脱壳的方法 体外 对于研究HIV-1生命周期的这一阶段具有重要意义，尤其是在缺乏经验证的用于分析靶细胞中HIV-1脱壳的方法的情况下。尽管本方法采用平衡超速离心法纯化病毒核心，但其他研究者曾使用1% Triton-X-100短暂裂解后直接离心沉淀的方法12, 13 或通过覆盖有0.1% Triton-X-100的蔗糖垫进行沉淀14, 15.
采用该方法获得的核心颗粒回收率存在实验间的差异。本方案成功的关键因素之一是转染效率。通常，我们加载到梯度中的病毒量至少相当于7 μg的p24。本实验室采用磷酸钙转染法进行病毒生产。尽管其他转染方法也可能适用，但我们尚未评估其在核心颗粒分离中的效果。影响核心颗粒产量的其他重要因素包括在叠加梯度各层时的操作细致程度以及样品全程保持低温。制备蔗糖梯度时必须格外小心，以避免梯度混合。在加入浓缩病毒悬液时若操作不当，可能导致病毒颗粒过早与屏障蔗糖层下方的去垢剂接触；这种长时间的接触可能会破坏脆弱的核心结构，导致衣壳结合减少。在整个操作过程中，保持蔗糖密度.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
Aiken 实验室的 HIV-1 脱壳研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 AI40364、AI50423 和 AI076121 的支持。部分关键材料，包括 p24 ELISA 中使用的试剂，由 NIH 艾滋病研究与参考试剂项目（AIDS Research and Reference Program）、艾滋病研究部（Division of AIDS）、国家过敏与传染病研究所（NIAID）、美国国立卫生研究院（NIH）提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker 公司 | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | 成分：50 mM BES [pH 6.95]，280 mM NaCl 和 1.5 mM Na2HPO4调节pH至6.95（室温条件下），过滤除菌 &及分装后于 -20 保存°C. | ||
| 包被抗体：抗p24单克隆抗体（183-H12-5C） | 美国国立卫生研究院 | 3537 | |
| 一抗：HIV-Ig（高免疫人患者血清） | 美国国立卫生研究院 | 3957 | |
二抗： 辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG | Pierce，Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP底物 | KPL公司 | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 孔板 | 赛默飞世尔科技公司 | 3455 | |
| SW32Ti 和 SW32.1 Ti 转子及兼容的超速离心机 | 贝克曼库尔特公司 | ||
| TLA-55 转子及台式超速离心机 | 贝克曼库尔特公司 | ||
| 高速微量离心管 | 贝克曼库尔特公司 | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow 密度梯度分馏仪 | Labconco Corp. | 4517000 | |
| 梯度生成器 | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
参考文献
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature.
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重印与许可
