体外 HIV-1 核心颗粒的脱壳

摘要

脱壳是HIV-1生命周期早期阶段的关键步骤，定义为衣壳壳体的解离以及病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的释放。本文展示了从HIV-1病毒颗粒中分离完整核心以及定量其脱壳过程的技术 体外.

摘要

逆转录病毒的基因组被包裹在由脂质包膜包围的衣壳内。对于慢病毒（如HIV-1），其锥形衣壳由CA蛋白以六边形晶格结构排列组成。该衣壳的宽端和窄端分别由7个五聚体和5个五聚体封闭^{1, 2}。此衣壳内部包裹着病毒核糖核蛋白复合物，二者共同构成病毒核心。

在病毒膜与靶细胞膜融合后，HIV-1被释放到细胞质中。随后，衣壳解离，以可溶形式释放出游离的CA蛋白³，该过程称为脱壳。目前对HIV-1脱壳的细胞内发生位置和时间尚不明确。CA蛋白中单个氨基酸的替换若改变了衣壳的稳定性，也会损害HIV-1感染细胞的能力⁴。这表明衣壳的稳定性对HIV-1感染至关重要。

HIV-1脱壳由于缺乏灵敏且可靠的检测方法，其研究一直较为困难。本文介绍了一种用于研究脱壳过程的定量方法 体外 利用从具有感染性的HIV-1病毒颗粒中分离的病毒核心进行研究。该方法包括在低温条件下，将浓缩的病毒颗粒通过去垢剂层沉降至线性蔗糖梯度中，从而分离病毒核心。为定量分析脱壳过程，将分离得到的病毒核心在37°C下孵育不同时间，随后通过超速离心沉淀。脱壳程度通过测定上清液中CA蛋白所占比例进行分析。该方法已被用于分析病毒突变对HIV-1衣壳稳定性的影响^{4, 5, 6}它也可用于研究细胞因子在HIV-1脱壳过程中的作用。

方案

1. HIV-1 病毒颗粒的制备

在开始实验前，您必须获得所在机构生物安全办公室的许可，并遵循其指南，在经批准可进行传染性HIV操作的生物安全设施中开展工作。您必须确保在生物安全实验室工作期间遵守适当的防护和安全措施。

HIV-1病毒颗粒的制备通常通过使用磷酸钙转染法，将HIV-1前病毒DNA瞬时转染293T细胞来实现^{7, 8}。通过感染的T细胞培养获得的高滴度病毒储备液也同样适用。

1. 在含有10%胎牛血清（FBS）并添加抗生素[青霉素（100 IU/ml）和链霉素（100 μg/ml）]的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37°C、5% CO₂条件下培养293T细胞。
2. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA将接近汇合的培养皿中的细胞消化下来，并在转染前一天将2×10⁶个细胞接种于9 ml培养基中，每100 mm培养皿接种一皿，共接种六皿用于病毒颗粒的生产。若需要制备浓缩的核心组分，可增加转染所用的培养皿数量。
3. 次日，细胞单层应达到约25%汇合度，适合进行转染。对于六皿待转染的细胞，将120 μg前病毒DNA用无菌水定容至2.7 ml。向该混合液中加入0.3 ml的2.5 M CaCl₂和3 ml的2XBBS，通过反复吹打充分混匀。室温静置10–20分钟。
4. 将所得混合液逐滴加入每皿培养皿中央，同时轻轻旋转培养皿以混匀。将培养皿置于35°C、3% CO₂的培养箱中孵育过夜（约16小时）。
5. 吸除培养基，轻柔加入5 ml PBS。
6. 吸除PBS，加入5 ml新鲜培养基。将细胞在37°C、5% CO₂的培养箱中继续培养24–48小时。
7. 收集含有病毒颗粒的培养上清液，转移至50 ml锥形离心管中。合并所有培养皿的上清液，在1,500 × g条件下离心5分钟，以沉淀细胞和碎片。使用孔径为0.45 μm的一次性注射器滤器过滤上清液。操作活病毒时应采取预防措施，尽量减少气溶胶的产生。包括在离心步骤中使用带O型圈的锥形管或转子桶盖。若无法实现，应使用Parafilm封膜包裹管子的螺旋盖。

2. 通过超速离心浓缩 HIV-1 病毒颗粒

1. 将培养上清液（30 ml）加入一个38.5 ml的聚碳酸酯离心管中（适用于Beckman SW32Ti转子或同等型号）。使用5 ml移液器，将5 ml含20%蔗糖的PBS溶液轻轻铺在含有病毒的上清液下方。
2. 在4°C条件下，以32,000 rpm（r_max处为175,000 × g）离心3小时，使病毒颗粒沉淀。
3. 通过抽吸去除上清液，注意不要扰动管底的沉淀物。向管中加入0.5 ml的1×STE缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 7.4]，100 mM NaCl，1 mM EDTA），置于4°C环境中1小时，以松动沉淀。使用宽口1 ml移液枪头轻轻吹打数次，使沉淀从管底脱离。随后，将松动的沉淀转移至一个1.5 ml微量离心管中，注意避免产生泡沫。在4°C继续孵育1–3小时，使病毒小团块充分分散。在此期间，按照步骤3.1所述方法准备蔗糖梯度。
4. 轻轻吹打病毒悬液数次，然后在4°C条件下，于冷藏微量离心机中以8,000 rpm（6,000 × g）离心1分钟，以去除残留的团块。此过程中保持样品低温。

3. 蔗糖梯度离心法分离核芯

HIV-1 核心通过“穿刺离心”法进行分离⁹，该方法是对先前报道的HIV-2核心纯化方法¹⁰的改进。

1. 在14.5 ml聚丙烯离心管中，用1×STE缓冲液配制12 ml线性30%至70%蔗糖梯度，适用于SW32.1Ti转子。配制梯度时，使用20 ml梯度混合器；将6 ml 70%蔗糖溶液置于近端（靠近出口端），6 ml 30%蔗糖溶液置于远端。确保连接两个腔室的通道中无气泡滞留。使用Auto Densi-Flow梯度混合器，将梯度从底部泵入离心管，管底预先加入1 ml 85%蔗糖溶液。将装有梯度的离心管轻轻置于4°C环境中冷却（2–4小时）。
2. 使用宽口1 ml移液器吸头，将0.25 ml含1% Triton X-100的STE缓冲液中的15%蔗糖溶液轻柔地铺加在梯度上方。
3. 使用宽口1 ml移液器吸头，将0.25 ml STE缓冲液中的7.5%蔗糖溶液轻柔地铺加在上层溶液上方。注意避免各层之间发生混合。
4. 将步骤2.4中获得的0.5 ml病毒悬液轻柔地铺加在梯度上方。此步骤应小心操作，避免扰动梯度或导致下方蔗糖层混合。
5. 将离心管放入预冷的SW32.1Ti吊桶转子中，在4°C下以32,000 rpm（r_max处为187,000 × g）离心过夜（16–20小时）。为避免离心过程中断，请在离心机内真空度达到250 μm后，再开始离心。
6. 使用Auto-Densi-Flow梯度分部收集器，从梯度顶部到底部收集1 ml的分部组分。收集后立即将各管置于冰上。通过轻轻颠倒数次混匀各管内容物，并从每管中取出50 μl用于ELISA或逆转录酶活性测定以进行定量分析。

4. HIV-1 核心的定位与储存

1. 在进行脱壳实验之前，重要的是确定哪些组分含有完整的HIV-1核心。可通过使用步骤3.6中获得的50 μl等分试样进行p24 ELISA或逆转录酶活性实验来确定。
2. 与核心相关的CA（衣壳蛋白）回收量通常与核心的稳定性相关。使用各组分的样品通过p24 ELISA⁹测定核心相关CA含量。或者，也可测定各组分的逆转录酶活性。采用这两种方法时，峰值通常出现在第10组分左右。
3. 合并含有核心的组分。若核心不立即用于脱壳实验，可将合并后的核心分装为0.2至0.3 ml的等分试样，液氮速冻后于-80°C保存。以这种方式冷冻的核心适用于脱壳实验。核心相关CA的产量通常为每毫升1–2 μg p24，约占病毒颗粒总p24的15%。

5. HIV-1 脱壳的动力学检测

1. 每种脱壳反应所需的HIV-1核心颗粒量约为50 ng。要进行该实验，需 体外 解包实验中，用等体积的冷1XSTE缓冲液稀释核组分等分试样，以降低悬液黏度并减少移液误差。
2. 进一步稀释 100 μl 将核心部分放入含有0.15 ml冷的1XSTE缓冲液中 10 μg/ml 在1.5 ml 微型离心管中加入BSA。我们在STE缓冲液中添加BSA（10 μg/ml) 以尽量减少CA吸附到管壁上。通过反复倒置试管进行混匀。切勿涡旋震荡样品。将试管置于水浴中孵育 37°C 在规定时间间隔（15、30、60 和 120 分钟）进行。试管应浸入水浴中，至少达到内部样品的高度，以确保均匀加热。
3. 孵育期间，通过轻弹管壁定期轻轻混匀管内物质（通常每5-10分钟一次）。对于零分钟对照，稀释 100 μl 将核心颗粒加入到0.15 ml冰冷的1×STE缓冲液中，并在整个实验过程中（120分钟）置于冰上孵育。零分钟对照组提供基础脱壳值，用于确定在孵育条件下核心颗粒脱壳程度的增加量 37°C 不同时间间隔。
4. 孵育结束后，将试管置于冰上10分钟，以终止脱壳过程。
5. 将离心管在45,000 rpm（TLA-55转子；r处相对离心力为125,000 × g）条件下离心_最大20 分钟 4°C这将使完整的核心沉淀，而因核心脱壳释放的游离CA则保留在上清液中。离心转子应在使用前预冷至 4°C 在上样前。
6. 将上清液转移至新的预冷微量离心管中，建议使用室温保存的加样枪头。请注意，沉淀物肉眼不可见，因此吸取上清液时需格外小心。将沉淀物重悬于 250 μl 加入ELISA样品稀释液（含0.5% Triton X-100和5%小牛血清的PBS）。为确保沉淀物充分溶解，加入ELISA样品稀释液后需涡旋振荡。使用p24 ELISA定量测定沉淀物和上清液中的CA含量，具体方法见下节所述。
7. 通过计算上清液中CA蛋白所占的比例来确定脱壳程度。

6. 通过p24 ELISA检测CA

1. 市面上有多种商用 ELISA 试剂盒可用于 CA 的定量检测。可使用任何商用或“自研”ELISA 方法，并加入 p24 标准品以确定检测的线性范围。应对样品进行稀释后检测，以确保结果的准确性。
2. 我们开发了一种自制 ELISA 方法，常规用于 CA 的检测。该方法改编自先前的报道¹¹，使用来自 NIH 艾滋病研究与参考试剂计划提供的捕获抗体和检测抗体进行操作。

7. 代表性结果：

图1展示了通过ELISA确定含有核心组分的组分的一个结果示例。收集各组分（每份1 ml）后，取每组分中的50 μl样品进行系列稀释，并通过ELISA分析。将十二个组分的p24值相加，得到总p24为14.5 μg。如图所示，第8至第10组分含有核心。含核心组分的p24值为2.17 μg。核心相关p24的百分比（14.97%）由含核心组分的p24值（2.17 μg）与总p24值（14.5 μg）的比值计算得出。第1或第2组分始终含有最高量的p24，这代表未与核心结合的游离CA。随后，p24值在后续各组分中逐渐降低，接着出现急剧上升，最后p24值又迅速下降。若在加样梯度时操作得当，则核心相关CA的峰值通常出现在第10组分左右。

图2展示了测定HIV-1核心颗粒脱壳动力学的典型结果。该图显示野生型HIV-1核心颗粒的脱壳过程随时间呈依赖性增加。脱壳百分比通过计算上清液中CA蛋白所占的比例获得。经过练习后，该检测方法具有高度可重复性，可用于评估病毒核心颗粒的稳定性。 体外请注意，该检测的可重复性在很大程度上取决于实验过程中对样本的规范操作。由于核心成分对热敏感，样本应在整个操作过程中保持在 4°C 整个检测过程中，除孵育阶段外。

图1 HIV-1核心颗粒的平衡密度梯度离心。将浓缩的病毒悬液加至含1% Triton-X-100的30%至70%线性蔗糖梯度顶部。在187,000 × g、4°C条件下离心过夜后，从顶部（第1组分）至底部（第12组分）收集1 ml的各组分，并通过ELISA定量p24。

图2 HIV-1脱壳的时间进程 体外纯化的HIV-1核心被稀释后孵育于 37°C 在指定的时间间隔内孵育。0分钟样本在整个实验过程中于冰上孵育。孵育结束后，样品在4°C下以125,000 × g超速离心20分钟 4°C上清液和沉淀物经p24 ELISA分析进行分离检测。解壳程度的测定方法如方案文本所述。每个解壳反应均设置两个重复；误差线表示两个数值的范围。

讨论

此处所述用于纯化 HIV-1 核心以研究脱壳的方法 体外 对于研究HIV-1生命周期的这一阶段具有重要意义，尤其是在缺乏经验证的用于分析靶细胞中HIV-1脱壳的方法的情况下。尽管本方法采用平衡超速离心法纯化病毒核心，但其他研究者曾使用1% Triton-X-100短暂裂解后直接离心沉淀的方法^{12, 13} 或通过覆盖有0.1% Triton-X-100的蔗糖垫进行沉淀^{14, 15}.

采用该方法获得的核心颗粒回收率存在实验间的差异。本方案成功的关键因素之一是转染效率。通常，我们加载到梯度中的病毒量至少相当于7 μg的p24。本实验室采用磷酸钙转染法进行病毒生产。尽管其他转染方法也可能适用，但我们尚未评估其在核心颗粒分离中的效果。影响核心颗粒产量的其他重要因素包括在叠加梯度各层时的操作细致程度以及样品全程保持低温。制备蔗糖梯度时必须格外小心，以避免梯度混合。在加入浓缩病毒悬液时若操作不当，可能导致病毒颗粒过早与屏障蔗糖层下方的去垢剂接触；这种长时间的接触可能会破坏脆弱的核心结构，导致衣壳结合减少。在整个操作过程中，保持蔗糖密度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Cellgro	10-013-CV
PBS	Cellgro	21-031-CV
Triton-X-100	Mallinckrodt Baker 公司	9002-93-1
Tween 20	Acros Organics	9005-64-5
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Cellgro	25-053-CI
2XBBS			成分：50 mM BES [pH 6.95]，280 mM NaCl 和 1.5 mM Na2HPO4调节pH至6.95（室温条件下），过滤除菌 &及分装后于 -20 保存°C.
包被抗体：抗p24单克隆抗体（183-H12-5C）	美国国立卫生研究院	3537
一抗：HIV-Ig（高免疫人患者血清）	美国国立卫生研究院	3957
二抗： 辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG	Pierce，Thermo Scientific	31130
HRP底物	KPL公司	50-76-11
Immulon 2HB 96 孔板	赛默飞世尔科技公司	3455
SW32Ti 和 SW32.1 Ti 转子及兼容的超速离心机	贝克曼库尔特公司
TLA-55 转子及台式超速离心机	贝克曼库尔特公司
高速微量离心管	贝克曼库尔特公司	326823, 358123, 357448
Auto-Densi Flow 密度梯度分馏仪	Labconco Corp.	4517000
梯度生成器	CBS Scientific Co. Inc.	GM-20