慢性缩窄大鼠坐骨神经疼痛过敏测试

Summary

由于手术简单和健壮的行为结果，坐骨神经慢性缩窄是神经​​痛卓越的动物模型之一。手术后24小时内，疼痛过敏建立并可以使用冯弗雷触觉（机械测试）和足底的镇痛米（热试验）的定量测​​定。

Abstract

慢性神经性疼痛，从中央或周围神经系统的损害，是一种普遍的和虚弱的状态，影响7-18人口的^1,2％。症状包括自发性疼痛（刺痛，烧灼，电休克一样），感觉迟钝，感觉异常，痛觉异常（通常非疼痛刺激产生疼痛）和痛觉过敏（增加疼痛刺激的反应）。感觉症状与行为障碍，如失眠和抑郁，病态的合作。为了研究慢性神经痛几个模仿周围神经损伤的动物模型已开发，使用最广泛的是贝内特和谢的（1988）单方面坐骨神经慢性压迫性损伤^{（CCI）3（} 图1）。在这里，我们提出一个表演CCI和测试疼痛过敏的方法。

CCI是在麻醉下进行，一方面通过使暴露坐骨神经亲属的切口，并通过切割之间的臀肌浅和股二头肌肌肉结缔组织。四个铬肠道结扎坐骨神经周围松散地绑在1毫米的间隔，只是阻挡而不是逮捕epineural的血流量。关闭伤口缝合肌肉和皮肤中的主食。然后，动物被允许恢复从手术前24小时开始疼痛过敏测试。

行为测试，老鼠被放入测试设备，并允许习惯于测试过程。测试的区域是中旬的后肢跖面（ 图2），属于坐骨神经分布区域内。通过机械刺激使用电子动态足底冯弗雷触觉或手册·冯·弗雷毛发⁴受伤和未受伤的后爪机械痛阈值评估。机械撤出门槛是施加最大的压力（克），触发爪子撤出。热退缩潜伏期哈格里夫斯等人 （1988）首次描述，测量，后肢被暴露在辐射热束通过一个透明的玻璃表面，使用足底镇痛米^5,6。记录的时间为受伤和未受伤的后爪缩爪退缩潜伏期的热量刺激。继CCI的，机械的退出门槛，以及受伤的爪子热退缩潜伏期均明显减少，比基线测量和未受伤的爪子（ 图3）。周围神经损伤与疼痛过敏测试相结合的CCI模型提供了一个模型系统调查的潜在治疗药物的有效性，修改慢性神经性疼痛。在我们的实验室中，我们利用热和机械灵敏度的后爪一起CCI调查的发病机制的神经免疫相互作用的作用治疗神经性疼痛。

Protocol

1。慢性坐骨神经

无菌技术应该用于外科手术。外科工作表面用70％乙醇消毒和灭菌准备提前无菌文书（例如，罚款的剪刀，镊子，拉钩），纱布，订书钉和棉签。对于多次手术，清洁，并用70％乙醇或干大鼠之间的珠灭菌器resterilise文书。应戴口罩，头发的帽子和无菌手套。

收缩的神经，切成约3厘米长的小件浸泡在无菌生理盐水准备铬肠缝合，以防止干燥。关闭伤口，使用市售无菌丝线。

1. 在室使用在O ₂ 5％异氟醚诱导的大鼠麻醉，然后提供2％异氟醚在O _2，通过自定义作出口罩和监测在程序的anesthetised的动物。常见的替代麻醉药吸入氟烷或腹腔钠苯巴比妥。作为N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，氯胺酮，应避免，因为这些受体在神经性疼痛的发展的重要。
2. 刮胡子的大鼠的左后腿。然后，放置到一个热调节的加热垫的动物在37℃，适用于润滑眼药膏的眼睛。
3. 三个70％的异丙醇和碘溶液备用应用消毒剃光面积。
4. 与老鼠躺在其胸部/胸部，提升左后腿和中与的femor位置保持在90°至脊椎上使用脚胶带。
5. 请在皮肤切口平行，但低于femor 3-4毫米，并从皮肤由通过结缔组织切割的切口周围的肌肉。
6. 使用钝的剪刀，切通过臀肌浅和二头肌之间的结缔组织，股四头肌肌肉。
7. 使用拉钩扩大两肌肉之间的差距，使坐骨神经清晰的可视化。
8. 使用弯曲的钝头镊子，微型剪刀，轻轻地约10毫米坐骨神经周围结缔组织（近端的坐骨神经trifurcation的）。
9. 在显微镜下和良好的光源，配合双结连字（铬肠4.0，爱惜康，美国），相距1毫米到坐骨神经trifurcation的，近端。对于每个结扎，用一个单一的宽松循环的开始，然后抓住接近循环的两端，并拧紧，直到循环只是勉强舒适和沿神经结扎不滑动。举行的循环在适当的位置，放置第一完成结上的第二个循环。最后，周边1mm结扎切断，有始有终。收缩的神经应该是最小的，如果观察一个简短的抽搐立即停止，以防止日逮捕Ëepineural血流量。导致过度拧紧了结扎切断，自残（自残），既不必要的副作用，其中排除成功疼痛过敏测试。
10. 使用缝线（Mersilk 5.0，爱惜康）关闭固定皮肤肌肉层和主食（Autoclip，9毫米）。接下来，用碘液（Riodine）消毒伤口。
11. 密切观察大鼠在麻醉恢复期，并允许它恢复在单独的笼子里，平板纸的床上用品（标准畜牧业床上用品的），为了防止无意识的动物窒息。
    给予任何手术后镇痛的调查之前，应考虑到这可能会干扰与疼痛过敏测试。事实上，有证据表明局部麻醉，利多卡因，在伤停补时阶段的应用，可以改变神经痛的发展，并减少前⁷周的痛觉过敏程度。为进一步讨论这个M东北黑钙土看到⁸ Bennett 等人的审查。

2。疼痛行为的测量

1. 在实验开始前几天，每天处理的大鼠建议，以习惯的老鼠，其处理程序，减少咬的压力和风险。
2. 行为测试之前，需要习惯于大鼠的测试程序和动物外壳。测试环境应保持安静，并很好的控制，具有恒定的温度和湿度水平，每个测试会话类似在一天的时间进行。
3. 疼痛过敏测试应执行之前，C​​CI（基线）和CCI后不同时间点几次，所需。

3。机械痛阈值

1. 在一天的测试，地方大鼠成高架地板测试网笼15-30分钟前撤回阈值测量，允许笼勘探和groo的的明活动，停止和老鼠变得轻松和平稳。
2. 使用一个动态的足底冯弗雷触觉乌戈·巴西莱（意大利），位置与长丝触摸刺激单位直接下中旬的后肢足底表面，避免了金属丝网，按开始键。这升降机的机械刺激增加力量的后肢足底表面的长丝。

手册·冯·弗雷毛发一系列增加直径校准诱导特定的力量时，适用于皮肤的细丝。它们可以被用来作为替代电子动态足底冯弗雷测量缩爪阈值，如前面所述⁴触觉。也有电子冯·弗雷aesthesiometers（如印约理事会），美国，瑞典和Somedic几种可供选择的制造商。

3. 记录从受伤和健侧hindpa机械撤出门槛WS，在平衡重的顺序。此装置适用于压力的爪子和戒断反应时，系统会自动记录和显示应用（克）的最大力量。如果一个含糊的反应时（即在行走或修饰的情况下），重复的刺激，并再次记录阈值。后肢刺激后舔或晃动，伴有疼痛是一种行为的迹象。
4. 重复机械性刺激与刺激之间约5分钟的间隔的3倍，记录阈值，然后计算缩爪阈值的平均值。

4。热退缩潜伏期

在实验开始前，应调整的红外（IR）的足底测试仪器的热强度。在我们的实验室中，我们调整给天真大鼠约10秒平均爪退缩潜伏期的红外线强度，我们定在20秒截止延迟，以避免组织大坝年龄失败删除爪子的情况下。

1. 在一天的测试，地方大鼠成玻璃地板测试测量延迟15-30分钟前笼，允许笼勘探和疏导活动，停止和大鼠变得轻松和平稳。
2. 使用直接下中旬足底表面的后肢足底热镇痛仪（乌戈·巴西莱，意大利），位置的红外源，按下启动键。这暴露的后肢足底表面的热辐射光束通过一个透明的玻璃表面。也有替代足底热镇痛手段（如印地安人条约理事会，美国和Stoelting，美国）制造商。
3. 记录从受伤和未受伤的后爪退缩潜伏期，在平衡重的顺序。此装置会自动记录撤回爪子从热源热刺激发病（秒）的时间。如果发生一个含糊的反应（即在案件ambulaTION或修饰），重复的刺激和记录再次延迟。后肢刺激后舔或晃动，伴有疼痛是一种行为的迹象。
4. 约5分钟刺激之间的间隔至少3次重复热刺激，记录的潜伏期，然后计算平均缩爪潜伏期。

4。代表结果

机械撤出阈值和热退缩潜伏期大鼠同侧（受伤）和对侧（健侧）的爪子的一个例子是前（基线）和CCI 图3A和图3B后2-12天。从这些数字可以看出，CCI导致机械撤回阈值和同侧后肢热撤出潜伏期显着减少，说明存在的机械和热痛过敏，慢性神经痛两种功能 。

图1。示意图说明CCI模型结扎的定位。这种神经性疼痛的动物模型，涉及四个宽松的铬肠结扎坐骨神经在大腿中部的水平，安置。它导致受伤，只有部分的传入脚和随后的后肢疼痛过敏。

图2。疼痛测试使用的后肢面积图。中期跖面的脚垫后，由红色虚线圆圈表示，用于疼痛测试。坐骨神经末端分支支配，大多是由该区域。脚跟和脚掌，应避免由于差分皮肤敏感。

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图3。在大鼠坐骨神经慢性收缩后的疼痛过敏。 CCI后，有一个缩爪阈值显着减少机械刺激（A）和（B）在受伤的热刺激缩爪潜伏期（同侧），后肢比健侧（对侧）后肢（P均<0.01重复测量2方差分析）。数据显示，平均±SEM，每组7只大鼠。

Discussion

CCI是一种广泛使用的外周神经损伤模型慢性神经痛。它是相对简单的执行，并产生损伤后一个月至少有一个强大和稳定的疼痛过敏。继CCI的，大鼠表现出受伤的后肢（一起举行的脚趾和足底弯曲，脚掌外翻），以及反复晃动，守卫和受伤的暗示在场的自发痛⁹后肢舔的姿势异常。除了 ​​感觉障碍，一些调查显示，CCI的唤起行为障碍，如扰乱社会互动，睡眠障碍，抑郁和焦虑样行为^10-13，但是这是在未能找到这样的行为障碍由他人^14,15。因此，CCI是常用调查的病理生理，和潜在的治疗药物，用于治疗神经性疼痛。

我们DESCR国际教育局单方面收缩左侧坐骨神经，但应注意到，许多实验者右侧坐骨神经CCI类似的疼痛和行为结果，。一些研究者可能会发现它更容易执行在一个特定的方面，由于霸道的手术，在实验中切换，而其他方面排除任何偏见。值得注意的是，已包括使用周围神经^16,17只有2结扎，缝合材料铬，如纯肠道和^{polyglactin（vicryl）18,19}在大鼠肠道以外的原程序的几个变化。 CCI模型，此外，也...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/设备名称	公司	目录编号	评论
艳色肠道	爱惜康	的G-211	4-0厚度
异氟醚	delvet Pty有限公司，七山，新南威尔士州	N / A
mersilk	爱惜康	的W-580	5-0厚度
autoclip	碧迪	427631	9毫米的不锈钢
riodine	猎户座	R1000802F	1％W / V碘
足底热镇痛仪	乌戈·巴西莱	37370
动态跖触觉的	乌戈·巴西尔é	37400