坐骨神经慢性缩窄性损伤及大鼠疼痛过敏检测

摘要

由于手术操作简便且行为学结果稳定，坐骨神经慢性压迫是神经病理性疼痛的主要动物模型之一。术后24小时内即可形成疼痛过敏状态，并可使用冯·弗赖麻醉计（机械测试）和足底镇痛仪（热测试）进行定量测量。

摘要

慢性神经病理性疼痛由中枢或周围神经系统损伤引起，是一种常见且致残的疾病，影响着7%-18%的人群^1,2。其症状包括自发性疼痛（如针刺感、灼烧感、电击样疼痛）、感觉异常、感觉迟钝、异常性疼痛（由通常不会引起疼痛的刺激引发的疼痛）以及痛觉过敏（对疼痛刺激的反应增强）。这些感觉症状常伴随行为功能障碍，例如失眠和抑郁。为研究慢性神经病理性疼痛，已开发出多种模拟周围神经损伤的动物模型，其中应用最广泛的是Bennett和Xie（1988年）提出的单侧坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）模型³（图1）。本文介绍了一种实施CCI手术及检测疼痛过敏反应的方法。

在麻醉状态下进行坐骨神经慢性缩窄性损伤（CCI）模型手术，通过皮肤切口暴露一侧的坐骨神经，并切开臀浅肌与股二头肌之间的结缔组织。在坐骨神经上以1 mm的间隔松松结扎四道铬制肠线，结扎程度以刚好压迫但不完全阻断神经外膜血流为宜。随后用缝线缝合肌肉层，皮肤则用缝钉闭合。术后让动物恢复24小时，然后开始进行疼痛过敏反应的检测。

进行行为学测试时，将大鼠放入测试装置中，使其适应测试程序。测试区域为后肢足底中部表面（图2），该区域位于坐骨神经支配范围内。通过使用电子动态足底 von Frey 痛觉测定仪或手动 von Frey 纤维丝对损伤和未损伤的后肢进行机械刺激，评估机械缩足阈值⁴。机械缩足阈值是指引发缩足反应的最大施加压力（单位为克）。对于热缩足潜伏期的测量，采用 Hargreaves et al（1988）首次描述的方法，使用足底镇痛仪通过透明玻璃表面将辐射热光束照射至后肢足底^5,6。热刺激引发的缩足潜伏期定义为损伤侧与未损伤侧后肢发生缩足反应所需的时间。在坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）后，与基线值及未损伤侧后肢相比，损伤侧后肢的机械缩足阈值和热缩足潜伏期均显著降低（图3）。外周神经损伤的 CCI 模型结合疼痛超敏反应测试，为研究潜在治疗药物对慢性神经病理性疼痛的干预效果提供了一个模型系统。在本实验室中，我们结合 CCI 模型与后肢对热和机械刺激的敏感性，研究神经-免疫相互作用在神经病理性疼痛发生机制及治疗中的作用。

方案

1. 坐骨神经慢性压迫

手术过程中应采用无菌技术。使用70%乙醇对术部工作表面进行消毒，并预先通过高压灭菌准备无菌器械（如精细剪刀、镊子和牵开器）、纱布、缝合钉和棉拭子。对于多只动物的手术，在每只大鼠之间需使用70%乙醇或干珠灭菌器对器械进行清洁和重新灭菌。操作者应佩戴外科口罩、头帽和无菌手套。

为进行神经缩窄，将铬制肠线剪成约3 cm长的小段，并将其浸入无菌生理盐水中以防止干燥。用于关闭切口时，使用市售的无菌丝线缝合线。

1. 使用5%异氟烷（O₂中）在诱导室中对大鼠进行麻醉，随后通过定制面罩以2%异氟烷（O₂中）维持麻醉，并在操作过程中监测麻醉状态。常见的替代麻醉剂包括吸入式氟烷或腹腔注射戊巴比妥钠。应避免使用氯胺酮，因其为N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，而这些受体在神经病理性疼痛的发展中具有重要作用。
2. 剃除大鼠左侧后肢的毛发，然后将动物置于37°C温控加热垫上，并在眼睛表面涂抹润滑性眼用软膏。
3. 使用70%异丙醇和碘溶液交替涂抹三次，对剃毛区域进行消毒。
4. 将大鼠俯卧放置，抬起左侧后肢，用胶带固定足部，使股骨与脊柱成90°角并保持该位置。
5. 在皮肤上做一切口，切口方向与股骨平行，但位于股骨下方3–4 mm处；通过切开结缔组织，将切口周围的皮肤与肌肉分离。
6. 使用钝头剪刀，切开臀浅肌与股二头肌之间的结缔组织。
7. 使用牵开器扩大两块肌肉之间的间隙，以便清晰观察坐骨神经。
8. 在显微镜下使用弯头钝头镊子和显微剪刀，轻柔地从周围结缔组织中游离出约10 mm长的坐骨神经（位于坐骨神经三分叉近端）。
9. 在显微镜及良好光源下，在坐骨神经三分叉近端处以铬制肠线（4.0，Ethicon，USA）打四个双结结扎线，各结扎线间距1 mm。每个结扎线先打一个单圈松结，然后捏住线的两端靠近结环处，轻轻收紧至刚好贴合但不滑动为止。为固定结环位置，在第一个结上再打第二个结完成双结。最后将线头剪至约1 mm长。神经的压迫应尽可能轻微，一旦观察到短暂抽搐应立即停止，以防阻断神经外膜血流。过度收紧结扎线会导致轴突切断和自残行为（自残），这两种均为不良副作用，会影响后续疼痛高敏感性测试的成功。
10. 使用缝线（Mersilk 5.0，Ethicon）缝合肌肉层，并用钉皮钉（Autoclip，9 mm）闭合皮肤。随后使用碘溶液（Riodine）对伤口进行消毒。
11. 在麻醉恢复期间密切观察大鼠，并将其置于单独笼子中恢复，使用平铺纸垫料（而非标准动物饲养垫料），以防止无意识动物发生窒息。
    在给予任何术后镇痛药物前，研究人员应考虑其可能干扰疼痛高敏感性检测。事实上，已有证据表明，在损伤时局部应用麻醉剂利多卡因可改变神经病理性疼痛的发展进程，并在随后数周内减轻痛觉过敏的程度⁷。有关此问题的进一步讨论，请参见Bennett et al⁸的综述。

2. 疼痛行为的测量

1. 建议在开始实验前数天每天对大鼠进行抓取和处理，使其适应操作人员，减少应激反应及咬伤风险。
2. 在行为学测试前，大鼠需适应测试程序及动物饲养环境。测试环境应保持安静且严格控制，温度和湿度恒定，并在每次测试时尽量安排在每天的相同时间段进行。
3. 疼痛超敏反应测试应在坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）前多次进行（作为基线值），并根据需要在CCI术后不同时间点重复进行。

3. 机械缩足阈值

1. 测试当天，在测量缩足阈值前15-30分钟将大鼠放入带有高架金属网底的测试笼中，允许其进行笼内探索和理毛活动，直至活动停止，使大鼠处于放松且静止的状态。
2. 使用动态足底von Frey机械痛觉测定仪（Ugo Basile，意大利），将触觉刺激装置的纤维丝置于后肢足底中点下方，注意避开金属网格，然后按下启动键。仪器会自动抬升纤维丝，以逐渐增加的力度对后肢足底表面施加机械刺激。

手动 von Frey 纤毛是一系列直径递增的纤维丝，经过校准后可在施加于皮肤时产生特定的作用力。如先前所述⁴，它们可作为电子动态足底 von Frey 感觉计的替代工具，用于测量足爪回缩阈值。此外，还有多家厂商生产电子 von Frey 感觉计（例如 IITC，美国和 Somedic，瑞典）。

3. 以交替顺序记录受伤和未受伤后爪的机械缩足阈值。该设备向足爪施加压力，当出现缩足反应时，系统会自动记录并显示所施加的最大压力（单位：克）。如果反应不明确（例如动物行走或理毛），需重复施加刺激并再次记录阈值。刺激后出现后爪舔舐或抖动，是与疼痛相关的动物行为表现。
4. 每次机械刺激重复3次，各次刺激之间间隔约5分钟，记录各次的阈值，然后计算缩足阈值的平均值。

4. 热刺激缩足潜伏期

在开始实验前，应调整足底测试仪器的红外线（I.R.）热强度。在我们的实验室中，我们将I.R.强度调节至使未处理大鼠的平均缩足潜伏期约为10秒，并将截断潜伏期设定为20秒，以避免因动物未能及时缩足而导致组织损伤。

1. 测试当天，在测量潜伏期前15-30分钟将大鼠放入玻璃底测试笼中，使其适应环境，待其探索和理毛行为停止后，大鼠处于放松且静止状态。
2. 使用热板足底镇痛仪（Ugo Basile，意大利），将红外热源对准后肢足底中段下方，并按下启动键。此时，通过透明玻璃表面，足底区域将受到一束辐射热刺激。其他厂商也生产类似的热板足底镇痛仪器（例如 IITC，美国；Stoelting，美国）。
3. 以交叉平衡顺序分别记录损伤侧与未损伤侧后肢的回缩潜伏期。该设备可自动记录从热刺激开始至足部离开热源所需的时间（单位为秒）。若出现模糊反应（例如行走或理毛行为），应重复刺激并重新记录潜伏期。刺激后出现后肢舔舐或抖动行为，提示与疼痛相关的行为反应。
4. 每次刺激间隔约5分钟，至少重复热刺激3次，记录各次潜伏期，然后计算后肢回缩潜伏期的平均值。

4. 代表性结果

大鼠CCI术后2-12天及术前（基线期）同侧（损伤侧）与对侧（未损伤侧）后肢机械缩足阈值和热缩足潜伏期示例 图3A，以及 图3B从这些图中可以看出，CCI 导致同侧后足的机械缩足阈值和热缩足潜伏期显著降低，表明存在机械性和热性疼痛过敏现象，二者均为慢性神经病理性疼痛的特征。

图1. CCI模型中结扎线位置的示意图。该神经病理性疼痛动物模型是在坐骨神经中段（大腿中部水平）放置四条松紧适度的铬制肠线结扎线。该操作仅损伤部分传入神经纤维，导致足部感觉神经损伤，继而引起后肢足掌的疼痛过敏现象。

图 2. 用于疼痛测试的后足区域示意图。如红点圆圈所示，位于足垫后方的足底中央区域用于疼痛测试。该区域主要由坐骨神经的终末分支支配。应避免在足跟和足垫区域进行测试，因其皮肤敏感性存在差异。

图3. 大鼠坐骨神经慢性压迫损伤后出现的疼痛过敏现象。在CCI术后，损伤侧（同侧）后足爪对机械刺激的缩足阈值（A）和对热刺激的缩足潜伏期（B）均显著降低，与未损伤侧（对侧）后足爪相比具有统计学差异（P<0.01，重复测量双因素方差分析）。数据以均值±标准误表示，n=7只Wistar大鼠。

讨论

坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）是一种广泛使用的慢性神经病理性疼痛的外周神经损伤模型。该模型操作相对简单，且在损伤后至少一个月内可产生显著而稳定的疼痛过敏反应。CCI术后，大鼠会出现患侧后足异常姿势（脚趾并拢、跖屈及足外翻），并频繁出现患侧后足抖动、保护性姿态及舔舐行为，提示存在自发性疼痛⁹。除了感觉功能障碍外，一些研究者发现CCI还会引发行为功能障碍，例如社交互动受损、睡眠障碍、类似抑郁和焦虑的行为表现^10-13，然而也有研究未能观察到类似的行为异常^14,15。因此，CCI模型常被用于研究神经病理性疼痛的发病机制以及潜在治疗药物的评估。

我们描述了左侧坐骨神经的单侧结扎，但需要注意的是，许多研究者已在右侧坐骨神经上实施坐骨神经慢性压迫损伤（CCI），并获得了相似的疼痛和行为学结果。由于惯用手的影响，部分研究者可能发现对某一侧进行手术操作更为方便，而另一些研究者则在实验中交替使用左右侧，以排除可能存在的偏倚。值得注意的是，已有多种对原始操作方法的改良被报道，包括仅使用两条结扎线环绕神经^16,17，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铬制肠线	Ethicon Inc.	G-211	4-0 规格
异氟烷	Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW	n/a
美外丝线	Ethicon Inc.	W-580	5-0 规格
自动夹	BD Biosciences	427631	9 mm 不锈钢
瑞碘	Orion	R1000802F	1% w/v 碘溶液
热板镇痛测试仪	Ugo Basile	37370
动态足底感觉计	Ugo Basile	37400