犁鼻器（VNO）可检测种内化学信号，这些信号传递社会和生殖信息。我们利用在犁鼻器组织中表达G-CaMP2的转基因小鼠进行了Ca2+成像实验。该方法使我们能够分析犁鼻神经元对大量信息素刺激所产生的复杂反应模式。
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摘要
摘要
犁鼻器（VNO）能够检测化学感应信号，这些信号携带有关同种个体社会状态、性状态和生殖状态的信息1,2。这些种内信号（即信息素）以及某些捕食者发出的信号3，均可高度特异性和敏感地激活犁鼻器感觉神经元（VSNs）4。至少有三个不同的G蛋白偶联受体家族——V1R、V2R和FPR5–14——在VNO神经元中表达，介导对化学感应线索的识别。要理解信息素信息如何被VNO编码，关键在于分析单个VSNs对各种刺激的反应特征，并鉴定介导这些反应的特异性受体。
VNO 的神经上皮被一对犁鼻骨包裹。VNO 呈半盲管状结构，一端开口（即犁鼻管）与鼻腔相通。VSNs 将其树突延伸至 VNO 的管腔部分，在此处信息素信号与树突末梢表达的受体接触。VSNs 的胞体形成假复层结构，其中 V1R 和 V2R 分别在顶端层和基底层表达6-8。已有多种技术被用于监测 VSNs 对感觉刺激的反应4,12,15-19。在这些技术中，急性脑片制备具有多项优势。首先，与离体分离的 VSNs 相比3,17，脑片制备能保持神经元原有的形态结构，使细胞的树突相对完整。其次，与完整的上皮组织或整体装片制备相比，在 VNO 的冠状切片中 VSNs 的胞体更易于接近，便于进行电生理研究和成像实验12,20。第三，该方法可与分子克隆技术结合，用于受体的鉴定。
感觉刺激会引发VSN中强烈的Ca2+内流，表明受体被激活4,21。因此，我们构建了在嗅觉感觉神经元（包括VSNs）中表达G-CaMP2的转基因小鼠15,22。该探针具有高灵敏度和遗传可操作性，极大地方便了Ca2+成像实验。该方法省去了以往研究中使用的染料加载步骤4,21。我们还采用了一种配体递送系统，可向VNO切片施加多种刺激。这两种技术的结合使我们能够同时监测大量神经元对多种刺激的反应。最后，我们建立了一套半自动化的分析流程，以辅助图像处理。
方案
1. 溶液配制
- 根据下表配制 10X R1、10X R2 和 10X R3 溶液。
R1
<....化学物质 分子量 (g/mol) 毫摩尔浓度 (1X, mM) 10X 储液 (g/L) NaCl 58.44 125 73.05 KCl 74.55 2.5 1.86 MgCl2 1 M 储液 1 10 ml CaCl2·2H2O 147.02 2 2.94 NaH2PO4·H2O
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讨论
自Dulac和Axel5发现以来，大多数犁鼻器受体（VRs）仍为孤儿受体。这些化学感受受体的信息素配体及其在介导动物行为中的作用尚不明确。迄今为止，仅有一对配体/受体——ESP1肽及其对应受体Vmn2r116（V2Rp5）——被鉴定出来，并被证明可传递特定的社会信息19,23。另一个受体V1rb2已被证实可响应2-庚酮，该物质推测在雌性小鼠尿液中富集24。然而，该配体所传递的具体信息仍不清楚。我们在此开发的方法能够表征犁鼻器（VNO）神经元对大量刺激物的反应，并分析其激活模式。利用该方法，我们发现细胞对雄性或雌性尿液表现出特异性反应，且可能存在专门用于识别性别特异性信息素线索的细胞15。这些细胞上表达的犁鼻器受体仍有待鉴定。本文所述的成像方法不仅可用于筛选尿液中存在的信息素配体，还有助于鉴定响应信息素线索的特异性受体。
G-CaMP 钙离子传感器家族已被应用于多种动物系统，其信号已被证明与钙瞬变具有良好的相关性25-28。使用基因编码的传感器可灵敏地读取神经元反应，并能够.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢安德里亚·莫兰（Andrea Moran）以及霍华德·休斯医学研究所斯托尔斯研究所实验动物服务设施（Lab Animal Service Facility, LASF）成员在动物饲养和技术服务方面提供的出色支持。本研究由斯托尔斯研究所和美国国立卫生研究院（NIH，项目编号NIDCD 008003）为CRY提供的经费资助。本内容完全由作者负责，不代表耳聋及其他沟通障碍国家研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。斯托尔斯研究所、CRY和LM已就tetO-G-CaMP2小鼠向美国专利商标局提交专利申请。
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参考文献
- Birch, M. C. Pheromones. , North-Holland Pub. Co. & American Elsevier Pub. Co. (1974).
- Wyatt, T. D. Pheromones and animal behaviour : communication by smell and taste. , Cambridge University Press. (2003).
- Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection ....
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