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方法文章

在表达基因编码钙传感器的犁鼻器组织切片中成像神经元反应

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DOI：

10.3791/3404

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2011年12月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Anatomy and Cell Biology, The University of Kansas School of Medicine

本文内容

摘要

犁鼻器（VNO）可检测种内化学信号，这些信号传递社会和生殖信息。我们利用在犁鼻器组织中表达G-CaMP2的转基因小鼠进行了Ca2+成像实验。该方法使我们能够分析犁鼻神经元对大量信息素刺激所产生的复杂反应模式。

摘要

犁鼻器（VNO）能够检测化学感应信号，这些信号携带有关同种个体社会状态、性状态和生殖状态的信息1,2。这些种内信号（即信息素）以及某些捕食者发出的信号3，均可高度特异性和敏感地激活犁鼻器感觉神经元（VSNs）4。至少有三个不同的G蛋白偶联受体家族——V1R、V2R和FPR5–14——在VNO神经元中表达，介导对化学感应线索的识别。要理解信息素信息如何被VNO编码，关键在于分析单个VSNs对各种刺激的反应特征，并鉴定介导这些反应的特异性受体。

VNO 的神经上皮被一对犁鼻骨包裹。VNO 呈半盲管状结构，一端开口（即犁鼻管）与鼻腔相通。VSNs 将其树突延伸至 VNO 的管腔部分，在此处信息素信号与树突末梢表达的受体接触。VSNs 的胞体形成假复层结构，其中 V1R 和 V2R 分别在顶端层和基底层表达6-8。已有多种技术被用于监测 VSNs 对感觉刺激的反应4,12,15-19。在这些技术中，急性脑片制备具有多项优势。首先，与离体分离的 VSNs 相比3,17，脑片制备能保持神经元原有的形态结构，使细胞的树突相对完整。其次，与完整的上皮组织或整体装片制备相比，在 VNO 的冠状切片中 VSNs 的胞体更易于接近，便于进行电生理研究和成像实验12,20。第三，该方法可与分子克隆技术结合，用于受体的鉴定。

感觉刺激会引发VSN中强烈的Ca2+内流，表明受体被激活4,21。因此，我们构建了在嗅觉感觉神经元（包括VSNs）中表达G-CaMP2的转基因小鼠15,22。该探针具有高灵敏度和遗传可操作性，极大地方便了Ca2+成像实验。该方法省去了以往研究中使用的染料加载步骤4,21。我们还采用了一种配体递送系统，可向VNO切片施加多种刺激。这两种技术的结合使我们能够同时监测大量神经元对多种刺激的反应。最后，我们建立了一套半自动化的分析流程，以辅助图像处理。

方案

1. 溶液配制

  1. 根据下表配制 10X R1、10X R2 和 10X R3 溶液。
    R1
    化学物质分子量 (g/mol)毫摩尔浓度 (1X, mM)10X 储液 (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M 储液110 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    NaH2PO4·H2O137.991.251.72

    R2
    化学物质分子量 (g/mol)毫摩尔浓度 (1X, mM)10X 储液 (g/L)
    NaHCO384.012521

    R3
    化学物质分子量 (g/mol)毫摩尔浓度 (1X, mM)10X 储液 (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M 储液220 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    HEPES1 M 储液550 ml
  2. 在实验当天，将 100 ml 10X R1 与 100 ml 10X R2 混合于双蒸水（DDW）中，配制成 1 升小鼠人工脑脊液（mACSF），并加入 1.8 g 葡萄糖（终浓度 10 mM）。该配制方法可防止在高 pH 条件下形成碳酸钙沉淀。mACSF 的渗透压约为 310–315 mOsm/L。必要时可用葡萄糖或水调节渗透压。使用 Carboxygen 气体（95% 氧气和 5% 二氧化碳）对溶液充气至少 30 分钟，然后将溶液 pH 调整至 7.2–7.4。
  3. 在实验当天，将 100 ml 10X R2 与 100 ml 10X R3 混合于双蒸水（DDW）中，配制成 1 升任氏液（Ringer's solution），并加入 1.8 g 葡萄糖（10 mM）。任氏液的渗透压和 pH 应与 mACSF 相近。使用 Carboxygen 气体对溶液进行充气。
  4. 在 mACSF 或任氏液中配制 4% 低熔点琼脂糖（LMA）。将熔化的琼脂糖分装至微量离心管中，4°C 保存备用。LMA 由纯化的多糖组成，在 37°C 下保持液态，并在低于 25°C 时迅速凝固。这些特性使其非常适合用于犁鼻器（VNO）包埋及活体组织生理实验。其他不纯材料（如普通琼脂）不适用于活体组织实验，因其未明确成分可能干扰神经元反应。
  5. 在任氏液中配制信息素刺激物。对于小鼠尿液，1:100 的稀释比例可产生显著的反应。

2. VNO 切片的制备

  1. 在处死动物前，将两管LMA置于加热块上，设置温度至>60°C以融化琼脂糖。待凝胶完全液化后，将试管转移至37°C加热块中。
  2. 对G-CaMP2小鼠实施CO2安乐死后进行断头操作。用剪刀剪开下颌骨以移除下颌。剥离有皱褶的上腭组织，暴露鼻腔（图1A）。将手术刀插入两颗前门齿之间，分离下颌骨，小心移除下颌骨以暴露犁鼻器（VNO）。此时可通过夹住尾骨将整个VNO从鼻腔中抬起（图1B）。立即将VNO转移至冰冷的含氧mACSF溶液中。
  3. 在解剖显微镜下，使用#5镊子的尖端沿鼻中隔骨壁轻轻滑动，分离两侧VNO（图1C）。剥离包裹VNO组织的犁骨，从骨腔中轻柔地抬起整个VNO组织。此步骤需格外小心，避免损伤神经上皮。组织表面残留的微小骨碎片必须彻底清除后再进行包埋；若残留碎片可能在切片时被刀片挂住，导致组织从琼脂糖块中脱出。
  4. 用镊子夹住VNO组织的后端，轻轻将其浸入融化的琼脂糖中（图1D）。迅速将试管置于冰上冷却，使琼脂糖凝固。包埋与冷却过程应不超过2分钟。
  5. 使用VF300组织切片机（Precisionary Instruments, Greenville, NC）进行切片。将含有VNO的琼脂糖块修整成合适形状，并将其粘附于组织固定座上（图1E和F）。将组织固定座插入金属圆筒中，并在剩余空间内填充额外的LMA。待LMA在冰上凝固后，立即开始切片。向切片室持续供给冰冷的含氧mACSF，并以每片180–200 μm的厚度开始切割。调节前进速度和振动频率，确保切片过程中组织不受压，且VNO不会从琼脂糖块中脱落。收集切好的脑片并转移至mACSF孵育室中（图2A）。在室温下，含氧mACSF中的脑片可保持活性6–8小时。图2B和C分别为G-CaMP2 VNO脑片的微分干涉差（DIC）图像和双光子图像。

3. 成像室设置

  1. 将VNO切片置于灌流室（Siskiyou，Grants Pass，OR）中央，并用切片固定锚（Warner Instruments，Hamden，CT）压住切片（图3A）。固定锚的螺纹应仅压在切片的LMA部分，不得接触VNO组织。通过入口以约100 μl/sec的速度向灌流室输送含氧mACSF，液体经出口处的吸引针排出，从而实现新鲜mACSF的持续流动（图3A和B）。
  2. 用30 ml注射器抽取任氏液，并将其固定在注射泵（New Era Pump Systems，Farmingdale，NY）上。将泵速设定为300–600 μl/min，以实现任氏液对切片的持续灌流（图3C）。
  3. 将任氏液的出口连接至高效液相色谱进样环（HPLC injection loop，Chromtech，Apple Valley，MN）（图3D）。可根据需要选择不同体积的进样环，以精确控制递送液体的体积。本实验中使用20 μl的进样环。进样环控制装置具有两条流路（图3E）。在“加载”（load）位置时，可通过Hamilton精密注射器将样品注入进样环，过量样品经废液出口排出。同时，注射泵推动的任氏液绕过进样环，直接流向与灌流尖端相连的出口（图3A和E）。在“进样”（injection）位置时，泵液流经进样环，将样品推入出口（图3E）。在成像实验开始前，应排除所有气泡，以确保灌流液体流动平稳。也可使用其他商用或自制的进样系统进行刺激递送。
  4. 在5X或10X物镜下调节灌流尖端，使其距离VNO切片约1 mm。
  5. 当搭建新的灌流系统时，建议使用荧光染料测量样品递送的延迟时间和持续时间。将0.1%的罗丹明6G染料注入进样环，并在图像采集开始后5秒切换阀门至进样位置（图3F）。荧光信号在10–30秒之间被检测到。荧光信号的平滑曲线也表明浸入式物镜下无明显湍流，且含氧mACSF对切片实现了充分灌流。

4. 时间序列成像

  1. 我们使用蔡司AxioSkope FS2显微镜配合10X或20X浸水物镜进行延时成像。G-CaMP2信号采用标准GFP带通滤光片（450-490 nm）。通过CCD相机（Zeiss HRM）以1×1或2×2 binning模式采集落射荧光图像，具体模式根据G-CaMP2的表达水平而定。
  2. 将采集速度设置为每秒1帧。调节光照强度，以最小化G-CaMP2信号的光漂白及对细胞的光损伤。每次实验通常采集60帧图像（约60-70秒）。在特定时间点（例如图3F中的5秒）将阀门切换至注射位置，以确保所有实验组之间的时间延迟一致。
  3. 使用任氏液作为刺激物进行预实验。若在样品注入过程中引入运动伪影，需重新调整灌流装置。
  4. 使用以任氏液按1:100稀释的小鼠尿液进行阳性对照实验。G-CaMP2对小鼠尿液反应的典型最大ΔF/F值约为20-40%。如有需要，可在实验结束时向组织施加含10 mM KCl的任氏液，以验证组织切片的活性。
  5. 每次加载一种刺激物后，需用任氏液至少清洗Hamilton注射器三次。不同刺激物之间需用任氏液至少清洗样品环三次。这些步骤可防止不同样品间的交叉污染。
  6. 在施加下一个刺激前，等待4-10分钟，使VSNs恢复。

5. 数据分析

  1. 对从一个切片获取的所有图像进行图像配准。我们使用在 AxioVision（Carl Zeiss，North America）中自定义编写的 VBA 脚本自动化此过程。同一实验中的所有图像帧均通过弹性配准与一个共同选定的参考帧对齐（图 4A）。弹性配准，也称为非线性配准，是一类强调将目标图像以非刚性方式变换至参考图像的图像配准技术。此处我们采用 AxioVision 中提供的实现方法。

    该参考帧从图像堆栈中任意选择。
  2. 执行图像相减以识别响应细胞。我们使用 ImageJ v1.42 中自定义编写的宏（http://rsb.info.nih.gov/ij/，NIH，Bethesda，MD）自动化此过程。为每个堆栈生成最小投影图像。将最小投影图像从原始堆栈中减去后，响应细胞即显现出来（图 4B）。
  3. 从相减后的堆栈中确定感兴趣区域（ROI），并使用 ImageJ 的 Multi-Measure 插件获取 ROI 坐标。处理一个实验中的所有堆栈，并将所有 ROI 坐标保存至一个 ROI 主列表中（图 4C）。
  4. 利用 ROI 主列表，通过 ImageJ 中自定义编写的宏和 Multi-Measure 插件，从原始图像堆栈中测量细胞响应（图 4D）。在 Matlab（Mathworks Inc.，Natick，MA）中绘制响应曲线和热图。

6. 典型结果

使用从四只不同小鼠收集的尿液样本进行犁鼻器成像实验的示例如图5所示。组织切片对尿液刺激产生多样化的激活模式。共鉴定出约80个细胞对至少一种尿液刺激产生反应，其反应的ΔF/F值在热图中展示（图5A）。细胞1、2和3的反应轨迹在图5B中绘制，显示了尿液刺激引起的时间过程激活。细胞1对两种雌性尿液样本均有反应，但对雄性样本无反应；而细胞2则表现出相反的激活模式，仅对两种雄性样本有反应。细胞3则对个体雄性和雌性样本均产生激活。细胞1和2对尿液中性别特异性信号表现出特征性反应15。

犁鼻器（VNO）解剖、解剖示意图、感觉分析设备设置。
图1 犁鼻器（VNO）解剖过程的示意图。A. 小鼠头部中VNO的解剖位置。一只G-CaMP2小鼠的头部已被解剖，并倒置放置，腭部软组织已被去除，以暴露VNO。插图显示同一图像的荧光照片，其中VNO的神经上皮呈亮绿色。B. 分离后的VNO侧视图，其包裹于犁骨内（上方），以及同一VNO的荧光图像（下方）。C. VNO的冠状面视图及解剖过程。一侧VNO从鼻中隔分离后，可移除犁骨以取出神经上皮。D. 将VNO包埋于LMA中。E. 将包埋好的组织块粘附至切片组织固定器上。组织固定器以每片180–200 μm的速度推进，将琼脂糖块从金属套筒中推出进行切片。切割刀片紧贴金属套筒放置。F. VF300组织切片系统的侧视图。B.V.，血管；N.E.，神经上皮。

A. 用于成像的显微镜装置及其光学调整；B, C. 生物样品的显微图像。
图 2 VNO 切片。A. VNO 切片在室温下保存于充氧的 mACSF 溶液中。B. VNO 切片的微分干涉差（DIC）图像。C. 来自 G-CaMP2 小鼠 VNO 的双光子图像。比例尺，50 μm。

VNO灌流装置、注射泵和色谱方法示意图及数据结果图
图3 灌流系统装置示意图。A. 典型的灌流 chamber，带有进液口和出液口。VNO切片置于chamber中央，并用组织固定锚压住。组织固定锚的中部丝线已被移除，以避免对VNO组织施加压力。B. 将灌流chamber放置于显微镜载物台上，浸没式物镜下方。图中示出mACSF进液口、吸出出口和灌流尖端。C. 单通道注射泵通过灌流尖端持续输送Ringer's溶液。D. 采用HPLC进样环系统，便于刺激样品的加载与注入。E. 加载与注入位置下流体流向的示意图。Ringer's溶液以绿色表示，刺激样品以品红色表示。箭头指示流动方向。F. 灌流系统的延迟时间与洗脱时间测定。将罗丹明6G荧光染料加载至样品环中，并在第5秒时切换阀门至注入位置（以箭头指示）。在10–30秒之间检测到荧光信号变化，随后信号逐渐减弱。

显微成像中的图像配准与感兴趣区域处理，结合刺激响应分析及数据集概览。
图 4 图像处理流程。A. 对同一切片的所有图像帧均相对于一个参考帧进行图像配准。B. 将图像栈的原始帧减去其最小投影图像，响应细胞在相减后更加显著。C. 选取感兴趣区域（ROI），并将其坐标汇总生成主列表。D. 利用来自原始图像栈的 ROI 主列表对响应细胞进行测量。

显示 ΔF/F 分析的热图和折线图；FVB、CBA、BL6 神经活动数据比较。
图5 一项典型的G-CaMP2 VNO成像实验。A. 使用单只雄性和雌性小鼠尿液刺激后获得的ΔF/F反应热图。尿液样本来自单只雄性和雌性小鼠。X轴表示从切片中鉴定出的反应细胞，Y轴表示实验中使用的尿液样本。颜色条表示ΔF/F值。B. A图中标记的3个代表性细胞的反应时间进程。箭头表示刺激施加的时间。F-FVB，雌性FVB；F-CBA，雌性CBA；M-FVB，雄性FVB；M-BL6，雄性C57BL/6。

特异性试剂与仪器列表：

试剂名称 公司 目录号 备注（可选）
灌流室SiskiyouPC-H水平式
切片固定装置Warner InstrumentsSHD-22CL 
灌流口固定架ALA scientific, Inc.MPIOH-S 
注射泵New Era Pump Systems, Inc.NE-300 
低压注射阀ChromtechV-451 
PEEK管路Chromtech15311/16" OD, 0.25mm ID
PEEK样品环Chromtech180320 μL
Hamilton注射器Chromtech80630100 μL

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讨论

自Dulac和Axel5发现以来，大多数犁鼻器受体（VRs）仍为孤儿受体。这些化学感受受体的信息素配体及其在介导动物行为中的作用尚不明确。迄今为止，仅有一对配体/受体——ESP1肽及其对应受体Vmn2r116（V2Rp5）——被鉴定出来，并被证明可传递特定的社会信息19,23。另一个受体V1rb2已被证实可响应2-庚酮，该物质推测在雌性小鼠尿液中富集24。然而，该配体所传递的具体信息仍不清楚。我们在此开发的方法能够表征犁鼻器（VNO）神经元对大量刺激物的反应，并分析其激活模式。利用该方法，我们发现细胞对雄性或雌性尿液表现出特异性反应，且可能存在专门用于识别性别特异性信息素线索的细胞15。这些细胞上表达的犁鼻器受体仍有待鉴定。本文所述的成像方法不仅可用于筛选尿液中存在的信息素配体，还有助于鉴定响应信息素线索的特异性受体。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢安德里亚·莫兰（Andrea Moran）以及霍华德·休斯医学研究所斯托尔斯研究所实验动物服务设施（Lab Animal Service Facility, LASF）成员在动物饲养和技术服务方面提供的出色支持。本研究由斯托尔斯研究所和美国国立卫生研究院（NIH，项目编号NIDCD 008003）为CRY提供的经费资助。本内容完全由作者负责，不代表耳聋及其他沟通障碍国家研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。斯托尔斯研究所、CRY和LM已就tetO-G-CaMP2小鼠向美国专利商标局提交专利申请。

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参考文献

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