本文描述了一种测定乙酸激酶活性的方法。该检测方法利用直接反应来测定乙酸激酶在生成乙酸方向上的酶活性及动力学，适用于不同的磷酸基受体。此外，该方法还可用于检测其他利用乙酰磷酸或乙酰辅酶A的酶。
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摘要
摘要
乙酸激酶属于乙酸和糖激酶-Hsp70-肌动蛋白（ASKHA）酶超家族1-5，可利用ATP作为底物，催化乙酸可逆地磷酸化生成乙酰磷酸。乙酸激酶广泛存在于细菌（Bacteria）中，在古菌（Archaea）的一个属中也有发现，并且在真核微生物（Eukarya）中同样存在6。目前研究最为深入的乙酸激酶来源于产甲烷古菌Methanosarcina thermophila7-14。已从引起阿米巴痢疾的病原体溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）中分离出一种乙酸激酶，该酶在生成乙酰磷酸的方向上只能利用PPi而不能利用ATP，迄今为止仅在该属中发现此类酶15,16。
在乙酰磷酸生成方向，乙酸激酶活性通常通过羟肟酸测定法来检测，该方法最早由Lipmann描述17-20，是一种偶联测定法，其中ATP转化为ADP的过程通过丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的作用与NADH氧化为NAD+相偶联21,22，或通过检测乙酰磷酸产物与羟胺反应后释放的无机磷酸的测定法23。在相反的乙酸生成方向上的活性，则通过ADP生成ATP的过程与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和己糖激酶催化NADP+还原为NADPH的反应相偶联来测定24。
本文介绍一种检测乙酸激酶催化生成乙酸方向活性的方法，该方法无需使用偶联酶，而是基于对乙酰磷酸消耗量的直接测定。酶促反应结束后，剩余的乙酰磷酸被转化为铁-羟肟酸复合物，可通过分光光度法进行检测，类似于羟肟酸测定法。因此，与依赖ADP生成ATP的标准偶联测定法不同，这种直接测定法可用于检测生成ATP或PPi的乙酸激酶。
方案
本方案的整体流程如图1所示。
1. 标准曲线与检测用溶液的配制
- 配制 100 mL 的 2 mol/L 盐酸羟胺溶液。称取 13.9 g 盐酸羟胺（分子量 69.49 g/mol），溶于约 50 mL 去离子水（ddH2O）中。使用氢氧化钾颗粒或浓溶液调节 pH 至 7.0，定容至 100 mL。该溶液可在室温下保存最多 30 天，或在 4 °C 下保存最多 90 天。
- 配制 100 mL 的氯化铁/盐酸溶液。称取 13.5 g 氯化铁（分子量 270.32 g/mol），溶于约 50 mL ddH2O 中。加入 41.3 mL 浓盐酸（12.1 mol/L），定容至 100 mL。最终氯化铁浓度为 0.5 mol/L，盐酸最终浓度为 5 mol/L。该溶液在室温下保存。
- 配制 100 mL 的 1.84 mol/L 三氯乙酸溶液。称取 30.0 g 三氯乙酸（分子量 163.39 g/mol），溶于 ddH2O 中并定容至 100 mL。该溶液在室温下保存。
- 配制 5 mL 的 0.1 mol/L 乙酰磷酸溶液。称取 0.092 g 乙酰磷酸（分子量 184.06 g/mol），溶于 ddH2O 中并定容至 5 mL。将溶液分装至微量离心管中（每管 0.25 mL），于 -20 °C 冻存直至使用。解冻后....
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讨论
本实验中乙酰磷酸的检测依赖于足够浓度的盐酸羟胺，以及氯化铁溶液的浓度和酸度。若改变实验体系的体积，则需重新评估这两个组分的用量。本文所述的酶促反应在37°C下进行，而羟胺终止反应则在60°C下持续5分钟。较高的温度对于将残留的乙酰磷酸快速转化为乙酰羟肟酸至关重要。显色步骤的时间以及吸光度的测定相对不敏感，可在加入羟胺溶液后5至15分钟内完成。在测定吸光度前，样品应进行离心处理，因为样品的酸性可能导致酶沉淀，从而因浊度而非真实的颜色变化导致吸光度读数偏高。显色反应产物在10至15分钟后开始降解。
该酶动力学分析实验的主要难点在于确定所用酶的用量以及反应第一步的运行时间。这些参数必须针对每种酶通过实验经验来确定，以确保酶活性不会过高而导致所有乙酰磷酸底物被完全消耗。在绘制动力学曲线时，应对每个反应时间点的乙酰磷酸消耗百分比给予仔细关注。通常情况下，在动力学曲线中浓度较低的变量组分应导致乙酰磷酸消耗达到90%或略高，而在底物浓度达到饱和时，乙酰磷酸的消耗应接近10%或略低。一旦确定了最优酶浓度，即可进一步确定用于测定动力学常数的底物浓度范围。
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致谢
本工作由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 #0920274 及南卡罗来纳州实验站项目（SC-1700340）资助，项目负责人为 KSS。本文为克莱姆森大学实验站第 5929 号技术贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酰磷酸 | Sigma-Aldrich | 01409 | 锂盐（97%） |
| 磷酸二氢钠（二水合物） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S381 | |
| 磷酸氢二钠（无水） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S374 | |
| 氯化镁（六水合物） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | M33 | |
| Tris碱 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | B152 | |
| 氯化铁（六水合物） | Thermo Fisher Scientific, Inc. | I88 | |
| 三氯乙酸 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | A324 | |
| 盐酸羟胺 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | H330 | |
5’-二磷酸腺苷 钠盐 | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Biomate III 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142982082 | 标准紫外/可见光分光光度计 |
参考文献
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A.
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