本文介绍一种仅基于细胞感染的实验方案，与现有其他方案相比，该方案可将重组细小病毒的生产效率提高100倍以上。本方案依赖于使用一种新型的基于腺病毒5型的辅助病毒，该辅助病毒含有细小病毒VP转录单元（Ad-VP）。
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摘要
摘要
啮齿类细小病毒（PV），例如大鼠H-1PV和MVM，是一类小型二十面体、单链DNA病毒。其基因组包含两个启动子P4和P38，分别调控非结构蛋白（NS1和NS2）和衣壳蛋白（VP1和VP2）的表达1。这类病毒因其具有溶瘤和抑瘤能力，同时对人类无致病性，因而作为抗癌剂受到广泛关注2。NS1是介导病毒细胞毒性的主要效应蛋白3。为了进一步增强其天然抗肿瘤活性，已通过将编码衣壳蛋白的基因替换为治疗性转基因（例如细胞毒性多肽、细胞因子、趋化因子、肿瘤抑制基因等）的方式，构建了此类病毒的衍生载体4。重组细小病毒（recPVs）载体保留了NS1/2编码序列以及病毒基因组端粒，后者对病毒DNA的复制和包装至关重要。recPVs仅能在生产细胞（通常为HEK293T细胞）中产生，需通过共转染另一种表达VP蛋白编码基因的载体（pCMV-VP）来实现（图1）4。由此产生的recPV载体不具备复制能力。尽管recPVs相较于其亲本病毒表现出更强的肿瘤细胞毒性，但其制备仍面临重大挑战，严重限制了这些制剂在抗癌临床应用中的使用。
我们发现，导入含有Ad-5来源载体的 E2a，E4（orf6））以及 VA RNA 基因例如 pXX6 质粒）转染 HEK293T 细胞后，与现有其他方案相比，重组细小病毒（recPVs）的产量提高了十倍以上。基于这一发现，我们构建了一种新型的 Ad-VP 辅助质粒，其中包含可增强 recPVs 产量的腺病毒基因组元件以及细小病毒 VP 基因单元5使用 Ad-VP 辅助病毒，可采用完全依赖病毒感染步骤（而非质粒转染）的方案生产重组细小病毒（rec-PVs），从而使得难以转染的细胞系也能用于病毒生产。例如 NB324K) (图 2)。我们介绍一种可显著提高重组病毒产量的方法，在不影响最终产品质量的前提下，缩短生产时间并降低成本。5此外，大规模生产重组杆状病毒（在悬浮细胞和生物反应器中） now conceivable。
方案
请注意，重组细小病毒（recPV）的生产需要生物安全等级为2级的实验室。
该方案分为两个主要部分。第一部分（通过转染产生重组细小病毒）用于制备作为接种物的最低量重组细小病毒（recPV），以用于方案的第二部分（通过感染产生重组细小病毒）。一旦制备出少量重组细小病毒，即可省略方案的第一部分，之后仅通过感染方式进行扩增，腺病毒辅助病毒提供编码细小病毒衣壳蛋白的基因（见下文）。
1. 通过转染产生重组痘病毒
1.1 病毒DNA转染
在本实验方案的此部分中，可采用任何已建立的DNA转染方法，包括基于阳离子脂质或磷酸钙的方法。我们通常使用Fugene HD转染试剂。为了监测转染效率，建议同时转染另一块细胞培养板，使用表达增强型绿色荧光蛋白（例如 pEGFP-N1，Clontech）的质粒。当转染后24小时，至少50%的细胞呈EGFP阳性时，认为转染效率较高，适合用于病毒的生产。
- 转染前一天，在10 cm培养皿中接种200万个HEK293T细胞，使转染当天细胞融合度达到50%。用10 ml添加了10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养细胞。
- 在1.5 ml离心管中配制病毒制备混合物（1:2:1摩尔比）：
- 携带目的转基因的recPV载体3 μg（例如phH-1-GFP6）。
- 携带细小病毒衣壳基因单元的pCMV/VP5载体6 μg。
- 腺病毒来源的辅助质粒pXX67 8 μg。
- 用无血清培养基将质粒混合物稀释至终体积850 μl（终浓度为20 ng/μl）。
- 加入42.5 μl Fugene HD（Fugene与DNA的质量比为2.5:1 μl Fugene: μg DNA）。添加Fugene时避免接触离心管管壁。
- 轻轻涡旋振荡5–10秒。
- 室温孵育混合物30分钟。
- 将转染混合物逐滴加入细胞中。轻轻摇动培养皿，使混合物均匀分布。
1.2 病毒制备
- 收获前，在37 °C、92%湿度和5% CO2条件下孵育培养板72小时。在此期间，细小病毒质粒将生成子代细小病毒颗粒。
1.3 病毒收获
- 在组织培养超净台中，用培养基刮取细胞，吸出并转移悬液至15 ml塑料离心管中。
- 在室温下以250 × g离心5分钟。
- 吸除95%的上清液。
- 轻轻涡旋振荡管子，将沉淀重悬于剩余的上清液中（约0.5 ml）。
- 将管子在-80 °C下冷冻。此步骤可作为暂停点，也可继续后续操作。
- 解冻悬液，并使其恢复至室温。
- 将悬液在液氮中冷冻，然后在37 °C温水中解冻。剧烈涡旋振荡15秒，并重复冻融循环两次。
- 在4 °C下以16,000 × g离心15分钟。
- 将上清液收集至新的离心管中。此时管内液体即为粗制病毒提取物。
- 进行病毒滴度测定（见下文）。对于携带GFP基因的重组杆状病毒（recPV），典型产量应为1-3 × 107个病毒感染单位，相当于约1-3 × 1010个含病毒基因组的颗粒。
1.4 病毒储存
- 长期保存时，将含有粗制病毒提取物的试管在 -80 °C 冻存。粗制病毒提取物可用作本实验方案第二部分的接种物。
2. 通过感染生产重组杆状病毒
在开始通过感染方式生产重组细小病毒（recPV）之前，需根据标准方案5生产并纯化携带细小病毒 VP 基因的 5 型腺病毒（Ad-VP 辅助病毒，如文献8所述）。同时，还需准备少量携带目标转基因的重组细小病毒（例如，通过上述转染方法制备的病毒）。
以下，我们描述在175 cm2 培养瓶（T175）中进行重组杆状病毒（recPV）生产的操作流程。通过该方法制备的病毒原液可进一步在10个多重层CellSTACK培养室（Corning）中进行扩增，仅需对本方案中的操作步骤做轻微调整即可。
2.1 感染
- 感染前一天，将一千万个NB324K细胞接种于T175培养瓶中，使感染当天细胞融合度达到60-80%。另准备一个含有相同数量细胞的培养瓶作为对照（未感染细胞）。每个T175培养瓶中应加入20 ml最低必需培养基（MEM）作为终体积，其中添加5%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。
- 次日早晨，在一个2 ml塑料离心管中配制病毒混合液，包含以下成分：
- Ad-VP-helper5，感染复数（MOI，感染单位/细胞）= 10（相当于1 × 108个感染单位）；
- recPVs，MOI = 0.5（相当于5 × 106个感染单位）。用MEM补足至1.5 ml。
- 将全部病毒混合液加入其中一个T175培养瓶中。
- 将培养瓶置于37 °C、92%湿度、5% CO2条件下孵育2小时，每隔15分钟轻轻摇动一次。
- 继续在37 °C、92%湿度、5% CO2条件下孵育20-24小时。
- 更换为新鲜培养基。
2.2 病毒制备
将培养瓶置于37 °C、92%湿度和5% CO2条件下孵育48小时。作为病毒高效产生的指标，在感染后36-48小时，应观察到含有病毒感染细胞的培养瓶中出现明显的细胞毒性迹象。
2.3 病毒收获
- 在组织培养罩内，将培养瓶中的培养基上清液吸出并转移至50 ml离心管中。
- 用1.5 ml PBS洗涤细胞两次。
- 加入1.5 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞。将细胞悬液加入已去除的培养基中。
- 在室温下以5,000 × g离心5分钟，收集细胞和上清液。
- 弃去上清液。
- 向细胞沉淀中加入1 ml TE缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.7），轻轻涡旋振荡以重悬细胞。
- 将细胞悬液在液氮中速冻，然后在37 °C温水中解冻。剧烈涡旋振荡15秒，重复冻融循环三次。
- 加入50 U/ml苯甲酸酶核酸酶，在37 °C处理30分钟，以降解细胞基因组DNA和未包装的病毒DNA。
- 在4 °C下以5,000 × g离心20分钟。
- 将上清液收集至新的离心管中。此阶段的上清液即为粗制病毒提取物。按照本方案制备的recPV-GFP典型产量应在1–10 × 108病毒感染单位范围内。
2.4 病毒储存
- 短期保存（最长2个月）时，将病毒储存于4 °C。
- 长期保存（超过2个月）时，将病毒储存于-80 °C。
3. 重组痘苗病毒（RecPV）纯化
- 为了从粗裂解液中纯化重组杆状病毒（recPVs），我们建议按照Zolotukhin的方法进行碘克沙醇不连续梯度离心 等 9建议使用至少5 ml的粗病毒提取物（来自五个T175培养瓶的病毒生产）以实现高效的病毒纯化。
4. 重组细小病毒滴度测定
- 按照 El-Andaloussi 中所述方法进行 recPV 滴定 等5
5. 质量控制
- 采用 El-Andaloussi 中描述的方案 等5 通过在NB324K指示细胞中进行细小病毒蚀斑试验，检测是否存在不期望的具有复制能力的病毒（RCV）。
6. 代表性结果
通过转染法在存在或不存在腺病毒基因组元件的情况下生产重组杆状病毒（recPVs）的示例如图所示 图3细胞转染pCMV/VP（携带编码细小病毒VP衣壳蛋白基因的质粒）和phH-1-GFP（一种含有GFP基因的重组细小病毒） GFP 基因）或 phH-1-荧光素酶（一种携带 萤火虫荧光素酶 基因），有（+ pXX6）或无（-pXX6）携带腺病毒E2A、E4(orf6)和VA RNA基因的pXX6质粒。取等体积的粗细胞提取物作用于NB324K细胞，并按照El-Andaloussi报道的方法进行GFP转导或荧光素酶检测。 等5. 在存在pXX6的情况下，重组杆状病毒（recPVs）的产量显著提高，产量从传统方法获得的每细胞0.3个GFP转导单位（TU）/细胞，提高至本方法获得的约5 TU/细胞（图 3A、B). 在phH-1-荧光素酶的情况下，重组PV的产量也显著增加（约24倍）图 3C这些结果表明，pXX6 中包含的遗传物质能够促进细小病毒的产生。
通过感染法生产代表性重组细小病毒（recPV）的示例如图4所示。NB324K细胞被多种recPV（如图中所示）与Ad-VP辅助病毒（携带编码PV VP衣壳蛋白的基因）共感染。Ad-VP辅助病毒进一步将recPV的产量提高至每接种细胞超过>70 TU（图4A），且未增加产生具有复制能力的病毒颗粒等不良情况的发生率（图4B）。
图1. 基于自主型细小病毒的载体。(A) 顶部：转基因取代了部分编码 VP 蛋白的基因，并由病毒启动子 P38 控制。NS1/2 基因得以保留，其表达由病毒启动子 P4 调控。载体基因组两侧为细小病毒 ITR，其中包含 顺式-复制和包装重组基因组所需的顺式作用元件。底部：携带VP基因的质粒，其VP基因位于异源（例如. CMV），或自体（例如p38）启动子（Px）被提供 在转染中 在重组细小病毒生产过程中，为了弥补重组基因组中结构基因的缺失。ITR，反向末端重复序列。图改编自 4. （B） 重组杆状病毒（recPVs）经典制备流程示意图。将病毒DNA（载体质粒与辅助质粒）瞬时转染至HEK293T细胞，三天后收集细胞并收获病毒。
图 2. 利用 Ad-VP 辅助生产重组细小病毒（recPV）。(A) 重组细小病毒（recPV）与 Ad-VP 基因组的示意图。recPV 包含一个异源转基因，该基因取代了 VP 区域的一部分。Ad-VP 携带细小病毒的 VP 基因。(B) 本论文所述实验方案的示意图。NB324K 细胞同时感染 recPV 和 Ad-VP 病毒。三天后收集细胞，并从细胞裂解液中回收 recPV 病毒颗粒。
图 3. 腺病毒来源的质粒 pXX6 对 recPV 产生的促进作用。将 HEK293T 细胞接种于 10 cm 培养皿中，共转染 pCMV/VP 与 phH-1-GFP（A 和 B）或 phH-1-荧光素酶（C），以产生 recPV。同时，如图所示，细胞共转染腺病毒来源的辅助质粒 pXX6 或不转染。转染后三天，收集细胞并通过三次冻融循环裂解。取等体积的粗病毒提取物作用于 NBK 指示细胞，并进行转导实验。（A） 显示在融合的 NB324K 单层细胞中 GFP 阳性细胞的代表性显微图像。（B） GFP 转导实验的定量结果，以每接种细胞的转导单位（TU）表示。（C） 荧光素酶活性的定量结果，以相对荧光素酶单位（RLU）表示。荧光素酶检测按照 El-Andaloussi 等5所述方法进行。柱状图表示三次重复实验的平均值，并带有标准差误差线。图（B 和 C）中 +pXX6 柱上方的数字表示在存在 pXX6 时 recPV 病毒滴度相对于无 pXX6 时的倍数增加。
图4. 利用重组Ad-VP辅助病毒刺激recPV的产生。（A） NB324K 细胞以 10 的感染复数（Ad-X 单位/细胞，使用 Adeno-X Rapid Titer Kit 滴定）感染纯化的 Ad-VP 辅助病毒，随后分别超感染以下重组细小病毒之一：Chi-hH-1-EGFP11 (0.1 TU/细胞) 或 H-1-GFP (0.5 TU/细胞)5感染后一天更换培养基，两天后收集细胞，通过三次冻融循环裂解细胞。采用粗制细胞提取物，根据El-Andaloussi的方法进行转导实验以测定病毒滴度。 等5. TU，转导单位。 （B） 在存在或不存在 Ad-VP 的情况下生产的病毒批次，通过在 NB324K 指示细胞上进行噬斑测定，分析其复制型病毒颗粒（RCV）的含量。
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讨论
我们已证明，腺病毒基因组元件的存在可增强重组杆状病毒（recPV）的产量。通过转染提供腺病毒基因组元件，recPV的产量提高了10倍以上（从0.3提升至5 TU/细胞）；而通过与Ad-VP辅助病毒共同感染细胞，产量则提高了100倍以上，相较于传统方案具有显著优势。本文所述方案还可通过确定腺病毒基因组元件递送的最佳时机以及Ad-VP辅助病毒感染时的最佳浓度，进一步优化。
插入较大外源基因（超过1,600个碱基）的重组杆状病毒（RecPVs）产生效率较低。这可能是由于外源基因的插入移除了病毒DNA正确包装所必需的顺式作用元件。在不影响杆状病毒（PV）生产的前提下，可插入PV基因组的外源基因最佳大小不超过700个碱基。 6此外，插入的转基因类型也可能影响重组型痘苗病毒（recPV）的制备例如插入编码细胞毒性蛋白的基因可能导致重组杆状病毒（recPV）产量降低。
在重组细小病毒（recPVs）生产过程中，另一个需要考虑的重要方面是可能产生具有复制能力的病毒（RCV），其可通过重组细小病毒与携...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢德国癌症研究中心（DKFZ）病毒生产与开发部门的团队，特别是Marcus Müller、Silvia Münstermann、Barbara Liebetrau和Mandy Roscher。本研究部分得到了德国联邦教育与研究部（BMBF）以及亥姆霍兹协会在德国癌症研究中心与中国台湾大东部癌症研究联盟应用肿瘤病毒学联合项目框架内的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
| F–etal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 25030-024 | |
| Fugene | Roche Group | 047097050001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 苯并核酸酶（Benzonase Nuclease） | Sigma-Aldrich | E8263 | |
| Adeno-X 快速滴定试剂盒 | Clontech Laboratories | 632250 |
参考文献
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- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851(2003).
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