本文介绍一种仅基于细胞感染的实验方案，与现有其他方案相比，该方案可将重组细小病毒的生产效率提高100倍以上。本方案依赖于使用一种新型的基于腺病毒5型的辅助病毒，该辅助病毒含有细小病毒VP转录单元（Ad-VP）。
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摘要
摘要
啮齿类细小病毒（PV），例如大鼠H-1PV和MVM，是一类小型二十面体、单链DNA病毒。其基因组包含两个启动子P4和P38，分别调控非结构蛋白（NS1和NS2）和衣壳蛋白（VP1和VP2）的表达1。这类病毒因其具有溶瘤和抑瘤能力，同时对人类无致病性，因而作为抗癌剂受到广泛关注2。NS1是介导病毒细胞毒性的主要效应蛋白3。为了进一步增强其天然抗肿瘤活性，已通过将编码衣壳蛋白的基因替换为治疗性转基因（例如细胞毒性多肽、细胞因子、趋化因子、肿瘤抑制基因等）的方式，构建了此类病毒的衍生载体4。重组细小病毒（recPVs）载体保留了NS1/2编码序列以及病毒基因组端粒，后者对病毒DNA的复制和包装至关重要。recPVs仅能在生产细胞（通常为HEK293T细胞）中产生，需通过共转染另一种表达VP蛋白编码基因的载体（pCMV-VP）来实现（图1）4。由此产生的recPV载体不具备复制能力。尽管recPVs相较于其亲本病毒表现出更强的肿瘤细胞毒性，但其制备仍面临重大挑战，严重限制了这些制剂在抗癌临床应用中的使用。
我们发现，导入含有Ad-5来源载体的 E2a，E4（orf6））以及 VA RNA 基因例如 pXX6 质粒）转染 HEK293T 细胞后，与现有其他方案相比，重组细小病毒（recPVs）的产量提高了十倍以上。基于这一发现，我们构建了一种新型的 Ad-VP 辅助质粒，其中包含可增强 recPVs 产量的腺病毒基因组元件以及细小病毒 VP 基因单元5使用 Ad-VP 辅助病毒，可采用完全依赖病毒感染步骤（而非质粒转染）的方案生产重组细小病毒（rec-PVs），从而使得难以转染的细胞系也能用于病毒生产。例如 NB324K) (图 2)。我们介绍一种可显著提高重组病毒产量的方法，在不影响最终产品质量的前提下，缩短生产时间并降低成本。5此外，大规模生产重组杆状病毒（在悬浮细胞和生物反应器中） now conceivable。
方案
请注意，生产重组细小病毒（recPV）需要具备生物安全二级的实验室。
该方案分为两个主要部分。第一部分（通过转染产生重组细小病毒，recPV）用于制备作为接种物的最小量重组细小病毒，以用于方案的第二部分（通过感染产生重组细小病毒）。一旦制备出少量重组细小病毒，即可省略方案的第一部分，仅通过感染方式进行扩增，此时腺病毒辅助病毒提供编码细小病毒衣壳蛋白的基因（见下文）。
1. 通过转染法生产重组痘苗病毒（recPVs）
1.1 病毒DNA转染
在本实验方案的此步骤中，可采用任何已确立的DNA转染方法，包括基于阳离子脂质或磷酸钙的方法。我们通常使用Fugene HD转染试剂。为控制转染效率，建议同时转染另一块培养板，使用表达增强型绿色荧光蛋白（例如 pEGFP-N1，Clontech）的质粒作为对照。当转染后24小时，至少有50%的细胞呈EGFP阳性时，可认为转染效率良好，适合用于病毒的生产。
- 转染前一天，在10 cm培养皿中接种200万个HEK293T细胞，使转染当天细胞融合度达到50%。用10 ml添加了10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养细胞。
- 在1.5 ml离心管中配制病毒制备混合物（1:2:1摩尔比）：
- 3 μg携带目的转基因的recPV载体（例如phH-1-GFP6）。
- 6 μg携带细小病毒衣壳基因单元的pCMV/VP5载体。
- 8 μg腺病毒来源的辅助质粒pXX67。
- 用无血清培养基将质粒混合物稀释至终体积850 μl（终浓度为20 ng/μl）。
- 加入42.5 μl Fugene HD（Fugene与DNA的体积与质量比为2.5:1 μl:μg）。添加Fugene时勿接触离心管管壁。
- 轻轻涡旋振荡5–10秒。
- 室温孵育混合物30分钟。
- 将转染混合物逐滴加入细胞中。轻轻摇晃培养皿，使混合物均匀分布。
1.2 病毒制备
- 收获前，在37 °C、92%湿度和5% CO2条件下孵育培养板72小时。在此期间，细小病毒质粒将生成子代细小病毒颗粒。
1.3 病毒收获
- 在组织培养超净台中，用培养基刮取细胞，吸出并转移悬液至15 ml塑料离心管中。
- 在室温下以250 × g离心5分钟。
- 吸除95%的上清液。
- 轻轻涡旋振荡离心管，将沉淀物重悬于剩余的上清液中（约0.5 ml）。
- 将离心管在-80 °C冷冻。此步骤可作为暂停点，也可继续后续操作。
- 解冻悬液，并使其升至室温。
- 将悬液置于液氮浴中冷冻，随后在37 °C温水中解冻。剧烈涡旋振荡15秒，并重复冻融循环两次。
- 在4 °C下以16,000 × g离心15分钟。
- 将上清液转移至新的离心管中。此时管内液体即为粗制病毒提取物。
- 进行病毒滴度测定（见下文）。对于携带GFP基因的重组杆状病毒（recPV），典型产量约为1-3 × 107个病毒感染单位，相当于约1-3 × 1010个含病毒基因组的颗粒。
1.4 病毒储存
- 用于长期保存，可将含有粗制病毒提取物的试管在 -80 °C 下冷冻。粗制病毒提取物可用于本实验方案第二部分的接种。
2. 通过感染产生重组痘病毒
在开始通过感染方式进行重组细小病毒（recPV）生产之前，需先制备并纯化携带细小病毒VP基因的5型腺病毒（Ad-VP辅助病毒，详见于5根据标准方案8还需要有少量携带目的转基因的recPVs例如，通过上述转染方法制备。
以下，我们描述在175 cm2 培养瓶（T175）中进行重组杆状病毒（recPV）的生产。通过此方法产生的病毒原液可进一步在10个多重层CellSTACK培养室（Corning）中进行扩增，仅需对本方案进行少量调整即可。
2.1 感染
- 感染前一天，将一千万个NB324K细胞接种于T175培养瓶中，使感染当天细胞融合度达到60-80%。另准备一个含有相同数量细胞的培养瓶作为对照组（非感染细胞）。每个T175培养瓶中应加入20 ml的最低必需培养基（MEM），并补充5%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，作为最终培养体积。
- 次日早晨，在一个2 ml塑料离心管中配制病毒混合液，包含以下组分：
- Ad-VP-helper5，感染复数（MOI，感染单位/细胞）= 10（相当于1 × 108个感染单位）；
- recPVs，MOI = 0.5（相当于5 × 106个感染单位）。用MEM补至1.5 ml。
- 将全部病毒混合液加入其中一个T175培养瓶中。
- 在37 °C、92%湿度、5% CO2条件下孵育2小时，期间每15分钟轻轻摇动一次。
- 继续在37 °C、92%湿度、5% CO2条件下孵育20-24小时。
- 更换为新鲜培养基。
2.2 病毒制备
将培养瓶置于37 °C、92%湿度和5% CO2条件下孵育48小时。作为病毒高效产生的指标，在接种病毒的细胞培养瓶中，感染后36至48小时应观察到明显的细胞毒性迹象。
2.3 病毒收获
- 在组织培养超净台中，将培养瓶中的培养基上清液吸出并转移至一个 50 ml 离心管中。
- 用 1.5 ml PBS 洗涤细胞两次。
- 加入 1.5 ml 0.25 % 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，将所得细胞悬液加入先前移除的培养基中。
- 在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞及上清液。
- 弃去上清液。
- 向细胞沉淀中加入 1 ml TE 缓冲液（1 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.7），轻轻涡旋混匀以重悬细胞。
- 将细胞悬液置于液氮中冷冻，随后在 37 °C 温水中融化。剧烈涡旋 15 秒，重复冻融循环三次。
- 加入 50 U/ml 苯甲酸核酸酶，在 37 °C 处理 30 分钟，以降解细胞基因组 DNA 及未包装的病毒 DNA。
- 在 4 °C 下以 5,000 × g 离心 20 分钟。
- 将上清液转移至新的离心管中。此阶段的上清液即为粗制病毒提取物。按照本方案制备的 recPV-GFP 典型产量应在 1–10 × 108 病毒感染单位范围内。
2.4 病毒储存
- 短期保存（最长2个月）时，将病毒置于4 °C保存。
- 长期保存（超过2个月）时，将病毒置于-80 °C保存。
3. 重组痘苗病毒（RecPV）纯化
- 为从粗裂解液中纯化重组PVs，我们建议按照Zolotukhin的方法进行碘克沙醇不连续梯度离心 等 9我们建议使用至少5 ml的粗病毒提取物（来自五个T175培养瓶的病毒生产）以实现高效的病毒纯化。
4. 重组细小病毒滴度测定
- 按照 El-Andaloussi 中所述方法进行 recPV 滴定 等5
5. 质量控制
- 采用 El-Andaloussi 中所述的实验方案 等5 通过在NB324K指示细胞中进行细小病毒蚀斑试验，检测是否存在非期望的具有复制能力的病毒（RCV）。
6. 代表性结果
在存在或不存在腺病毒基因组元件的情况下，通过转染产生重组细小病毒（recPVs）的示例如图3所示。细胞共转染携带编码细小病毒VP衣壳蛋白基因的质粒pCMV/VP，以及携带GFP基因的重组细小病毒phH-1-GFP，或携带萤光素酶（firefly luciferase）基因的重组细小病毒phH-1-luciferase；同时在有（+ pXX6）或无（-pXX6）携带腺病毒E2A、E4(orf6)和VA RNA基因的pXX6质粒的条件下进行实验。取等体积的粗制细胞提取物作用于NB324K细胞，并按照El-Andaloussi 等5报道的方法进行GFP转导或萤光素酶检测。在存在pXX6质粒时，recPVs的产量显著提高，根据传统方法获得的产量为0.3个GFP转导单位（TU）/细胞，而采用本方法可将产量提升至约5 TU/细胞（图3A, B）。在phH-1-luciferase的情况下，recPV的产量也观察到显著增加（约24倍）（图3C）。这些结果表明，pXX6质粒所携带的遗传物质能够显著增强细小病毒的产量。
通过感染法生产重组PV（recPVs）的代表性示例如图4所示。NB324K细胞被多种重组PV（如图中所示）与Ad-VP辅助病毒（携带编码PV VP衣壳蛋白的基因）共感染。Ad-VP辅助病毒进一步将重组PV的产量提高至每接种细胞超过>70 TU（图4A），且未增加产生具有复制能力的病毒颗粒等不良情况的发生频率（图4B）。
图1. 基于自主型细小病毒的载体。（A） 上图：转基因替代了部分VP编码基因，并由病毒启动子P38调控。NS1/2基因被保留，其表达由病毒启动子P4控制。载体基因组两侧为细小病毒的ITR（反向末端重复序列），其中含有cis作用元件，对重组基因组的复制和包装至关重要。下图：在重组细小病毒的生产过程中，提供一个携带VP基因的质粒，该基因由异源（例如 CMV）或同源（例如 P38）启动子（Px）驱动，以反式方式弥补重组基因组中结构基因的缺失。ITR，反向末端重复序列。图改编自4。（B） 重组细小病毒（recPVs）生产的经典方案示意图。将病毒DNA（载体和辅助质粒）瞬时转染至HEK293T细胞，三天后收集细胞并收获病毒。
图2. 借助Ad-VP生产重组细小病毒（recPV）。(A) recPV与Ad-VP基因组的示意图。recPV包含一个取代了部分VP区的异源转基因。Ad-VP携带细小病毒的VP基因。(B) 本论文所述实验方案的示意图。NB324K细胞同时感染recPV和Ad-VP病毒。三天后收集细胞，并从细胞裂解液中回收recPV颗粒。
图3. 腺病毒载体质粒pXX6对recPV产生的促进作用。将HEK293T细胞接种于10 cm培养皿中，转染pCMV/VP与phH-1-GFP（A和B）或phH-1-荧光素酶（C）以产生recPV。同时，如图所示，细胞共转染腺病毒来源的辅助质粒pXX6或不转染。转染后三天，收集细胞并通过三次冻融循环裂解。取等体积的粗病毒提取物作用于NBK指示细胞，并进行转导检测。(A) 显示在融合的NB324K单层细胞中GFP阳性细胞的代表性显微图像。(B) GFP转导检测结果，以每接种细胞的转导单位（TU）表示。(C) 荧光素酶活性定量结果，以相对荧光素酶单位（RLU）表示。荧光素酶检测按El-Andaloussi 等5所述方法进行。柱状图表示三次重复实验的平均值，误差线为标准差。(B和C)图中+pXX6柱上方的数字表示在存在pXX6时recPV病毒滴度相对于无pXX6时的倍数增加。
图4. 利用重组Ad-VP辅助病毒刺激recPV的产生。（A） NB324K细胞以10的感染复数（MOI）（Ad-X单位/细胞，使用Adeno-X Rapid Titer试剂盒滴定）感染纯化的Ad-VP辅助病毒，随后分别超级感染重组细小病毒Chi-hH-1-EGFP11（0.1 TU/细胞）或H-1-GFP（0.5 TU/细胞）5。感染后一天更换培养基，两天后收集细胞并通过三次冻融循环裂解。粗制细胞提取物用于根据El-Andaloussi等et al.5的方法通过转导实验测定病毒滴度。TU，转导单位。（B） 在有或无Ad-VP存在下产生的病毒批次，通过在NB324K指示细胞上的噬斑实验分析其复制能力病毒颗粒（RCV）的含量。
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讨论
我们已证明，腺病毒基因组元件的存在可增强重组杆状病毒（recPV）的产量。通过转染提供腺病毒基因组元件，recPV的产量提高了10倍以上（从0.3提升至5 TU/细胞）；而通过与Ad-VP辅助病毒共同感染细胞，产量则提高了100倍以上，相较于传统方案具有显著优势。本文所述方案还可通过确定腺病毒基因组元件递送的最佳时机以及Ad-VP辅助病毒感染时的最佳浓度，进一步优化。
插入较大外源基因（超过1,600个碱基）的重组杆状病毒（RecPVs）产生效率较低。这可能是由于外源基因的插入移除了病毒DNA正确包装所必需的顺式作用元件。在不影响杆状病毒（PV）生产的前提下，可插入PV基因组的外源基因最佳大小不超过700个碱基。 6此外，插入的转基因类型也可能影响重组型痘苗病毒（recPV）的制备例如插入编码细胞毒性蛋白的基因可能导致重组杆状病毒（recPV）产量降低。
在重组细小病毒（recPVs）生产过程中，另一个需要考虑的重要方面是可能产生具有复制能力的病毒（RCV），其可通过重组细小病毒与携...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢德国癌症研究中心（DKFZ）病毒生产与开发部门的团队，特别是Marcus Müller、Silvia Münstermann、Barbara Liebetrau和Mandy Roscher。本研究部分得到了德国联邦教育与研究部（BMBF）以及亥姆霍兹协会在德国癌症研究中心与中国台湾大东部癌症研究联盟应用肿瘤病毒学联合项目框架内的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M4655 | |
| F–etal Bovine Serum | PAA Laboratories | A15-101 | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO，由 Life Technologies 生产 | 25030-024 | |
| Fugene | Roche Group | 047097050001 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 苯并核酸酶（Benzonase Nuclease） | Sigma-Aldrich | E8263 | |
| Adeno-X 快速滴定试剂盒 | Clontech Laboratories | 632250 |
参考文献
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).
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- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851(2003).
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