三维集体细胞侵袭的建模与成像

摘要

肿瘤细胞侵袭三维细胞外基质的模型更能反映真实情况 体内 相比二维运动性实验，该方法能提供更接近真实情况的信息。通过将基质侵袭实验与荧光标记细胞的共聚焦成像相结合，可获得有关侵袭模式以及前导细胞与跟随细胞各自不同作用的详细信息。

摘要

癌症恶性程度的一个决定性特征是侵袭和转移 ¹. 在某些癌症中（例如g胶质瘤 ²），向周围健康组织的局部侵袭是导致疾病和死亡的根本原因。对于其他癌症（e.g乳腺、肺 等等），最终导致发病和死亡的是转移过程，即肿瘤细胞从原发性肿瘤病灶脱离，定植于远端部位，并最终导致器官功能衰竭。 ³据估计，侵袭和转移导致了90%的癌症死亡病例。 ⁴因此，为了改进诊断和治疗，人们对识别介导侵袭和转移的分子过程及关键蛋白质介质产生了极大的研究兴趣。 ⁵.

癌症科学家面临的一个挑战是开发出能够充分模拟肿瘤侵袭过程的侵袭实验方法 体内 情况以实现准确的疾病建模 ⁶二维细胞迁移实验仅能反映侵袭的某一方面，无法体现细胞外基质（ECM）蛋白重塑这一同样关键的因素。近年来，研究深化了我们对肿瘤细胞侵袭机制的理解，揭示出单个细胞可能以伸长型或圆形模式进行移动。 ⁷此外，人们越来越认识到集体侵袭在癌症扩散中的作用，即细胞以条索状、片状和簇状形式侵袭，尤其在仍保持上皮特征的高度分化肿瘤中更为明显。 ⁸.

我们介绍一种改进的方法⁹，用于研究候选蛋白在集体侵袭¹⁰过程中的作用。具体而言，通过构建分别表达不同荧光蛋白的细胞群体，可在分子水平上解析前导细胞与跟随细胞各自所需的活性及蛋白功能。RNA干扰（RNAi）技术可作为分子工具，用于实验性地拆解单个细胞侵袭以及集体侵袭中不同位置细胞所涉及的生物学过程。在本实验流程中，将不同荧光标记的细胞混合后接种于已预先填充Matrigel细胞外基质蛋白的Transwell小室底部，使其向上穿过滤膜并侵入Matrigel中。通过共聚焦成像获取的z轴层扫图像序列经三维重建后，可实现对集体侵袭细胞链的可视化，并分析荧光标记细胞在前导位置与跟随位置中的分布情况。

方案

1. 使用逆转录病毒对细胞进行荧光蛋白标记

1. 接种逆转录病毒包装细胞（例如 Phoenix) 在 0.25 × 10 处取出⁶ 每孔细胞数，6 孔板 含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养皿
2. 48小时后，根据试剂说明书使用Effectene将逆转录病毒DNA转染细胞。
3. 24小时后用培养基清洗孔板两次，然后每孔加入1.5 ml含10% FBS的DMEM。
4. 48 小时后用移液器吸取组织培养液中的包装病毒，并转移至 2 mL 微量离心管中。
5. 以1600 rpm离心5分钟，使细胞沉淀。
6. 将上清液转移至洁净离心管中，于 -80°C.
7. 待进行逆转录病毒感染的细胞以 1.5 x 10⁵ 6 孔板每孔的细胞数及置于湿润培养箱中培养 37°C 过夜。
8. 第二天，移除细胞中的培养基，并加入 1 ml 病毒储备液，补充 4 μl 每孔加入 polybrene（2 mg/mL）。将培养板放回培养箱中。
9. 孵育5-6小时后，向每孔加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，并将培养板放回 37°C 过夜孵育。
10. 第二天，更换培养基，让细胞培养24小时后，加入相应的选择性培养基。
11. 当细胞达到汇合时（具体时间取决于细胞的生长速率和逆转录病毒转导效率，....

讨论

Matrigel 侵袭实验传统上是将细胞置于一层细胞外基质蛋白上，通过底部滤膜的趋化因子诱导细胞迁移并穿过滤膜。侵袭能力的评分依据是计数滤膜下侧的细胞数量。尽管在实际操作中，这种方法与上述“反向”侵袭实验差异不大，但通过可视化细胞在 Matrigel 中向上并穿行的过程，可以获得关于侵袭过程的更多信息。例如，除了能够观察不同标记的细胞以分析集体侵袭中的前导细胞与跟随细胞（图 3C 和 3D）外，该方法还允许对细胞进行固定、通透化、染色，进而检测蛋白表达水平或亚细胞分布。该方法的分辨能力受限于表达荧光蛋白细胞的基础信号强度以及成像设备的灵敏度，尤其是在进行两种或更多颜色成像时。将 Matrigel 与染料淬灭型胶原（DQ 胶原）混合（该胶原被大量荧光素标记，荧光信号被淬灭，直到蛋白水解将胶原片段分离，降低局部荧光素浓度，从而恢复荧光）是该方法的另一种多色应用，可实现对侵袭细胞降解细胞外基质（ECM）过程的可视化。使用配备共聚焦成像和环境控制舱的高内涵筛选设备，可将此实验转化为实时的四维（4-D）侵袭分析，并可同时整合其他检测指标，如 ECM 降解。结合自动化技术，还可设计基于细胞的高通量筛选实验，用于筛选新型抗侵袭靶点的化合物文库。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM（Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基）	GIBCO, by Life Technologies	21969
胎牛血清	PAA Laboratories	A15-101
青霉素-链霉素	GIBCO, by Life Technologies	15140
200 mM L-谷氨酰胺（100倍浓缩液）	GIBCO, by Life Technologies	25050-032
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% 胰蛋白酶 EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300
聚凝素（Polybrene）	Sigma-Aldrich	AL-118
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668019
6.5 mm Transwell 小室，8.0 μm 孔径	Corning	3422
完全 Matrigel	BD Biosciences	354234
钙黄绿素 AM	Invitrogen	C1430
RNase	Qiagen	19101
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4864
共聚焦显微镜	Leica Microsystems	SP2MP