三维集体细胞侵袭的建模与成像

摘要

肿瘤细胞侵袭三维细胞外基质的模型更能反映真实情况 体内 相比二维运动性实验，该方法能提供更接近真实情况的信息。通过将基质侵袭实验与荧光标记细胞的共聚焦成像相结合，可获得有关侵袭模式以及前导细胞与跟随细胞各自不同作用的详细信息。

摘要

癌症恶性程度的一个决定性特征是侵袭和转移 ¹. 在某些癌症中（例如g胶质瘤 ²），向周围健康组织的局部侵袭是导致疾病和死亡的根本原因。对于其他癌症（e.g乳腺、肺 等等），最终导致发病和死亡的是转移过程，即肿瘤细胞从原发性肿瘤病灶脱离，定植于远端部位，并最终导致器官功能衰竭。 ³据估计，侵袭和转移导致了90%的癌症死亡病例。 ⁴因此，为了改进诊断和治疗，人们对识别介导侵袭和转移的分子过程及关键蛋白质介质产生了极大的研究兴趣。 ⁵.

癌症科学家面临的一个挑战是开发出能够充分模拟肿瘤侵袭过程的侵袭实验方法 体内 情况以实现准确的疾病建模 ⁶二维细胞迁移实验仅能反映侵袭的某一方面，无法体现细胞外基质（ECM）蛋白重塑这一同样关键的因素。近年来，研究深化了我们对肿瘤细胞侵袭机制的理解，揭示出单个细胞可能以伸长型或圆形模式进行移动。 ⁷此外，人们越来越认识到集体侵袭在癌症扩散中的作用，即细胞以条索状、片状和簇状形式侵袭，尤其在仍保持上皮特征的高度分化肿瘤中更为明显。 ⁸.

我们介绍一种改进的方法⁹，用于研究候选蛋白在集体侵袭¹⁰过程中的作用。具体而言，通过构建分别表达不同荧光蛋白的细胞群体，可在分子水平上解析前导细胞与跟随细胞各自所需的活性及蛋白功能。RNA干扰（RNAi）技术可作为分子工具，用于实验性地拆解单个细胞侵袭以及集体侵袭中不同位置细胞所涉及的生物学过程。在本实验流程中，将不同荧光标记的细胞混合后接种于已预先填充Matrigel细胞外基质蛋白的Transwell小室底部，使其向上穿过滤膜并侵入Matrigel中。通过共聚焦成像获取的z轴层扫图像序列经三维重建后，可实现对集体侵袭细胞链的可视化，并分析荧光标记细胞在前导位置与跟随位置中的分布情况。

方案

1. 使用荧光蛋白对细胞进行逆转录病毒标记

1. 转染逆转录病毒包装细胞例如 凤凰) 在 0.25 x 10 处输出⁶ 每孔细胞数，6孔板 含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养
2. 48小时后，根据生产商说明书，使用Effectene将逆转录病毒DNA转染细胞。
3. 24小时后用培养基清洗孔板两次，然后每孔加入1.5 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基。
4. 48小时后，用移液器吸取组织培养基中的包装病毒，并转移至2 mL微量离心管中。
5. 以1600 rpm离心5分钟，使细胞沉淀。
6. 将上清液转移至洁净离心管中，于 -80 ℃ 保存°C.
7. 待进行逆转录病毒转导的细胞以 1.5 x 10⁵ 每孔细胞数置于6孔板中，并放入37℃恒温湿润培养箱中培养°C 过夜。
8. 第二天，移除细胞中的培养基，并加入 1 ml 病毒原液，其中补充有 4 μ每孔加入 2 mg/mL 的聚凝胺（polybrene）l。将培养板放回培养箱中。
9. 孵育5-6小时后，向每孔加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM培养基，将培养板放回37°37°C 培养箱中孵育过夜。
10. 次日更换培养基，让细胞继续培养24小时，然后加入相应的选择性培养基。
11. 当细胞达到汇合时（具体时间取决于细胞的生长速度和逆转录病毒转导效率，通常需要4–14天），用胰蛋白酶消化细胞，并以未转导的细胞作为对照进行荧光分选，收集并合并荧光信号高于未转导细胞的细胞，分装后于-80℃冻存° C 以供将来使用。

2. 逆转Matrigel侵袭实验

1. 在冰上缓慢融化一份数量完整的 Matrigel（即含有生长因子的 Matrigel）（图 1A）。
2. 解冻后，将Matrigel用预冷的PBS按1:1比例稀释（在稀释前可将其他添加物以2倍浓度加入PBS中；图1B）。为便于在聚合前操作Matrigel，所有塑料耗材（如枪头、离心管等）均应预先冷却。
3. 根据需要将多个8微米孔径、6.5毫米直径的未包被Transwell插入24孔组织培养板的各孔中，然后小心地用移液器加入100 μ将稀释后的 Matrigel 加入孔板中，置于孵育箱中孵育 ˜37℃下30分钟°C 以固化（图 1C）。
4. 在此期间，准备一种或多种荧光标记的细胞悬液，浓度为 1 至 4 x 10⁵ 每毫升细胞数，具体数量取决于细胞系，来自各预处理条件（e.g在正常生长培养基中进行siRNA、药物处理等操作（图1D）。
5. 当 Matrigel 凝固后，将 Transwell 小室倒置，并用移液器加入 100 μ将细胞悬液转移至滤膜朝上的底面（图1E）。
6. 用24孔组织培养板的底部轻轻覆盖Transwell，使其与每滴细胞悬液接触（图1F）。
7. 将培养板倒置孵育4小时，以促进细胞贴壁（图1G）。
8. 此后，将培养板正置，用无血清培养基依次浸洗每个Transwell，每次1 ml，共洗两次（图2A）。
9. 将Transwell小室置于第三个孔中，加入所需的任何药物或处理（图2B）。
10. 轻轻吹打100 μ10% FBS/DMEM 加趋化因子（e.g. 将含25 ng/ml EGF的培养基加入Transwell中，置于凝固的Matrigel/PBS混合物上方，盖上盖子，在37℃孵育3-5天°C，5% CO₂₂ （图2C）。

3. 染色与可视化

1. 表达荧光蛋白的细胞在共聚焦显微镜观察前可省略以下步骤
2. 如需对侵入Matrigel的非荧光细胞进行成像，请将Transwell小室转移至新的24孔板中，并用移液器将1 ml 4 μM Calcein AM染色液加至每个Matrigel凝胶块上方，使液体溢出边缘，从而实现上下两面染色。Calcein AM（钙黄绿素乙酰氧基甲酯）是一种活细胞染料，可将整个细胞染成绿色，无需固定。
3. 在37°C、5% CO₂的湿润环境中孵育1小时，此时细胞已充分染色，可进行共聚焦显微镜成像。
4. 或者，侵入Matrigel的非荧光细胞也可按照下文3.5至3.9步骤进行固定和染色。
5. 将每个Transwell小室转移至新的24孔板中，加入1 ml含4% 甲醛/0.2% Triton-X 100的溶液覆盖样品。
6. 室温孵育0.5小时。
7. 去除固定液，并用1 ml PBS洗涤3次。
8. 使用100 μg/ml RNase处理30分钟以去除细胞质RNA，随后用PBS洗涤2次。
9. 为实现可视化，加入用PBS稀释的0.01 mg/ml碘化丙啶（PI），室温避光孵育0.5小时，再用PBS洗涤3次。此步完成后，染色后的Transwell小室可在室温避光条件下保存至少1个月。
10. 共聚焦显微镜的具体成像方法取决于可用设备资源。使用倒置共聚焦显微镜时，将含有少量残留PBS的Transwell小室置于大尺寸盖玻片上（确保无气泡），使用非浸油式20倍物镜，从Matrigel凝胶块底部开始，每隔10–15 μm采集一次光学切片。单个光学切片可用于定量分析侵袭程度（图3A），或利用Volocity等适当软件重建为三维结构（图3B）。

4. 代表性结果

图3A展示了一个Z系列光学切片的示例。在此实例中，细胞经Calcein AM染色后，可见从滤膜向上侵袭的细胞数量随距离增加而减少。可通过分析每个间隔处Calcein AM阳性像素与阴性像素的比值来定量侵袭程度，或采用上述固定/染色方法，对各位置的PI阳性细胞核进行计数。Calcein AM染色的一个优势在于，可利用Volocity等软件对细胞侵袭进行三维重建，直观呈现侵袭模式（图3B）。若细胞通过表达荧光蛋白进行标记，则可在三维重建图像中可视化不同颜色标记细胞的位置，既可从侧面观察（图3C），也可通过在重建图像中进行切片观察（图3D）。

图1. 建立反向侵袭实验的步骤示意图。A) Matrigel ECM 在冰上解冻。B) 用含有所需药物处理液（浓度为最终浓度的两倍）的 PBS 以 1:1 比例稀释 Matrigel。C) 将 Transwell 小室放入多孔板中，并将 Matrigel 用移液枪加入每个小室内。D) 制备所需浓度的细胞悬液。E) Matrigel 凝固后，将板倒置并取下，将细胞接种到 Transwell 小室底部的滤膜上。F) 在倒置状态下，将多孔板小心地放置在 Transwell 小室上方，使其与细胞悬液接触。G) 细胞在滤膜上孵育 4 小时以完成贴附。

图2. 反向侵袭实验示意图的延续。A) 待细胞贴壁后，将每个Transwell浸入无血清培养基中两次，以去除未贴附的细胞。B) 将洗涤后的Transwell放入最终的孔中，孔内培养基根据需要添加处理因素。C) 含有趋化因子（例如10%胎牛血清）并根据需要添加处理因素的培养基被小心地铺加到Matrigel上。

图3. 反向侵袭实验结果的代表性图像。A) 使用Calcein AM染色的细胞侵袭Matrigel的光学切片，通过共聚焦显微镜以15 μm间隔拍摄。B) 由一系列共聚焦Z轴图像堆栈重建的细胞侵袭三维结构，从侧面观察。转载自参考文献¹⁰。C) 标记GFP和RFP的细胞侵袭Matrigel的三维重建图像，从侧面观察。D) GFP和RFP标记细胞三维重建结构的光学切片。转载自参考文献¹⁰。

讨论

Matrigel 侵袭实验传统上是将细胞置于一层细胞外基质蛋白上，通过底部滤膜的趋化因子诱导细胞迁移并穿过滤膜。侵袭能力的评分依据是计数滤膜下侧的细胞数量。尽管在实际操作中，这种方法与上述“反向”侵袭实验差异不大，但通过可视化细胞在 Matrigel 中向上并穿行的过程，可以获得关于侵袭过程的更多信息。例如，除了能够观察不同标记的细胞以分析集体侵袭中的前导细胞与跟随细胞（图 3C 和 3D）外，该方法还允许对细胞进行固定、通透化、染色，进而检测蛋白表达水平或亚细胞分布。该方法的分辨能力受限于表达荧光蛋白细胞的基础信号强度以及成像设备的灵敏度，尤其是在进行两种或更多颜色成像时。将 Matrigel 与染料淬灭型胶原（DQ 胶原）混合（该胶原被大量荧光素标记，荧光信号被淬灭，直到蛋白水解将胶原片段分离，降低局部荧光素浓度，从而恢复荧光）是该方法的另一种多色应用，可实现对侵袭细胞降解细胞外基质（ECM）过程的可视化。使用配备共聚焦成像和环境控制舱的高内涵筛选设备，可将此实验转化为实时的四维（4-D）侵袭分析，并可同时整合其他检测指标，如 ECM 降解。结合自动化技术，还可设计基于细胞的高通量筛选实验，用于筛选新型抗侵袭靶点的化合物文库。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM（Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基）	GIBCO, by Life Technologies	21969
胎牛血清	PAA Laboratories	A15-101
青霉素-链霉素	GIBCO, by Life Technologies	15140
200 mM L-谷氨酰胺（100倍浓缩液）	GIBCO, by Life Technologies	25050-032
嘌呤霉素	Sigma-Aldrich	P8833
0.05% 胰蛋白酶 EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25300
聚凝素（Polybrene）	Sigma-Aldrich	AL-118
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668019
6.5 mm Transwell 小室，8.0 μm 孔径	Corning	3422
完全 Matrigel	BD Biosciences	354234
钙黄绿素 AM	Invitrogen	C1430
RNase	Qiagen	19101
碘化丙啶	Sigma-Aldrich	P4864
共聚焦显微镜	Leica Microsystems	SP2MP