对啮齿类动物进行立体定位手术可实现对清醒且行为正常的动物进行靶向给药或电刺激，并进行记录。在本视频演示中，我们将展示对该长期沿用的手术方法的近期程序优化，这些优化显著提高了动物的术后存活率，并减少了术后体重下降。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
几十年来，立体定位手术将套管植入特定脑区一直是一种非常成功的实验技术，可用于研究清醒且行为正常的动物中局部调控的神经递质和信号通路的作用。此外，通过立体定位植入电极进行电生理刺激和记录研究，对我们目前理解行为动物中的神经可塑性和脑网络起到了关键作用。随着关于优化啮齿类动物手术技术的知识不断积累1-4，公众对动物福利问题的关注日益提高，以及严格的立法要求（例如2010年欧盟关于实验动物使用的规定5），促使我们对这些手术程序进行了改进，特别是在术中氧气补充、持续监测血氧饱和度和心率水平方面引入了新流程，并建立了标准化的术后护理方案。我们的观察表明，这些改进措施显著提高了动物术后存活率，并改善了其整体健康状况（例如体重减轻减少、活动能力增强）。本视频将展示此类立体定位手术的一般操作流程，并重点介绍我们所作的多项改进。我们将以大鼠为例说明这些手术操作，但通过使用适用于立体定位仪的特殊适配器，该类手术也可应用于小鼠或其他小型实验动物6。
方案
注意：整个操作过程中应采用无菌技术。手术中使用的所有器械和材料（棉签、纱布等）均需通过高压灭菌法进行消毒。操作人员应佩戴外科口罩、头帽和无菌手套。工作区域及立体定位仪应彻底清洁，并用70%乙醇溶液消毒。
1. 术前操作
- 设置立体定位仪及所需全部材料。预热加热垫。
- 将套管插入其支撑架中，并检查其是否平直。
- 打开气体系统——环境空气与氧气的混合气体（氧气应占总流量的30-35%）。
- 称重实验大鼠并给予麻醉剂。我们采用的是氯胺酮（37.5 mg/kg）与右美托咪定（0.25 mg/kg）混合液，皮下注射。不同麻醉方案请参见Flecknell4 和 Hellebrekers 等7.
- 大鼠失去意识后，使用电动剃须刀剃除从耳部至两眼之间的头部区域毛发。
- 将大鼠置于加热垫上，使其鼻部位于通气管前方。使用血氧仪监测大鼠的血氧水平，确保其维持在适当范围内（不应下降至 <90%）。请遵循制造商的说明，正确使用设备。
- 在双眼角膜上涂抹眼霜（Duratears Z，Alcon）以防止脱水。
- 检查大鼠的反射（尾部反射或夹趾反射，如 Walantus 所示） 等8) 以确保其麻醉充分。若大鼠仍表现出明显反射，则可能需要补充麻醉。
- 若无足趾夹捏反射，将大鼠置于立体定位仪中，调节耳杆使两侧读数相等，并通过鼻杆固定将供氧管再次置于动物前方。再次检查大鼠血氧饱和度是否达到90%或以上。若未达到，可调整供氧管位置使其更靠近鼻部，或增加氧气流量。在整个手术过程中持续监测血氧饱和度和心率。
- 使用直肠温度计持续监测大鼠体温（优先连接至加热垫），并在手术开始和结束时记录体温数值。调节加热垫或使用毯子维持大鼠体温在37.5至 38.5°C.
2. 手术
- 注射镇痛剂。我们采用单次围手术期给予卡洛芬（4.0–5.0 mg/kg，皮下注射）。关于不同的镇痛方案，请参见 Hellebrekers 等7.
- 从中心向有毛发的边缘对剃毛区域的皮肤用消毒剂（如0.5%氯己定）清洁三次，并局部注射利多卡因（20 mg/ml）和肾上腺素（5 mg/ml）的混合液，以实现局部麻醉和血管收缩（防止过度出血）。
- 在头皮正中线上做一个长约2.5 cm的前后方向切口，从两眼之间延伸至耳后。使用4–6个止血夹夹住皮肤并保持切口开放。用刮匙和/或棉签去除结缔组织，清洁术区以暴露颅骨表面。
- 检查头部是否水平：首先找到Lambda，将引导套管精确置于该位置正上方并接触颅骨，记录背腹向坐标。接着，将引导套管精确置于Bregma正上方并接触颅骨，记录其背腹向坐标。这两个坐标应完全相同。若差值大于0.1 mm，则需调整颅骨水平。 关键词：头部水平校准，Lambda，Bregma，引导套管，背腹向坐标，颅骨定位 >0.3 mm，调节鼻杆以校正。
- 使用无菌手钻在颅骨上钻两个小孔以固定颅骨螺丝（一个孔位于一侧半球导管位置前方约5 mm处，另一个孔位于对侧半球导管位置后方5 mm处）。将两枚无菌螺丝旋入这两个孔中，直至牢固锚定，但不要完全拧入颅骨。
- 以前囟为基准，将引导套管精确定位后，记录前后方向和外侧方向的坐标。通过立体定位图谱辅助，可在前囟的基础上进行加减计算，从而确定各脑区引导套管植入的准确位置。9-11.
- 将导向套管置于正确位置，轻轻接触颅骨。记录背腹向坐标。对于双侧套管植入，接着确定对侧半球的套管位置，并再次记录背腹向坐标。两个坐标应相同（或略有差异） <0.3 mm
- 用无菌铅笔在颅骨上标记套管位置，用手持钻开颅钻孔，并借助导向套管检查孔的大小和位置是否正确。钻孔完成后，使用无菌针头轻柔穿刺脑膜，以便套管顺利插入。
- 将套管插入第一个孔中，并小心下放，直至到达最终的腹侧坐标位置。制备牙科水泥，并充分涂抹于套管周围以及一个或两个螺钉上，以固定套管。等待水泥完全干燥。随后，通过向上转动背腹向支撑杆，小心移除套管支撑装置。
- 将第二根套管插入支撑架，并移至对侧半球的套管位置。将套管插入孔中，并重复之前的步骤。用牙科水泥覆盖螺钉及套管的大部分表面，在水泥未干之前，清除皮肤上的多余水泥。
- 注射温热的（~37°C）无菌生理盐水（约10 ml/kg，皮下注射）以确保补液。
- 水泥完全干燥后，移除套管支撑物，并将无菌针插入每根套管中，以防堵塞。
- 用无菌生理盐水清洁伤口区域，并缝合伤口的前端和后端。
- 将动物从立体定位仪中取出，将其鼻部前方的气体导管重新放置。继续监测血氧饱和度和体温。
- 若使用含右美托咪定的注射麻醉剂，则注射其拮抗剂阿替米唑（0.25 mg/kg，皮下），并等待动物苏醒（约5分钟）。
- 将大鼠放入恢复笼中。为避免低体温，将笼子置于恒温箱内 28°C 或将其置于加热垫上，在返回动物饲养室前至少观察一小时。
3. 术后护理
- 术后前4天内，通过在实验室记录本或“动物福利日记”中每日记录大鼠的体重及其他有关动物状况的观察结果，监测其恢复情况。
- 出现明显疾病症状、伤口感染、体重下降或其他健康状况恶化迹象的动物必须接受特殊护理：例如，额外给予镇痛剂以减轻术后疼痛，除标准饲料外提供粉状饲料与水的混合物以刺激大鼠食欲，和/或皮下注射生理盐水以促进再水化。
- 如果大鼠在接受这些干预后仍未显示出任何改善，或体重持续下降 >体重减轻15%（与术前体重相比），以过量麻醉剂处死动物（人道终点）。
- 大鼠通常需要至少恢复 7 天后，方可开始行为学实验。
4. 代表性结果
为了确定我们对手术流程的多种改进措施——特别是关于氧气补充以及对血氧水平、心率和体温的持续监测——是否提高了动物术后存活率并改善了其总体状况，我们将实施这些改进措施后接受手术的20个动物组（每组20只大鼠）的非存活率，与采用标准手术方案的24个组（每组20只大鼠）的非存活率进行了比较。如图1a所示，采用改良方案手术的组别其非存活率显著降低（P < 0.05；Mann-Whitney U检验，双尾）。此外，如图1b所示，与采用标准手术程序的大鼠相比，采用改良方案手术的大鼠术后体重下降也显著减少（术后第1天：P < 0.05；术后第2天：P < 0.01；术后第3天：P = 0.17；Student t检验）。
图 1. 手术改良措施对非存活率和术后体重下降的影响。（A）采用改良方案与标准方案进行手术的大鼠非存活率比较。非存活率（中位数 ± 四分位距）按每20只大鼠为一组中未能存活过手术的大鼠百分比计算。*p < 0.05，双尾Mann-Whitney U检验（改良方案组n = 20个队列，标准方案组n = 24个队列）。（B）术后第1天（POD1）、第2天（POD2）和第3天（POD3）的体重下降情况（以术前体重百分比表示，均值 ± 标准误）。*P < 0.05，**P < 0.01，Student t检验（每组n = 60）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本视频演示的主要目的是让行为神经科学家熟悉立体定位手术的基本原理。已经开展立体定位手术的研究人员也可能从本视频中获益，并考虑将其某些操作改进应用于自身的实验室。随着对手术技术优化的认识不断加深1-3，以及新型麻醉剂和镇痛剂在人类和兽医医学中的发展4,12，公众对动物福利问题的关注日益增强，加之严格的立法要求（例如2010年欧盟关于实验动物使用的规定5），促使我们引入了新的操作流程，包括在手术期间进行氧气补充以及持续监测血氧饱和度和心率水平。我们观察到，如代表性动物样本所示，总体存活率提高，术后体重减轻显著减少。这种术后体重减轻的降低可能反映出手术对动物造成的负担更小，从而导致动物在术后即刻更为活跃。然而，这种改善是否对其长期健康也有益处尚不明确。但一个显著的观察结果是，暂时移除氧气供应会导致血氧饱和度水平明显且可靠地下降，甚至可能降至50%以下（参见视频演示中的示例）。可以设想，长时间的低氧血症——可能出现在手术期间未接受任何氧气补充的动物中——可能导致缺氧，进而产生长期的行为后果，并对行为实验的结果和/或质量产生负面影响。目前尚不清楚手术期间血氧供应下降的现象是否仅与我...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Peter Gerrits 博士为本视频提供的插图。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70% 酒精 | VWR 国际公司 | ||
| 安替达（阿替美唑） | Orion | ||
| 硫酸阿托品 0,5 | Teva Pharmachemie | ||
| 布狗止血钳 | Aesculap | ||
| 套管针 | Component Supply 公司 | ||
| 氯己定 0.5% | APP Pharmaceuticals | ||
| 清洁粉 | Alconox公司 | ||
| 棉签 | Hartmann BV | ||
| 右美托咪定（Dexdomitor） | Orion | ||
| 钻孔 | Dremel | ||
| Duratears Z | 爱尔康 | ||
| Durogrip 针头–rder converse 130mm | Aesculap | ||
| Durotip 精细剪刀，直/弯，110 mm | Aesculap | ||
| 纱布 | Medicomp（5x5） | ||
| 加热垫 | 哈佛仪器 | ||
| 昆虫针（口针） | Entosphinx（捷克共和国） | ||
| 氯胺酮 10%（ketamine） | Alfasan | ||
| 微型霍尔斯特直头镊 | Aesculap | ||
| Molinea | Hartmann BV | ||
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | ||
| 25G针头 | Terumo Medical Corp. | ||
| 血氧仪 | Edan Instruments, Inc. | ||
| 戊巴比妥 | 乌得勒支大学医学中心药房 | ||
| Rimadyl | 辉瑞制药有限公司 | ||
| 23号手术刀片 | Swann-Morton | ||
| 4号手术刀柄，133毫米 | Aesculap | ||
| 螺丝刀 | 任何供应商 | ||
| Simplex 快速（牙科水泥） | Kemdent | ||
| 颅骨螺钉 | Component Supply 公司 | ||
| 刮勺 | VWR 国际公司 | ||
| Spongestan special | Johnson &安普与约翰逊 | ||
| 立体定位仪 | Kopf Instruments | ||
| 外科镊子 100mm | Aesculap | ||
| 缝合材料 Safil 5/0 | Aesculap | ||
| 10 ml 注射器 | Omnifix | ||
| 1 ml 注射器 | Terumo Medical Corp. | ||
| 5 ml 注射器 | Omnifix | ||
| 利多卡因（含肾上腺素） | 阿斯利康 |
参考文献
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Richardson, C. A., Flecknell, P. A. Anaesthesia and post-operative analgesia following experimental surgery in laboratory rodents: are we making progress? Altern. Lab Anim. 33, 119-127 (2005).
- Stokes, E. L., Flecknell, P. A., Richardson, C. A. Reported analgesic and anaesthetic administration to rodents undergoing experimental surgical procedures. Lab Anim. 43, 149-154 (2009).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia - A Practical Introduction for Research Workers and Technicians. , Academic Press. (2009).
- DIRECTIVE 2010/63/EU OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , (2010).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880-e880 (2008).
- Hellebrekers, L. J., Booij, L. H. D. J., Flecknell, P. A. Anaesthesia, analgesia and euthanasia. Principles of Laboratory Animal Science. Van Zutphen, L. F. M., Baumans, V., Beynen, A. C. , Elsevier Science B.V. 277-311 (2001).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J. Vis. Exp. (6), e236-e236 (2007).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1986).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (2007).
- Swanson, L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. , Elsevier. (1992).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
