通过在背部皮肤进行皮内注射Leishmania前鞭毛体，优化用于皮肤利什曼病的实验性仓鼠模型。该方法在接种、后续观察、病灶特征描述、治疗实施以及临床样本采集过程中均具有优势。动物的运动能力、觅食与饮水行为、嬉戏及社交活动均保持正常。
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摘要
摘要
传统上，实验中将仓鼠接种于鼻部或足垫。然而，在这些接种部位并不总是形成溃疡，且病损大小的测量操作困难，动物也常因病损而出现进食、呼吸和活动困难。为了优化皮肤利什曼病的仓鼠模型，选用年轻成年雄性和雌性金黄仓鼠（Mesocricetus auratus) 通过皮内注射方式注入背部皮肤，剂量为 1 至 1.5 x 107 前鞭毛体 利什曼原虫 物种及后续病灶的进展在感染后长达16周内进行评估。选择金黄地鼠是因为其被认为是评价抗药物效果的合适生物模型 利什曼原虫 由于它们易受不同物种的感染，仓鼠的皮肤感染会形成慢性但可控的病灶，其临床进程表现出与人类相似的症状。因此，通过测量硬结和溃疡面积来确定感染范围是可行的。该方法在接种、随访及典型病灶（溃疡）的表征过程中展现出良好的适应性和操作便利性，同时也适用于多种途径的治疗干预以及不同治疗后临床样本的采集。采用此方法可有效保障动物在运动、觅食与饮水、玩耍及社交活动等方面的生存质量。
方案
1. 豚鼠感染
1. 动物
近交系雌性和雄性金黄地鼠（Mesocricetus auratus），6-8 周龄，体重 140-160 g。动物饲养于温度可控的实验动物设施中，饲喂标准啮齿类干燥饲料，并自由饮水 随意摄取所有涉及动物的实验程序均经机构实验动物使用伦理委员会批准。在进行皮肤嗜性病原体实验感染前 利什曼原虫 寄生虫感染的动物根据标准操作程序进行性别鉴定、标记和称重。性别鉴定时，通过观察雌性动物的乳腺线以及较短的肛门-生殖器距离，或雄性动物的睾丸以及较长的肛门至包皮之间的距离来判断性别。随后，动物通过耳部穿孔或使用浸有苦味酸的棉签涂抹皮肤区域进行标记。耳部穿孔时，先用70%酒精清洁耳部，再使用啮齿类动物专用耳打孔器穿孔，注意避开含有血管的区域。腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）与赛拉嗪（20 mg/kg）按9:1比例配制的混合物，剂量为260-300μl 建议使用25号针头。最后，将动物放入已置于精密天平上的笼盒中称重。
2. 寄生虫
皮肤嗜性利什曼原虫前鞭毛体 利什曼原虫 物种，例如 L. amazonensis，接种于双相 Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) 培养基中培养，于 26°C. 采用感染5天的间歇期（静止期）前鞭毛体感染仓鼠。简言之，收集寄生虫，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，计数后调整浓度至1 × 107 （针对雄性）或 1.5 x 107 （针对雌性）分别将0.1 ml PBS中的寄生虫用于接种雄性或雌性，但接种量可能根据具体情况而有所不同 利什曼原虫 物种（该操作步骤未在视频中展示）。
3. 实验性感染
接种前需剃除皮肤区域的毛发。简言之，将麻醉后的动物置于俯卧位，使用剪刀去除尾根部上方两英寸范围内的毛发。用无菌生理盐水清洁剃除区域后，将寄生虫接种物皮内注射至形成丘疹为止。
4. 临床随访
接种后每7天监测动物一次，持续4至6周，观察病灶是否出现。简言之，将动物固定于夹具中，触诊接种部位的皮肤区域，然后勾画出所形成溃疡的硬结区域，并使用数显卡尺测量溃疡的宽度和长度。
2. 仓鼠的处理
1. 化合物的给药
治疗方案在动物出现溃疡性病变后开始（接种后4-6周）。每种待测化合物分别以5-6只动物为一组进行分组。化合物可通过局部、口服、肌肉或病灶内途径给药。给药前，先将仓鼠麻醉，并用生理盐水或PBS清洗病变区域。当采用局部或病灶内给药时，将仓鼠固定在固定装置中，使待治疗区域暴露；当采用口服或肌肉注射给药时，则牢固固定仓鼠颈部基部。a) 局部给药：将化合物涂抹于病变部位，数分钟后将动物放回笼中。b) 肌肉注射：通过后肢的半腱肌或半膜肌注射药物（最大体积200 μl）。c) 口服给药：通过连接1 ml注射器的14G口径胃管，将药物给予动物（最大体积200 μl）。d) 病灶内注射：使用26G针头，针尖斜面朝下，在溃疡基底部缓慢注射药物（最大体积100 μl），并通过旋转针头覆盖整个病变区域。根据既定的治疗方案，每日给药一次，持续10-20天。
2. 临床随访
由于在此实验模型中，新抗利什曼原虫化合物的疗效是根据治疗后病损的愈合和瘢痕形成情况来确定的，因此在给药结束后每周对每只动物进行临床监测，并持续至给药后三个月。监测期间，需描述病损类型，并使用数显卡尺测量硬结和溃疡面积。同时记录接种部位以外其他区域是否出现病损，以及病损是否复发。每两周称量一次动物体重，并对病损部位进行拍照。每日观察动物的：a）体表状况（毛发、协调性、体温、眼睛、耳位、理毛行为、排便、腹水存在与否、躁动及脱水情况）；以及 b）行为表现（清醒、警觉、好奇、注意力集中、是否与群体共处、对食物和饮水是否有期待、是否难以捕捉）。此外，还需观察给药部位是否存在充血、炎症、啃咬及脱毛现象。
在治疗结束后的第45天采集仓鼠的血液，以测定可能与化合物毒性相关的血液学和血清学指标（见下文）。
通过比较治疗前后病灶大小，采用以下评分系统评估每种治疗方案的有效性： 治愈的 （100% 面积愈合且病灶完全消失）； 临床改善 （减小病灶的尺寸） >50% 的区域）； 临床失败 （增大病灶尺寸）； 复发 在研究结束时，动物先经麻醉，随后通过吸入CO2实施安乐死。死亡后，采集用于寄生虫学、组织学和血清学分析所必需的样本。
3. 寄生虫学检查
存在 利什曼原虫 通过吉姆萨染色涂片直接检查皮肤（病变或瘢痕）、肝、脾和肾样本中的病原体 1 以及对这些组织的组织病理学检查（见下文）。
根据 Titus 及其同事（1985 年）提出的方法2，采用极限稀释法测定病灶部位的寄生虫负荷量。简言之，从每只动物身上取一小块组织，称重后使用注射器活塞在冷 PBS 溶液中进行匀浆。将所得悬液在 4°C 条件下以 600g 离心 10 分钟。随后弃去上清液，将沉淀物重悬于补充有 1% 抗生素和 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中。取 100 μL 悬液加入含有 NNN 培养基并覆盖有 50 μL Schneider 培养基的 96 孔微孔板的每个孔中，并在 26°C 下培养。通过每周在倒置显微镜下观察，持续一个月，根据可检测到前鞭毛体的最高稀释度确定每个样本中存活寄生虫的数量。
4. 皮肤病变（或瘢痕）及其他组织的组织病理学检查
取自皮肤、肝脏和肾脏的活检标本的第三部分用10%福尔马林固定，并包埋于石蜡中。脾脏和心脏的标本也可进行类似处理。将固定组织切成5微米切片，用苏木精-伊红染色，然后在光学显微镜下使用200倍、400倍或1000倍油镜观察，以研究组织微结构、细胞浸润特征以及寄生虫的存在与否。同时拍摄显微照片并采集数字图像。
5. 治疗毒性的评估
该化合物的毒性作用基于动物在临床随访期间监测参数所反映的生理状态和行为状况（见上文）。此外，根据血样中的血液学和代谢参数，以及采用苏木精-伊红染色的组织切片中观察到的组织病理学变化来确定毒性。
血液样本取自心脏，优先选择心室。进行血液学检测时，将血液转移至含EDTA抗凝剂的试管中，并根据标准操作流程进行全血细胞计数分析。进行血清学检测时，将血液转移至1.5 mL离心管中，离心后获取血清，用于代谢指标（包括肌酐、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和尿素氮（BUN）水平）的检测，上述指标使用Kodak Ektachem Dry化学分析仪测定3。
6. 数据分析
采用方差分析（ANOVA）检验对经处理与未经处理动物的数据进行比较。显著性水平设定为 p < 0.05。
3. 代表性结果
摘要
为用于药物疗效筛选，本研究改进了皮肤利什曼病的仓鼠模型。研究了利什曼原虫初次感染仓鼠真皮皮肤后病损的发展及寄生虫学参数。将6至8周龄的近交系雌性与雄性金黄地鼠（Mesocricetus auratus）通过皮内注射分别接种1×107（雄性）或1.5×107（雌性）个L. amazonensis的前鞭毛体（静止期）。感染后20至35天出现结节，感染后4至6周形成溃疡。在感染建立后，评估了两种剂量的五价锑（SbV）的疗效。将仓鼠随机分为三组，每组5只动物，通过肌肉注射途径每日给予葡萄糖酸锑钠，剂量分别为80或120 mg SbV/kg，连续给药10天。第三组通过肌肉注射给予磷酸盐缓冲液（PBS）作为安慰剂。另设一组3只动物不接受任何治疗，作为阴性对照。每种治疗的疗效在治疗结束后随访3个月进行评估。
1. 金黄地鼠（Mesocricetus auratus）感染亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）后的临床病程
背部皮肤感染的仓鼠在感染后4至6周会持续出现表皮明显的溃疡性病变。病变最初表现为小结节，随后发展为溃疡，其面积随感染后时间的延长而增大，在感染后第4至第6周达到适合评估实验药物效果的理想大小（第4周时为18.99至54.7 mm2，第6周时为35.55至92.71 mm2）（图1、图2）。此后，溃疡病变持续明显，可维持至感染后20周，此时实验终止（图1）。
L. amazonensis 感染不会影响仓鼠的体重，未感染和感染仓鼠的体重分别在 104.9 至 124.69 克和 129.71 至 134.02 克之间（p > 0.05，Anova）。在研究期间，动物平均增重 25.58 ± 5.98%。未感染和感染Leishmania的仓鼠血清肌酐、丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平及血常规参数均与参考值相似。仅在60%的感染动物中观察到尿素氮（BUN）水平升高。
感染亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）的仓鼠病灶组织病理学分析显示，与未感染动物存在差异。总体而言，未感染仓鼠的皮肤活检样本未见炎症反应或任何组织学改变（图3a），而感染L. amazonensis的仓鼠则出现肉芽肿性皮炎，并可见大量巨噬细胞浸润真皮层（图3b）。对感染L. amazonensis并接受葡糖酸锑钠治疗（剂量分别为80和120 mg SbV/kg/天，持续10天）的仓鼠组织进行组织病理学分析，结果显示其感染相关病变与对照组（感染但未治疗）相似。总体而言，仓鼠皮肤样本中浆细胞（20%）和中性粒细胞（PMN，80%）水平较轻，伴有中度淋巴细胞浸润（80%），以及轻度（20%）或重度（80%）的巨噬细胞浸润（表2）。这些观察结果符合肉芽肿性皮炎的诊断，这是一种累及真皮层及皮下肌肉的炎性病变。这是与感染相关的主要病灶，在本研究的所有动物中均表现为皮肤利什曼病的严重形式。通过Pearson卡方检验进行统计学分析，显示该关联具有显著性（p < 0.05）。60%-100%动物的肾脏样本显示肾皮质和肾小球呈中度增生，并在75%的动物中伴有轻微肾脏萎缩。这些发现符合膜增生性肾小球肾炎的诊断，该诊断此前已被报道与其他利什曼原虫（Leishmania）物种感染相关。统计学分析显示其关联性显著，Pearson卡方检验结果为p < 0.05。所有组别中40%-100%动物的肝脏显示肝细胞出现轻微空泡样变，可能与糖原在肝细胞中的生理性蓄积等生理过程有关。其他肝脏组织异常，如脂肪变性、纤维化和充血，则与感染过程相关。其他观察结果，如肝细胞空泡样变、心脏肥大、胞质内嗜酸性包涵体的存在，以及肾小管细胞空泡化，经统计学分析与所测试化合物的毒性作用无显著关联（p > 0.05），可能归因于仓鼠自身的生理过程。
2. 葡萄糖酸锑钠在仓鼠模型中的治疗功效
不同时间点治疗后感染仓鼠的临床表型总结见表1。在10天内每日每公斤体重给予120 mg SbV的葡萄糖酸锑钠肌肉注射治疗，可使所有动物的L. amazonensis病灶完全消退，疗效显著（图4）。在治疗后2周和8周内，治愈率达到100%。然而，三个月后，有20%的仓鼠出现病灶复发。当葡萄糖酸锑钠剂量为每公斤体重80 mg SbV时，仅有3只动物实现完全治愈。其余两只动物的病灶分别缩小了33.9%和69.0%（图5）。三个月后，所有接受每公斤体重每日80 mg SbV剂量葡萄糖酸锑钠治疗的动物皮肤中仍可检测到L. amazonensis，而接受每公斤体重每日120 mg SbV剂量葡萄糖酸锑钠治疗的动物中仅有一只仍存在病原体。最终确定肌肉注射每公斤体重每日120 mg SbV、连续10天为有效治愈剂量。
通过有限稀释法检测，与阴性对照组（未处理组）和溶剂对照组（安慰剂组）相比，使用葡糖酸锑钠处理组的寄生虫数量显著减少（p < 0.001）。在未处理动物及PBS处理动物的病灶部位检测到存活的寄生虫（每毫克皮肤组织含0.4至1.6个寄生虫）。仅在对葡糖酸锑钠治疗无应答的动物中分离出寄生虫：1只接受120 mg/kg/天剂量处理的动物（图5b）和2只接受80 mg/kg/天剂量处理的仓鼠（图5c）。在接受葡糖酸锑钠治疗后仍未痊愈的仓鼠中，其寄生虫负荷与未处理组或PBS处理组动物相比无显著差异。
在给予肌肉注射葡萄糖酸锑钠（120 mg SbV/kg/天）的仓鼠皮肤活检组织病理学检查中，未观察到寄生虫；仅见少量巨噬细胞和淋巴细胞浸润真皮层（图6a，6b）。相反，当仓鼠接受80 mg SbV/kg/天剂量的葡萄糖酸锑钠治疗时，则观察到肉芽肿性皮炎，并可见大量巨噬细胞广泛浸润真皮层（图6c，6d）。
3. 毒性
采用相同的治疗方案进行疗效研究的同时，评估了葡糖酸锑钠在80和120 mg SbV/kg体重剂量下的毒性。在末次给药后长达3个月内监测动物的一般健康状况和体重变化。治疗未影响仓鼠的体重，未感染组仓鼠体重范围为104.9至124.69克，感染组仓鼠体重范围为129.71至134.02克。动物在治疗期间平均增重27.59 ± 4.22%，随访期间增重28.74 ± 2.26%（p > 0.05，Anova）。各治疗组均未观察到体重下降（数据未显示）。接受治疗与未接受治疗的仓鼠血清肌酐、丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平及血常规参数均与参考值相似。仅在20%的治疗动物中观察到血尿素氮（BUN）水平升高。
感染仓鼠组织的组织病理学分析 L. amazonensis 在为期10天的治疗中，接受80和120 mg SbV/kg/天剂量的葡甲胺锑酸盐治疗的个体未出现与药物毒性相关的改变。
a磷酸盐缓冲液，b治疗后天数。
表 1. 葡萄糖酸锑钠治疗后实验感染L. amazonensis的仓鼠的临床表型。
通过比较治疗前后病灶大小，采用以下评分系统评估每种治疗方案的有效性： 治愈 （100% 面积愈合且病灶完全消失）； 临床改善 （减小病灶的尺寸） > 50% 的区域）； 临床失败 （增大病灶面积）；复发（治愈后病灶再次活动）
A：无病变；NA：不适用；m：轻度；M：中度；S：重度；PMN：多形核中性粒细胞；NSL：无显著病变；GDM：肉芽肿性皮肌炎；PGD：化脓性肉芽肿性皮炎。1. 淋巴管扩张；2. 类似矿物质的物质。
表 2. 实验感染 L. amazonensis 并经葡糖酸锑钠治疗的仓鼠皮肤组织病理学结果。
图1. 豚鼠经皮内接种1-1.5 × 107个L. amazonensis元幼虫（静止期前鞭毛体）后，20周内皮肤病变发展的过程。Y轴表示溃疡面积（mm²）。
图 2. 金黄地鼠背部皮肤在皮内接种 10 × 107 后，溃疡性病变在 2 周（a）、4 周（b）和 6 周（c）时的摄影记录。
图3. 皮肤活检结果：(a) 未感染且未治疗的仓鼠：未见炎症反应，亦无明显组织学改变；(b) 感染但未治疗的仓鼠：肉芽肿性皮炎，可见多核巨细胞（箭头加星号标记）、大量寄生虫（黑箭头）和巨噬细胞（白箭头）浸润真皮层。苏木精-伊红染色，400×。
图4. 感染亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）并接受肌肉注射葡胺锑钠（120 mg SbV/kg/天，持续10天）治疗的仓鼠临床反应的摄影记录。图片显示了治疗前（a）、治疗结束时（第10天）（b）以及随访期间：治疗后第30天（c）、第60天（d）和第90天（e）病灶的外观。
图 5. 葡萄糖酸锑钠治疗仓鼠皮肤利什曼病的效果。将L. amazonensis接种于金黄地鼠背部皮肤以建立感染模型。感染6周后，动物分别接受以下处理：不治疗（a）、仅肌内注射磷酸盐缓冲液（PBS）（b）、每日肌内注射120 mg SbV/kg葡萄糖酸锑钠（c）或80 mg SbV/kg葡萄糖酸锑钠（d），连续给药10天。图中显示治疗结束时（第0天）以及治疗结束后随访第15、30、60和90天病损面积减少的百分比。120 mg SbV/kg/天或80 mg SbV/kg/天组与对照组（PBS）及未治疗组相比，p < 0.001。
图6. 感染后经肌内注射葡萄糖酸锑钠治疗的仓鼠皮肤活检结果，给药剂量分别为120 mg SbV/kg/天（a, b）和80 mg SbV/kg/天（c, d）。真皮层中仅有少量巨噬细胞和淋巴细胞浸润，未观察到寄生虫。苏木精-伊红染色，200倍（a），1000倍（c）。肉芽肿性皮炎，真皮层有大量巨噬细胞广泛浸润（c）；泡沫样巨噬细胞内可见被吞噬的寄生虫。苏木精-伊红染色，200倍（b），1000倍（d）。
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讨论
皮肤利什曼病在热带和新热带地区呈地方性流行。由于其临床表现谱广泛，从皮肤小结节到严重的黏膜组织破坏不等，因此常被称为一组疾病。目前大多数可用药物价格昂贵，需要长期治疗方案，且疗效正逐渐下降，因此亟需发现新的药物。
小鼠模型被广泛应用，但存在一些缺点。例如，基于皮肤利什曼原虫前鞭毛体皮内注射后所形成的病变 利什曼原虫 物种，小鼠可分为三组：高度易感型，表现为持续性感染，特征为溃疡性病灶不断扩展，如 BALB/c 和 DBA/2、DBA/3 小鼠；相对抗性型，病灶可能在 8 周内自行消退，如 CBA/H、C3H/He 和 A/J 小鼠；以及高度抗性型，在注射部位不出现典型的皮肤利什曼病病灶，如 NZB 和 C57Bl/6 小鼠 4与小鼠皮肤利什曼病模型相比，该疾病在不同常见近交系小鼠品系中的病程表现出显著差异，而 利什曼原虫 物种，金黄地鼠， Mesocricetus auratus 被认为是评估抗药物效果的合适生物模型 利什曼原虫 物种，因为它们易受不同物种感染 利什曼原虫...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本研究得到了安蒂奥基亚大学研究委员会（CODI）、哥伦比亚科学技术发展局－COLCIENCIAS以及热带病防治产品开发中心－CIDEPRO资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| 氯胺酮 | 试剂 | Holliday –Scott S.A | ||
| 赛拉嗪 | 试剂 | Synthesis | ||
| PBS | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 14190-136 | |
| 数显卡尺 | 设备 | Fisher Scientific | 15-077-958 | |
| 吉姆萨染液 | 试剂 | Sigma-Aldrich | GS1L-1L | |
| 福尔马林 | 试剂 | Nova lab | 11273 | |
| 石蜡 | 试剂 | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| 苏木精 | 试剂 | Nova lab | 10870103 | |
| 伊红 | Nova lab | 10870203 | ||
| Kodak Ektachem 干化学分析仪 | 设备 | Kodak Ektachem | DT-60 | |
| 葡甲胺锑 | 试剂 | Aventis | ||
| 显微镜 | 设备 | Nikon Instruments | YS2-T |
参考文献
- WHO. Control of the leishmaniasis. Report of a Meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis WHO. 949, (2010).
- Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunol. 7, 545-555 (1985).
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