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基于蛋白质组学的骨骼肌性别二态性研究

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DOI：

10.3791/3536

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2011年12月14日

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1Center for Proteomics, Smith College, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Chemistry, Smith College, 4Department of Biological Sciences and Center for Proteomics, Smith College

本文内容

摘要

一套直接有效的方法，用于分离并鉴定骨骼肌中表达量最高的蛋白质。从10 mg肌肉组织的二维凝胶上可分辨出约800个蛋白点，从而能够确定性别特异性的蛋白质表达模式。这些方法在大多数组织中均可获得相当的结果。

摘要

骨骼肌的整体收缩主要由数量相对较少的收缩蛋白决定，但该组织对环境因素也具有显著的适应性。1 例如通过抗阻训练导致的肥大和因废用导致的萎缩。因此，它能够对各种应激源（如热、缺血、重金属）表现出重塑和适应性反应。 等等.)2,3肌肉在拉长过程中仍产生力量时可能会受到损伤，这种现象被称为离心收缩4收缩蛋白在这些剧烈活动中可能受损，需要进行修复、降解和/或重新合成；这些功能并非由收缩蛋白自身完成，而是由细胞中其他丰度较低的蛋白质所执行。为了确定参与修复此类损伤的特定蛋白质亚群，必须在运动前建立全局蛋白质组谱5 随后在运动后进行分析，以确定差异表达的蛋白质，从而揭示在损伤适应及其修复过程中的候选蛋白。此外，大多数骨骼肌研究均以雄性个体为对象，因此可能无法代表雌性个体的肌肉特征。

本文介绍一种可重复地从雄性和雌性肌肉组织中提取蛋白质，并通过二维凝胶电泳分离，随后进行高分辨率数字成像的方法6。该方法提供了一套实验流程，用于检测与对照状态相比，出现统计学显著差异（p < 0.05）、表达量变化两倍以上（上调或下调）、或新出现/消失的蛋白斑点（及其后续鉴定的蛋白质）。这些差异斑点被切下后，用胰蛋白酶消化，并通过与质谱仪联用的高效液相色谱（LC/MS）进行分离，以实现蛋白质鉴定（LC/MS/MS）5。该技术方法（图1）适用于多种组织，且基本无需修改即可应用于肝脏、脑、心脏等其他组织（etc.）。

方案

1. 样品制备

  1. 使用小鼠的新鲜组织、速冻组织或经RNAlater处理的组织作为起始材料。用Kimwipe拭去多余的保存液后再进行后续操作。
  2. 去除肌肉周围的所有肌腱和筋膜，并在低温室（4°C）中用单刃剃须刀片在预冷的玻璃板上切碎组织约2分钟，直至组织充分切碎呈粉末状。将样品收集至预先称重的微量离心管中，并测定组织重量。起始材料的用量不得超过10 mg。
  3. 每1 mg切碎的组织加入45 μL提取缓冲液（8 M尿素，50 mM DTT，4% CHAPS，0.2%载体两性电解质5/8，0.0002%溴酚蓝），于室温下进行。若总体积超过350 μL，可先加入350 μL并进行匀浆（步骤1.4），然后加入剩余缓冲液以减少飞溅。
  4. 在4°C下，使用电动研磨杵（Kontes Corp）对组织匀浆7次，每次15秒，每次匀浆之间在冰上冷却2分钟。
  5. 在4°C下以15,600 × g离心30分钟。保留上清液并测量其体积。弃去细胞碎片形成的沉淀。
  6. 用冰浴的试剂级丙酮（体积比3:1）沉淀上清液中的蛋白质。涡旋振荡管子15秒。以15,600 × g离心10秒形成沉淀，然后使用Kontes电动装置和聚丙烯搅拌棒（BioSpec Prod）将沉淀重悬于提取缓冲液中。
  7. 重复步骤1.6。
  8. 可直接进行样品的蛋白质浓度测定，或将其储存于-20°C。

2. 蛋白质浓度估算

使用Lowry法7或BCA法8（Pierce）测定蛋白质浓度；目标浓度约为4.5 mg ml-1。

3. 等电聚焦

  1. 从 -20°C 取出一条 ReadyStrip IPG 胶条（11 cm，pH 5-8，Bio-Rad），在室温下平衡 10–15 分钟。
  2. 涡旋混匀样品，用移液器将 600–800 μg（总体积 200 μL）蛋白样品沿再水化槽通道后缘呈直线加入，两端各留出约 1 cm 空间。
  3. 用镊子剥去 IPG 胶条的塑料保护膜，操作时仅接触胶条两端，避免接触凝胶面。确认胶条的碱性端，并将其置于槽的左侧。将 IPG 胶条胶面朝下覆盖在样品上，避免产生气泡。让其再水化 1 小时。
  4. 加入 2.5 mL 矿物油（BioRad）覆盖。盖上槽盖，于室温下过夜再水化。
  5. 在等电聚焦槽通道的两端各放置一根滤纸条，并用 10 μL Millipore 水润湿每根滤纸条。
  6. 取出 IPG 胶条，垂直持握约 10 秒以沥去矿物油。用 Kimwipe 纸轻轻吸去塑料背衬上的油。
  7. 将 IPG 胶条胶面朝下、碱性端朝左放入等电聚焦槽中，再覆盖 2.5 mL 矿物油。
  8. 将槽放入 PROTEAN IEF 电泳仪（Bio-Rad）中，设置三步程序（表 1），默认电泳槽温度为 20°C，最大电流为 50 μA/胶条，无再水化时间。
     电压时间伏特-小时升压模式
    步骤 125020 分钟 线性
    步骤 28,0002.5 小时 线性
    步骤 38,000 40,000快速
    总计 6.5 小时40,000 


    表 1. PROTEAN IEF 电泳仪用于 11 cm IPG 胶条的三步程序。
  9. 用镊子将 IPG 胶条从 IEF 电泳仪中取出。用 Kimwipe 纸吸去塑料背衬上的油，将 IPG 胶条胶面朝上放入洁净的再水化槽中。可盖上槽盖并用保鲜膜包裹，于 -80°C 保存或直接进行后续操作。

4. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

  1. 将胶条（凝胶面朝上）转移至一个11 cm的平衡托盘中。
  2. 向槽中加入4 mL还原缓冲液（6 M 尿素，2% SDS，0.05 M Tris/HCl pH 8.8，20%甘油，2% DTT），在轻度振荡条件下平衡10分钟。
  3. 移除还原缓冲液，加入4 mL烷基化缓冲液（6 M 尿素，2% SDS，0.05 M Tris/HCl pH 8.8，20%甘油，2.5%碘乙酰胺），在轻度振荡条件下继续平衡10分钟。
  4. 将IPG胶条在1× SDS电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.2）中短暂浸洗一次。
  5. 将胶条（凝胶面朝上）放置于11 cm Criterion预制10.5%-14% Tris-HCl SDS聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Rad）的背板上，轻轻推入使其与SDS凝胶完全贴合；确保两层凝胶之间无气泡残留。
  6. 在IPG胶条上覆盖1 mL熔化的琼脂糖溶液（0.5%琼脂糖，25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS，溴酚蓝），静置5分钟使琼脂糖凝固。
  7. 在单一加样孔中加入5 μL蛋白分子量标记物（10-225 kDa，USB，货号：76740），作为分子量标准。
  8. 在SDS缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.2）中，以200 V电压在室温或低温环境（4°C）下进行电泳，以溴酚蓝染料前沿的迁移情况监测电泳进程。
  9. 从塑料模具中取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液（45.5%甲醇，45.5%去离子水，9.0%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250）中，在轻度振荡条件下染色过夜。
  10. 将凝胶在脱色液1（45.5%甲醇，45.5%去离子水2O，9.0%乙酸）中振荡脱色两次，每次3小时，随后在脱色液2（5%甲醇，90%去离子水2O，5%乙酸）中脱色过夜。最后将凝胶保存于7%乙酸溶液中以备分析。

5. 凝胶成像与分析

  1. 使用操作 VersaDoc 成像系统（BioRad）的 Quantity One 软件程序拍摄凝胶图像。对实验中所有凝胶的图像区域进行统一裁剪。
  2. 将裁剪后的图像载入 PDQuest 8.0 软件程序以创建实验集。按照实验设置向导定义凝胶间蛋白点检测与匹配的参数。如有需要，手动检查并优化蛋白点匹配结果。
  3. 对凝胶进行定量和统计分析，筛选出在两组凝胶之间表达差异达到两倍或以上且具有统计学显著性的匹配蛋白点。将这些感兴趣的蛋白点创建为分析集，并使用 EXQuest 蛋白点切割仪（BioRad）切取，用于胰蛋白酶消化及基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质鉴定。

6. 胶内胰蛋白酶消化

此步骤采用改良的 Pierce 胶内胰蛋白酶消化试剂盒（#89871X，Pierce）操作方案。

  1. 向凝胶块中加入 200 μL 脱色液（25 mM 碳酸氢铵，50% 乙腈）。涡旋混匀，并在 37°C 下振荡孵育 30 分钟。小心移除并弃去溶液。
  2. 重复步骤 6.1。
  3. 向含有凝胶块的离心管中加入 30 μL 新鲜配制的还原缓冲液（50 mM 三(2-羧乙基)膦，22.5 mM 碳酸氢铵），并在 60°C 下孵育 10 分钟。
  4. 让样品冷却；然后移除并弃去还原缓冲液。
  5. 向离心管中加入 30 μL 烷基化缓冲液（100 mM 碘乙酰胺，20 mM 碳酸氢铵，使用前立即在锡箔包裹的离心管中配制），并将样品在室温下避光孵育 1 小时。
  6. 移除并弃去烷基化缓冲液。通过向每管中加入 200 μL 脱色液清洗凝胶块，并在 37°C 下孵育 15 分钟。
  7. 移除并弃去脱色液，并重复清洗一次。
  8. 向凝胶块中加入 50 μL 乙腈，并在室温下孵育 10 分钟使其收缩干燥，然后小心移除乙腈。
  9. 再重复一次步骤 6.8。凝胶碎片应呈现白色且体积较小。
  10. 将凝胶碎片置于 Centrivap 浓缩仪（Labconco，型号 EX1245）中干燥 10 分钟。
  11. 加入 10 μL 活化的胰蛋白酶溶液（10 ng/μL 胰蛋白酶，25 mM 碳酸氢铵）使凝胶碎片溶胀。在室温下孵育 15 分钟。
  12. 向离心管中加入 25 μL 消化缓冲液（25 mM 碳酸氢铵）。在室温下振荡孵育过夜。
  13. 对样品进行超声处理 10 分钟（Branson，浴式超声仪型号 2510），然后离心，将上清液转移至新的离心管中保存。
  14. 为进一步提取肽段，加入 10 μL 0.1% 甲酸，在室温下振荡孵育 5 分钟。超声处理 10 分钟，收集上清液并与步骤 6.13 中保存的上清液合并。

7. 肽提取物的微尺度脱盐

  1. 根据制造商说明，使用 PepClean C-18 离心柱（ThermoFisher）去除肽提取物中的碳酸氢铵及其他盐类。
  2. 用 20 μL 70% 乙腈溶液分两次洗脱肽段，将样品在 Centrivap 浓缩仪中离心蒸发干燥 1 小时，然后将肽段重悬于 10 μL 0.1% 甲酸溶液中，用于质谱分析。

8. 通过高效液相色谱-质谱联用鉴定蛋白质

  1. 使用Pepswift整体式PS-DVB柱（Dionex），在高效液相色谱仪（HPLC）上以每分钟400 nL的流速，采用含0.2%甲酸的乙腈线性梯度（2–50%）在40分钟内分离5 μL肽段混合物，并通过Nanospray I源连接至离子阱质谱仪（LCQ Deca XP Max，Thermo Fisher Scientific）进行检测。
  2. 在m/z 400–1400范围内检测肽段的MS1信号，并选择强度最高的3个离子峰进行CID碎裂的MS2测序，同时启用动态排除功能。
  3. 进行蛋白质鉴定时，通过Sequest小鼠参考数据库搜索（BioWorks软件，Thermo-Fisher Scientific）分析肽段结果，固定修饰为烷基化半胱氨酸，动态修饰包括磷酸化（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）、甲基化（组氨酸）、氧化（甲硫氨酸）、ADP-核糖基化（精氨酸）以及N端乙酰化。采用保守的匹配标准（例如，肽段质量容差设为2 AMU，碎片容差为1.00，蛋白质需至少包含2个通过Xcorr与电荷状态过滤器的肽段 [z=1/x=1.5, z=2/x=2.00, z=3/x=2.50, z=4/x=3.00]，且概率p < 0.05）5，并对质谱图进行人工检查以确保蛋白质鉴定的可靠性。

9. 代表性结果：

提取并分离了未运动的雄性和雌性小鼠骨骼肌（肱二头肌），获得二维图谱5，作为肌肉比较蛋白质组的第一层级（图2）。通过高分辨率数字成像可视化后，每张图谱中可检测到约800个蛋白质点。以雄性蛋白质组图谱为基准，明显可见雌性蛋白质组图谱中有多个蛋白质点的丰度发生变化。蛋白质点的强度反映了蛋白质含量的变化（图3）。对变化超过两倍（上调或下调）、在统计学上显著（p < 0.05，n=5只小鼠）的蛋白质点，采用液相色谱联用质谱技术进行氨基酸序列分析以确定其身份。结果表明，雌性小鼠在糖类能量代谢酶以及肌酸激酶（CK）同工酶的丰度上有所下降，提示其肌肉中存在不同的能量供应系统。人类和动物在静息状态及运动后均表现出雄性血清CK水平更高9,10，但血清CK水平并不一定与肌原纤维损伤程度相关11,12。本研究发现小鼠肱二头肌中CK在细胞内丰度存在性别二态性5，这一新发现可能解释了生理状态下血清CK水平的性别差异。

图：

figure-protocol-1
图1. 比较蛋白质组学实验流程的总体示意图。该流程分为三个部分：样品制备、样品分析和蛋白质鉴定。这三个部分的末尾均可作为合理的暂停节点，但若能连续完成整个流程，则可获得最佳结果。

figure-protocol-2
图2. 雌性小鼠肱二头肌蛋白质点与雄性肱二头肌中相同蛋白质点的比较（绿色圆圈 o）。在雌性中增加≥2倍的蛋白质点以红色圆圈标出（o），减少≤2倍的则以蓝色圆圈标出（o）。

figure-protocol-3
图3. 凝胶斑点强度分析：X轴，女性运动前（对照组，n=5）；Y轴，女性单次运动后0小时时间点组（n=5）。回归线：相关系数 = 0.919；斜率 = 0.976；截距 = -0.0293。位于红线以上和蓝线以下的斑点变化超过±两倍。

讨论

本文介绍的液相色谱-质谱（LC/MS）蛋白质组学方法是一种快速分析骨骼肌蛋白质组第一层次的高可靠性、可重复的实验方案。该方法可较为高效地比较性别特异性差异。对于丰度较低的蛋白质，需对肌肉样品进行分级分离，尽可能去除收缩蛋白，从而提高低丰度蛋白质的检测水平。如需要，可通过使用不同pH范围的IPG胶条和不同浓度梯度的凝胶来定制蛋白质组分析谱型。目前已有更灵敏的荧光染色方法，但我们建议各实验室在自身系统中验证这些染料的线性响应范围。若需对蛋白质表达进行更严格的分析，可采用DIGE系统（双向凝胶电泳系统，GE Healthcare Life Sciences），但该方法会增加实验技术的复杂性。此外，本文所述方案可用于大多数已完成基因组测序的动物组织，也可用于任何来源蛋白质的从头测序（de novo sequencing），前提是该蛋白质能够在二维凝胶上实现分离，因为除胰蛋白酶外，还可使用高纯度的其他酶产生重叠的酶解片段。来自其他组织来源的样品可能需要对提取方法进行一定调整，尤其是在检测膜蛋白和疏水性蛋白质时；然而，我们已成功将本方案应用于心脏、肝脏、肾脏和脑组织。其他翻译后修饰可通过调整质谱数据库搜索参数进行检测。总之，我们提供了一个较为详尽的蛋白质组谱型分析的初始实验方案。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

感谢甘宇田提供图3的使用权。本研究得到了美国国家科学基金会（0420971）、史密斯学院Blakeslee、Wilens和Holmes基金以及霍华德·休斯医学研究所的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PepClean C-18 离心柱耗材Thermo Fisher Scientific, Inc.PI-89870
Pepswift 整体柱（100 μm × 5 cm）耗材Dionex162348
Criterion 预制 10.5%–14% Tris-HCl SDS 聚丙烯酰胺凝胶耗材Bio-Rad345-0106
Readystrip IPG 胶条耗材Bio-Rad不同 pH 范围
乙酸试剂Fisher ScientificA465-1
丙酮试剂Pharmco Products, Inc.329000
乙腈试剂Fisher ScientificA955
琼脂糖试剂Bio-Rad163-2111覆盖
溶液
碳酸氢铵试剂Fluka40867
溴酚蓝试剂Fisher ScientificBP114
Bio-Lyte 两性电解质试剂Bio-Rad不同 pH
范围
CHAPS试剂USB Corp., Affymetrix13361
考马斯亮蓝 R-250试剂Thermo Fisher Scientific, Inc.20278
二硫苏糖醇（DTT）试剂USB Corp., Affymetrix15395
甲酸试剂Thermo Fisher Scientific, Inc.28905
甘油试剂Sigma-AldrichG6279
甘氨酸试剂USB Corp., Affymetrix16407
碘乙酰胺试剂Sigma-AldrichI6125
甲醇试剂Fisher ScientificA452
矿物油试剂Bio-Rad163-2129
十二烷基硫酸钠试剂Sigma-AldrichL6026
Tris 碱试剂Sigma-Aldrich93349
三(2-羧乙基)膦（Tris[2-carb–xyethyl] phosphine）试剂Thermo Fisher Scientific, Inc.77720
胰蛋白酶内肽酶，TPCK 处理，质谱级试剂Pierce, Thermo Scientific90055修饰型
尿素试剂USB Corp., Affymetrix75826
水试剂Burdick & Jackson365
Centrivap 浓缩仪仪器Labconco Corp.
Exquest 胶点切割仪仪器Bio-Rad
LCQ Deca XP Max 离子阱质谱仪仪器Thermo Fisher Scientific, Inc.
电动研钵仪器Kontes Corp
聚丙烯搅拌棒仪器Biospec Products
搅拌棒
PROTEAN IEF 电泳仪仪器Bio-Rad
超声破碎仪仪器Branson
Surveyor Plus 高效液相色谱系统仪器Thermo Fisher Scientific, Inc.
VersaDoc 成像系统仪器Bio-Rad

参考文献

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