我们介绍一种高通量流式细胞术检测方法，用于测定临床样本中抗原特异性抗体的吞噬活性。该方法利用荧光标记的抗原包被微球，以及表达多种Fc受体的单核细胞系，能够以标准化且可重复的方式，针对任何目标抗原同时测定抗体的受体使用情况和吞噬活性。
本文内容
摘要
摘要
抗体驱动的吞噬作用通过与专职吞噬细胞上的Fc受体结合而诱导产生，可在疾病清除过程中发挥作用，同时也可能参与疾病病理过程。尽管长期以来抗体可变区的特性被认为对其体内功能至关重要，但人们日益认识到，抗体通过其Fc区募集天然免疫细胞的能力，是决定其疗效的关键因素之一，无论是在重组单克隆抗体治疗中，还是在自然感染或疫苗接种过程中均如此1-3。
重要的是，尽管抗体 Fc 区在命名上被称为恒定区，但其功能并非恒定不变，而是受到 IgG 亚类（IgG1-4）以及天冬酰胺 297 位糖基化的强烈调控4-6。因此，该用于研究临床样本中抗原特异性抗体功能差异的方法，将有助于将抗体的吞噬潜能与疾病状态、感染易感性、疾病进展或临床结局进行关联分析。
此外，鉴于抗体可通过Fc受体介导的吞噬作用促进病原体进入宿主细胞从而增强感染，这种效应功能显得尤为重要7。另外，有证据表明免疫复合物的吞噬摄取可能影响免疫应答的Th1/Th2极化8。
本文介绍了一种用于高通量检测抗体诱导吞噬作用差异的实验方法，这些差异可能由IgG亚类的不同、Asn297位点的糖链结构差异，以及抗原特异性抗体形成免疫复合物的能力不同所引起。具体而言，将1 μm的荧光微球包被抗原后，与临床抗体样本共同孵育，从而生成荧光标记的抗原特异性免疫复合物。随后，将这些抗体调理的微球与表达多种Fcγ受体（包括抑制性和激活性受体）的单核细胞系共同孵育。该实验可检测的指标包括吞噬活性、细胞因子分泌以及Fcγ受体的使用模式，且所有指标均以标准化方式测定，因此该系统在解析感染及疫苗介导保护中抗体依赖性效应功能差异方面具有重要应用价值9。
方案
1. 培养吞噬细胞
- 在T型培养瓶中，使用添加10%胎牛血清的RPMI 1640培养基悬浮培养THP-1细胞10。细胞密度应维持在0.5×106/mL以下，以保持FcγR表达水平及检测性能的一致性。
2. 准备生物素化抗原
- 根据制造商说明书，计算标记目标抗原所需的磺基-NHS-LC-生物素试剂盒的用量。
- 将生物素化试剂溶解于水中，并立即加入至不含伯胺的缓冲液中的抗原内。室温下反应1小时，期间偶尔混匀。
- 使用适当截留分子量的Amicon离心浓缩装置通过缓冲液置换去除未结合的游离生物素。将样品加入浓缩装置的上层室，并加入PBS使总体积达到15 mL刻度线。在4000 × g离心至体积约1.5 mL。重复此步骤两次，可去除99%的游离生物素，确保抗原在磁珠上的最大包被效率。
3. 准备抗原饱和微珠
- 在微型离心机中高速离心后，用 1 ml 0.1% PBS-BSA 将 100 μl 1 mm 荧光中性亲和素磁珠洗涤两次。将洗涤后的磁珠重悬于 100 μl PBS-BSA 中，并分装至 10 个管中。
- 为确定使磁珠饱和的抗原包被条件，将 10 μl 洗涤后的磁珠悬液与不同浓度的生物素化抗原混合，抗原浓度按两倍梯度递增。在微型离心管中，4°C 条件下于旋转仪上孵育过夜。
注意：必须通过实验确定磁珠的饱和度。可通过确定磁珠包被条件，使磁珠随后用对照单克隆抗体进行调理后能够产生最大吞噬作用，从而实现这一目标。
- 用 1 mL PBS-BSA 洗涤以去除未结合的抗原，高速离心至珠粒沉淀。弃去 PBS-BSA，重复此步骤。
- 将包被抗原的珠粒在 1 mL PBS-BSA 中重悬至最终体积。珠粒可在 4°C 下保存长达一周，之后即可使用。
4. 准备抗体样品
- 可根据制造商说明书，使用Melon凝胶IgG纯化试剂盒从血浆中纯化临床抗体样品。纯化的IgG可在4°C下保存，直至使用。
注意：处理人类样本时必须始终采取适当的预防措施。
- 通过 A280 吸光度测定纯化抗体的浓度，并用 PBS 将样品稀释至 1 mg/ml。
- 用 PBS 将阳性与阴性单克隆对照抗体稀释至 1 mg/ml，进行配制。
5. 实验铺板
- 通过涡旋振荡重新悬浮上述制备的经洗涤且抗原饱和的磁珠溶液，并将10 μl转移至圆底96孔板的每个孔中。必须持续搅动磁珠悬液，以确保向每孔加入等量的荧光磁珠。
- 向各孔中加入不同浓度的目标抗体，为每种抗体建立剂量-反应曲线。最佳浓度因样本而异，取决于抗体滴度，但最终浓度范围在0.01–100 μg/ml之间通常可提供良好的覆盖范围，并有助于确定目标浓度区间。确保抗体加入体积不超过20 μl。
- 在37°C下孵育磁珠与抗体样本2小时，使抗体对磁珠进行调理（opsonization）。
- 将THP-1细胞配制成2.5 x 105 个细胞/ml的悬液，每孔加入200 μl，使每孔最终含有5 x 104 个THP-1细胞。
- 在37°C、5% CO2条件下，在静置培养箱中过夜孵育，使细胞和磁珠通过重力沉降至孔底。
注意：通过确定特定抗原和抗体来源的最佳磁珠：抗体：THP-1 细胞比例，可提高信噪比。
6. 流式细胞术分析
- 小心地从每个孔中移除 100 μl 上清液，注意不要扰动细胞沉淀。如果需要进行细胞因子分泌测定或其他分析，可保存上清液。
- 固定时，向每孔加入 100 μl 4% 多聚甲醛，并用移液器吹打重悬并混匀细胞。
- 可使用配备高通量筛选（HTS）板读取器的 BD LSR II 进行高通量流式细胞术分析。
- 设置软件程序，使每孔混匀三次（混匀体积为 100 μl），并分析每份样品 30 μl 或至少 2000 个细胞事件。
- 采集的数据可在 FlowJo 或类似软件中进行分析。有用的分析参数包括 bead+ 细胞（即荧光阳性细胞）的百分比，用于反映吞噬细胞的数量；以及吞噬细胞的荧光强度，用于反映被吞噬微球的数量。将这两个数值相乘可得到整合平均荧光强度（iMFI）。
- 每个吞噬细胞平均吞噬的微球数量可通过将 iMFI 除以单个微球的平均荧光强度来计算。
7. 代表性结果
应能明确区分来自受感染和未受感染个体的抗体样本。图1A展示了来自一名HIV阴性（黑色曲线）和一名HIV阳性（灰色曲线）个体的抗体样本的流式细胞术直方图，显示了抗原特异性抗体存在时吞噬作用的增强。
该检测方法的最佳灵敏度依赖于包被珠上生物素化抗原达到饱和。图1B展示了使用不同抗原量包被的珠子经3种对照单克隆抗体（包括一种非结合抗体，三角形）调理后所观察到的吞噬作用，结果确定2μg抗原/μl珠子为此抗原的饱和浓度。
剂量-反应曲线如图2所示，展示了受试者抗体样本在0.05-5 μg/ml抗体浓度范围内诱导吞噬作用的差异能力。这种吞噬作用的差异可能由抗体滴度或Fc区特性（如IgG亚类和糖基化状态）的差异所驱动。
当使用荧光显微镜观察THP-1细胞时，可清晰观察到微珠被吞噬的现象。图3展示了THP-1细胞与抗体调理（绿色）和非调理（红色）微珠孵育后的两张63倍静态图像，显示在无抗体存在时吞噬作用几乎不发生。当进行延时显微成像时，抗体特异性的荧光微珠吞噬现象更为显著（影片1，20倍放大）。
先前的研究已证实与细胞相关的微珠内化现象，且使用原代单核细胞进行的实验与此高通量检测中的吞噬评分（iMFI 值）结果高度一致（数据未显示）。
图1。
检测质量控制。1A，HIV阴性受试者（黑线）与HIV阳性受试者（灰线）抗体样本的吞噬作用流式细胞术直方图。1B：针对某一抗原样本，实验确定最佳微球包被条件。抗原特异性单克隆抗体（圆圈、方块）在包被有该抗原的微球中表现出最大吞噬作用 >2 μg 抗原μl 珠子的吞噬活性，而对照抗体（三角形）显示无吞噬活性。
图 2.
吞噬作用剂量-反应曲线。来自HIV阳性（经治疗、未治疗以及在无抗逆转录病毒治疗情况下仍能控制病毒复制）和HIV阴性个体的临床抗体样本，对gp120（HIV包膜蛋白）包被的微球诱导的吞噬作用表现出差异性。
图3.
高效内化。显微镜观察证实抗体调理的微珠（绿色）已被细胞内化，而非调理微珠则仍存在于溶液中（63倍放大）。
视频 1. 对抗体介导的吞噬作用进行了为期 14 小时的延时显微镜观察，可直观展示在高通量检测中所用 THP-1 细胞的吞噬活性。绿色荧光微球经抗体调理，红色荧光微球作为阴性对照。点击此处观看视频。
讨论
本文所述检测方法利用一种长期用于研究吞噬作用的单核细胞系10以及基于微孔板的自动化流式细胞术，可实现对临床抗体样本吞噬活性的高通量分析。该方法相较于其他方法的优势在于能够精确表征抗原特异性的抗体亚群，不仅可用于研究不同个体来源的疾病特异性抗体所驱动的吞噬作用差异，还可用于分析同一受试者体内针对多种抗原的特异性反应。由于抗体可募集单核细胞及其他抗原呈递细胞等天然免疫效应细胞，从而显著影响疾病结局11-13，而这种募集作用在生物学上受抗体构象、IgG亚类以及Fc区天冬酰胺297位点的糖基化状态等因素影响而存在差异14-16，因此本方法可用于评估抗体关键作用机制的功能。此外，由于某些病原体在感染过程中会利用抗体介导的吞噬作用以促进自身感染7,17,18，该检测方法在评估抗体依赖性增强效应（antibody-dependent enhancement）方面具有重要应用前景，并突出了吞噬作用作为抗体功能的双重性——既可能具有保护作用，也可能带来不利影响。
所述检测方法可用于分析患者群体临床样本中的抗体，也可用于疫苗接种者的样本，并可进行调整以使用血清而非纯化的IgG。此外，可通过培养上清液分析吞噬作用诱导的细胞因子分泌情况，并利用FcR阻断抗体确定特定FcR的影响，从而不仅能够评估吞噬活性的差异，还能分析下游信号事件，深入揭示其作用机制，有助于阐明和深化对这一免疫机制的理解。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者希望感谢以下资助：NIH 3R01AI080289-02S1，以及美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）2P30AI060354-07 项目支持的哈佛大学艾滋病研究中心学者奖学金。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EZ-Link Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21935 | |
| Amicon Ultra-15 离心过滤器单元，配备 Ultracel-50 膜 | EMD Millipore | UFC905024 | 过滤单元的规格可根据抗原大小进行调整 |
| FluoSpheres NeutrAvidin 标记微球，1.0 μm，黄绿色荧光（505/515） | Invitrogen | F-8776 | 制造商提供多种颜色的该产品 |
| Melon Gel IgG 纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 45212 | 应通过 SDS-PAGE 对抗体样品的纯度进行验证 |
参考文献
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