本文介绍了一种利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）巨大纤维系统（GFS）快速检测神经调制化合物的活体in vivo实验方法。通过对果蝇头部进行纳米注射，并结合GFS的电生理记录，可揭示化合物对神经元或肌肉的生物活性。
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本文内容
摘要
摘要
筛选化合物的体内活性可作为识别潜在药理学候选分子的第一步1,2。我们开发了一种新型的纳米注射/电生理检测方法，可用于检测化合物对介导黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）逃避反应的神经回路功能所产生的生物活性调节作用3,4。本体内检测方法利用果蝇巨纤维系统（GFS，图1），可筛选多种类型的化合物（如小分子或肽类），且仅需极微量即可诱发效应。此外，果蝇GFS在神经元或肌肉上提供了多种潜在的分子靶点。巨纤维（GF）通过电突触（缝隙连接）和化学突触（胆碱能）分别与外周接替中间神经元（PSI）以及胸-转节肌神经元（TTMn）形成突触连接5。PSI与背纵肌神经元（DLMn）之间的连接依赖于Dα7烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）6。最后，TTMn和DLMn分别与跳跃肌（TTM）和飞行肌（DLM）形成的神经肌肉接头（NMJ）为谷氨酸能突触7-12。本文中，我们演示了如何在向果蝇注射纳升级化合物的同时，对其巨纤维系统进行细胞内电生理记录，并监测该化合物对该神经回路功能的影响13。我们以烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂柠檬酸甲基藜芦碱（MLA）为例，展示了该检测方法的特异性：MLA可破坏PSI至DLMn的连接，但不影响GF至TTMn的连接，也不影响跳跃肌或飞行肌神经肌肉接头的功能。
在开始本视频之前，您必须仔细观看并熟悉 JoVE 视频《从巨大纤维通路进行的电生理记录》 D. melanogaster 来自 Augustin 等7，因为此处展示的视频旨在扩展这一现有技术。本文采用电生理记录方法，并仅详细聚焦于成对纳米注射与监测技术的添加步骤。
方案
1. 电生理实验装置设置
- 电生理实验装置所需的设备已在本期刊 Augustin et al. 的文章中有详细描述14。有关所需电生理仪器的详细说明，请参考该文章。
- 在先前描述的电生理实验装置14基础上进行改进，增加第六个显微操作器用于固定纳米注射仪。为便于接近动物头部，应将其放置在两个刺激电极显微操作器之间，如图2所示。
- 实验开始前，需确保所有显微操作器在各个旋转轴向上均具有足够的操作空间，并且所有电极以及注射用微移液管（见步骤2）均可顺利到达动物体位。
2. 纳米注射装置设置
- 纳米注射装置需要配备 Nanoliter2000（World Precision Instruments，美国佛罗里达州萨拉索塔）或类似类型的注射仪，以实现对纳升级体积的精确控制注射。
- 使用注射仪配套提供的玻璃毛细管，通过电极拉制仪将其拉制成电阻为 80–100 MΩ 的注射针。
- 为实现平稳注射，需将毛细管针尖修磨成 45 度角，开口直径为 11–17 μm（图 3）。
- 按照 Nanoliter2000 手册说明，使用 Hamilton 注射器缓慢将合成油从针尾注入毛细管，确保无气泡....
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讨论
本文所介绍的纳米注射/电生理学生物测定方法可实现对果蝇神经系统中化合物的快速筛选。这是一种新颖的方法 体内 一种仅需少量化合物即可在特征明确的神经环路中对多种分子靶点产生效应的技术。该方法可用于检测不同化合物的生物活性，范围涵盖未知毒素到市售药理学试剂。
在此，我们利用甲基烟碱（MLA）验证了本检测方法的功能，结果显示其对果蝇的巨纤维系统（GFS）产生了影响（图5）。我们发现，MLA选择性地破坏了巨纤维（GF）到背纵肌（DLM）的信号通路，但并未影响GF到胸段胫肌（TTM）的通路。通过胸部刺激直接激活运动神经元的结果表明，GF到DLM通路的缺陷并非源于神经肌肉接头（NMJ）的功能障碍，而是与MLA在PSI-DLMn突触处作用于Dα7烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）亚型所产生的拮抗效应一致（图1）。尽管已证实GF到TTMn的连接为胆碱能性，但目前尚不清楚该突触是否表达Dα7 nAChR亚单位。此外，由于存在电突触，即使缺失胆碱乙酰转移酶（Cha）基因或Dα7 nAChR亚型（Dα7）基因，也不会破.......
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致谢
我们感谢Mari实验室和Godenschwege实验室的成员，特别是Aline Yonezawa，对本实验方案提出的建议和帮助。本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所资助，资助号为R21NS06637，授予F.M.和T.A.G.；A.B.的研究由美国国家科学基金会资助，资助编号为082925，项目名称为“为未来研究人员设立的URM：整合生物学”。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 记录玻璃电极：硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | 1.0 mm 外径，0.58 mm 内径 |
| 刺激器 | 草技术公司 | Model S48 | |
| 放大器 | Getting Instruments, Inc. | 5A 型模型 | |
| 数据采集软件：Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| 数据采集软件：pCLAMP | Molecular Devices | 版本 10 | |
| 体视显微镜配光纤显微镜环形照明器 | AmScope | SM-4T 型号 HL250-AR | |
| 用于安装的解剖显微镜 | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite 手动显微操作仪 &和倾斜底座 | World Precision Instruments, Inc. | 型号 # M3301 风筝：型号 # KITE-M3-L | |
| 黑腹果蝇 野生型10E基因型（野生型菌株） | 布卢明顿果蝇资源中心 | 品系编号 3892 | |
| 垂直式移液器拉制仪 | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| 注射玻璃微量移液管：硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments, Inc. | 目录编号 # 4878 | 1.14 mm 外径，0.5 mm 内径 |
| 硅油 | Fisher Scientific | 目录编号 S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. 棕色类型 型号 # BV-10 | |
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments, Inc. | 目录号 B203XVY | |
| 蓝色食用色素 | McCormick & Co. | N/A | 成分：水、丙二醇、FD&C 蓝 1 和 0.1% 对羟基苯甲酸丙酯（防腐剂）。 |
| 柠檬酸甲基牛扁碱 (MLA) | Tocris Bioscience | 目录编号 1029 | |
| 塑料蜡棒 | Hygenic Corporation（美国俄亥俄州阿克伦） |
参考文献
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11
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