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用于生物材料高通量发现的聚合物微阵列

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DOI：

10.3791/3636

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2012年1月25日

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1Laboratory of Biophysics and Surface Analysis, University of Nottingham , 2School of Molecular Medical Sciences, University of Nottingham , 3David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

本文内容

摘要

介绍一种采用芯片内光聚合技术制备聚合物微阵列的方法。同时描述了利用原子力显微镜、水接触角测量、X射线光电子能谱、飞行时间二次离子质谱以及细胞黏附实验对表面进行高通量表征的过程。

摘要

利用聚合物微阵列可快速发现并优化适用于特定生物应用的新型生物材料，该方法能够以平行、高通量的方式筛选材料的组合文库1。本文描述了采用芯片内光聚合技术制备和表征聚合物微阵列的方法2。该方法包括将单体以不同比例混合，制备一系列单体溶液，使用机器人点样装置将溶液转移至玻片上，并通过紫外光照射进行固化。该平台适用于多种生物学检测，如干细胞黏附与增殖、细胞分选及低细菌黏附性检测，从而快速识别出满足特定生物学标准的“命中”材料3-5。此外，结合高通量表面表征技术（HTSC），可将材料的生物学性能与其理化性质相关联，进而阐明生物体-材料之间的相互作用机制6。HTSC 技术包括水接触角（WCA）测量、原子力显微镜（AFM）、X射线光电子能谱（XPS）以及飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）。其中，ToF-SIMS 可对样品提供丰富的化学信息分析，用于将细胞响应与特定分子基团相关联。在某些情况下，可通过 ToF-SIMS 谱图预测材料的生物学性能，揭示生物-材料相互作用的化学依赖性，从而指导“命中”材料的进一步优化与开发5,3。

方案

1. 低污染背景的制备

  1. 称取2 g聚（甲基丙烯酸羟乙酯）(pHEMA)（Sigma，细胞培养测试级）至50 mL离心管中，溶于50 mL体积分数95%的乙醇水溶液中。通常需要超声处理24小时以完全溶解。
  2. 将环氧功能化玻片（Genetix）浸入pHEMA溶液中进行浸涂。环氧基团将迅速与pHEMA涂层形成共价键。浸涂操作时，用镊子夹住玻片并将其浸入溶液中。通常保留约5 mm区域不涂覆，便于后续玻片方向定位，同时该未涂层区域可作为细胞黏附的阳性对照。将玻片以约1秒的时间匀速从pHEMA溶液中提起，倒置后在接近水平的位置静置干燥10分钟，然后放入玻片架中。
  3. pHEMA包被的玻片在常温大气条件下放置1周，以确保溶剂完全挥发。

2. 单体溶液的制备

  1. 称取120 mg光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮，加入3 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，配制成4%（w/v）的光引发剂溶液。建议每次打印前新鲜配制，因此可根据所需光引发剂溶液的量调整称样质量和溶液体积。该溶液在一个月内稳定。
  2. 单体溶液通过将1份光引发剂溶液与3份纯单体混合制得。具体操作为：用移液器将5 μL光引发剂溶液和15 μL单体加入384孔源板中。20 μL的总体积最适合形成液滴。若体积更大，则需在生成均匀液滴前额外进行吸除；体积过小可能导致针头加载不完全。
  3. 目前该方法仅限于可溶于DMF的丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯类单体，因为尚未探索其他组合；但丙烯酰胺类及其他溶剂也可能适用于该打印工艺。为达到建议的单体浓度（75% w/w），需使用液态单体，尽管固态单体可采用较低浓度（降低单体浓度似乎不会对所得聚合物的表面化学性质产生不利影响，但可能会影响其分子量和玻璃化转变温度）。高挥发性单体也难以使用，因为在紫外光固化前聚合过程中单体会迅速蒸发。根据单体溶液的数量，一次运行最长可达6小时，而在运行后期，挥发性单体可能已从源板中蒸发。可通过冷却打印平台并仅进行短时间打印来使用挥发性单体。
  4. 除少数高度亲水性单体（如聚乙二醇丙烯酸酯）外，未观察到所得聚合物斑点在水性缓冲液中溶解，因此无需使用交联单体，但也不排除其使用。

3. 聚合物微阵列的制备

聚合物微阵列形成的典型步骤如图1所示。

  1. 使用接触式机器人（Biodot）配合XYZ平台（图2）实现微阵列的形成。采用直径为220 μm的槽针（Arrayit 96B）。所有针头在打印运行前应使用二氯甲烷超声清洗10分钟，针头架也应进行同样清洗。
  2. 将针头装入针架，装载吸水垫和阵列玻片，然后将整个腔室充满氩气，使氧气浓度降至2000 ppm以下，该浓度足够低，可避免氧气淬灭聚合反应中的自由基。湿度维持在30–40%之间。保持一定湿度可使pHEMA溶胀，从而使形成的聚合物穿透pHEMA层并物理性地包埋于表面2。
  3. 开始打印运行。每次运行包括以下步骤：
    • 从源板加载样品。针头以25 mm/s的速度下降至溶液中，在溶液中停留2.5 s，然后以25 mm/s的速度抽出（图2）。
    • 打印前必须对针头进行吸水处理，以去除针头外表面的单体溶液。随后单体从针头的毛细部分释放，以实现一致的点样形态。所用吸水程序包括与洁净玻璃片接触33次：前四个位置分别接触10、5、4和3次，接下来的四个位置各接触2次，最后三个位置各接触1次。每次接触时间为10 ms，接近和撤离速度为175 mm/s。至此形成的点样应具有均匀的形状和几何特征。若未能达到此效果，表明针头不洁净或单体溶液中存在灰尘污染。
    • 将单体溶液打印到pHEMA包被的玻片上（图2）。每个点样仅接触一次，针头移动速度为175 mm/s，接触时间为10 ms，根据单体溶液的黏度和表面能不同，可形成平均直径为400 μm的点样。通常每张玻片上打印3个重复阵列，单次运行共打印10张玻片，相当于每轮生成30个点样。
    • 针头在DMF中清洗。整个清洗过程提供2.5 L新鲜DMF。针头在流动浴中伴随振荡进行清洗。
    • 在清洗的同时，新打印的玻片使用短波紫外光（365 nm）照射，照射强度为30 mV/cm2，持续时间为30 s的清洗期。
  4. 所有单体溶液打印完成后，阵列再接受紫外光（365 nm）照射10分钟。
  5. 新打印的阵列在低压（<50 mTorr）条件下保存1周，以去除未聚合的单体和溶剂。

4. 高通量表面表征（HTSC）

高温超导技术的通用示意图如图3所示。自动化高通量方法的核心在于将聚合物微阵列与表征装置进行对准。在所有情况下，此对准均通过提供阵列顶部视图的相机来实现。首先，旋转阵列以使其与载物台的X-Y移动方向对齐。然后定位阵列的一个角落点，并指定其具体坐标。随后即可根据阵列的尺寸预测每个聚合物点的位置。

  1. 水接触角（WCA）测量
    1. 使用自动化的Krüss DSA 100仪器，通过静滴法进行WCA测量。利用压电驱动的打印头，将体积约为400 pL的单个水滴沉积到每个聚合物点上。聚合物点的直径通常为300 μm，水滴在聚合物点上的基底直径通常为100 μm，因此每个聚合物点只能获得一次测量结果。
    2. X-Y载物台可实现将每个聚合物点自动定位至打印头下方7。该过程通过位于样品上方的摄像头完成，摄像头提供阵列的俯视图像。首先需调整摄像头位置，使水滴的释放位置与摄像头视野中心对齐，然后将阵列与打印头对准。
    3. 高速相机记录液滴撞击表面及随后蒸发过程中的侧剖面图像。用于测量接触角的是捕捉液滴初始撞击时刻的帧图像。通过拟合液滴轮廓的圆形曲线，进而确定接触角。
  2. 飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）
    1. 将样品装载到载物台上。首先用洁净的铝箔覆盖载物台表面，以帮助电荷补偿，然后使用金属螺丝夹固定载玻片。
    2. 将样品载物台放入ToF-SIMS的传输室，并抽真空至1.6 × 10-6 mbar。随后将样品转移至主分析室，其典型真空度为1.0 × 10-8 mbar。
    3. ToF-SIMS测量使用ION-ToF IV仪器完成，采用单同位素Bi3+一次离子源，在25 kV电压下以“束团模式”运行。脉冲式1 pA一次离子束在分析区域进行光栅扫描，对微阵列中每个聚合物点上100 × 100 μm区域同时采集正负二次离子信号，采集时间为10秒。利用高分辨率飞行时间分析器测定离子质量，实现精确的质量归属。典型质量分辨率（在m/z 41处）略高于6000。使用低能电子（20 eV）补偿绝缘表面因带正电的一次离子束引起的表面电荷积累8。
  3. 原子力显微镜（AFM）
    1. 分析载玻片上的阵列需要使用带有自动载物台的大范围AFM。Dimension或ICON显微镜是实现此目的的理想选择。
    2. 将样品放置在载物台上，并将载物台位置归零至阵列的右上角。
    3. 找到阵列左下角的位置，从而可推算出其他所有点的位置。
    4. 生成位置列表，并输入软件的自动采样功能中。
    5. 使用Nanoscope 3000A仪器在轻敲模式下进行AFM测量。采用共振频率约为300 kHz、力常数为40 N/m的硅探针（Tap300Al，Budget Sensors）。对聚合物区域5×5 μm范围进行测量9。
    6. 使用SPIP批量处理软件对每幅图像中该区域的均方根（RMS）粗糙度进行测量。在粗糙度测量前，每幅图像首先进行平整化处理。
    7. 所有图像均需人工查看，以识别可能需要从粗糙度测量中剔除的成像伪影。在此步骤中，也可根据常见的表面特征对图像进行分类9。
  4. X射线光电子能谱（XPS）
    1. 使用双面胶带将微阵列载玻片固定在样品杆上，随后装入Kratos Axis Ultra XPS仪器的样品室。
    2. 进入样品室并等待其压力降至10-8 Torr以下。
    3. 选择适当的运行参数，如单色X射线源（Al，1486.6 eV）、阳极电压和电流（10 kV和15 mA）、光阑尺寸（110 μm）、通过能量（宽扫描为80 eV，高分辨率扫描为20 eV）。使用微阵列的两个对角进行X射线源聚焦，并优化样品中氧信号。然后确定各个点的x和y位置，并记录为位置列表。
    4. 编写程序图表，运行以采集数据，包括宽扫描和特定元素的高分辨率扫描。
  5. 拉曼光谱
    1. 使用拉曼显微镜LabRAM HR（Horiba Jobin Yvon）对每个聚合物点采集拉曼光谱。首先使用硅片校准拉曼信号，以Si在520.7 cm-1处的拉曼位移为基准。
    2. 将样品置于载物台上，调整激光（波长=523 nm）焦点，使在2950 cm-1处的C-H拉曼位移达到最大。
    3. 将微阵列左上角点的中心位置设为原点，并使用labRAM HR软件中的阵列功能建立微阵列的映射图。
    4. 对每个样品累积采集10次光谱，每次辐照时间为0.5秒。

5. 细菌检测

该阵列可用于多种不同的生物学检测，包括干细胞、其他细胞类型以及细菌的黏附和增殖3,10,4。本文描述了一种细菌黏附检测方法，其示意图如图4所示。

  1. 将含有表达GFP质粒的细菌菌株在50 mL Falcon管中，于37 °C、200 rpm振荡条件下，在10 mL LB培养基中过夜培养。
  2. 测定细菌培养物的OD600值，并将适量的过夜培养物接种至15 mL RPMI-1640限定培养基中，使终末OD600达到0.01。
  3. 用灭菌蒸馏水对芯片进行预清洗10分钟，以去除芯片上可能存在的可溶性成分（如未聚合的单体、寡聚物和溶剂）。
  4. 将清洗后的芯片载玻片置于洁净的培养皿中，进行10分钟的紫外灭菌处理。
  5. 将一块带有芯片的载玻片放入培养皿中，并加入15 mL接种后的RPMI-1640培养基；同时，将另一块芯片载玻片放入另一培养皿中，加入未接种的RPMI-1640培养基作为对照。
  6. 将载玻片在37 °C、60 rpm振荡条件下孵育72小时。
  7. 用15 mL无菌PBS溶液清洗载玻片两次。
  8. 用15 mL无菌蒸馏水清洗载玻片两次。
  9. 将载玻片自然风干。
  10. 使用GenePix Autoloader 4200AL扫描仪（Molecular Devices, US），配备488 nm激发激光和标准蓝色发射滤光片（510–560 nm）对载玻片进行成像。代表性聚合物自发荧光图像见图2。该步骤应尽快完成，以避免GFP信号衰减。若无法及时成像，应对细胞进行固定处理。此外，必须设置含有已知细菌反应的适当阳性对照，以便对结果进行归一化处理，并确保不同日期实验结果之间的定量可比性。使用GenePix Pro 6软件（Molecular Devices, US）获取聚合物点上的总荧光强度，该操作需对细菌孵育组和仅培养基对照组的载玻片均进行。为获得由细菌生长引起的荧光信号，需从细菌孵育组的荧光值中减去培养基对照组的荧光值。
  11. 也可将载玻片在室温下用20 μM SYTO17核酸染料（Invitrogen, UK）染色30分钟，并使用Carl Zeiss LSM 700激光共聚焦显微镜配合ZEN 2009成像软件（Carl Zeiss, Germany）进行成像。利用开源软件Image J 1.44（National Institute of Health, US）分析细菌在表面的覆盖情况。

6. 代表性结果

打印条件已优化，以制备高质量的聚合物微阵列。湿度应保持在30-40%之间。当打印环境湿度低于30%时，常观察到聚合物点在水性环境中发生脱层现象，表明该湿度不足以使pHEMA层溶胀，从而无法实现聚合物在基底上的物理截留。湿度可进一步提高以调节聚合物点的直径，但该效应取决于单体的化学性质。例如，在打印等体积聚合溶液的情况下，当湿度从40%增加至80%时，含有亲水性乙二醇片段的单体其斑点直径从430 μm减小至370 μm；而对于含有疏水性脂肪族碳环结构的单体，斑点直径则从290 μm增加至350 μm（图5）。

聚合度可通过拉曼光谱进行监测，测量在1640 cm⁻¹处检测到的C=C拉曼位移-1，应使用1720 cm⁻¹处的C=O拉曼位移进行归一化-1拉曼光谱测定了经不同紫外光照射时间聚合的聚合物斑点（图6）。随着紫外照射时间从0增加至50秒，C=C:C=O峰强比逐渐降低；继续延长紫外照射时间，C=C:C=O峰强比不再进一步下降（图6）。此外，还测定了在不同O₂2 水平以及C=C拉曼位移随O的变化而变化2水平降至 2000 ppm，但 O 的进一步减少未被观察到2 低于此水平（图7A）。拉曼光谱还表明，真空萃取步骤能够去除未聚合的单体。在真空萃取前，3300 ppm条件下聚合的聚合物其C=C拉曼峰位高于2000 ppm条件下的聚合物（图7A）；然而，在真空萃取后，两者的拉曼峰高度无明显差异（图7B），提示未聚合的单体已在真空萃取步骤中被完全去除。综上所述，聚合条件包括30–40%的湿度、紫外线照射时间超过50 s，以及O2 在打印后进行为期7天的真空萃取步骤，使水平低于2000 ppm。

打印并进行真空萃取后，可通过简单的光学显微镜观察来评估聚合物点阵聚合的成功情况，以识别异常的点阵形态。通常情况下，点阵应呈现圆形且均匀，如图8左侧所示。导致几何形状变化的可能原因是针头损坏或不洁净。对于少数单体组合，我们观察到形状不规则的点阵，例如中心点周围带有多个小卫星点的情况（如图8右侧所示），或“煎蛋状”结构，即一个中心点位于较大而较平坦的底层点之上。这可能是由于单体在打印前发生相分离所致，与单体之间的黏度、亲水性、挥发性或表面张力差异有关，表明该单体组合不适合此实验体系。此外，采用飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）等技术对聚合物点阵进行化学成像，也是重要且有时必需的质量控制步骤，可用于确定材料化学成分在点阵及整个阵列中的分布情况。该技术能够识别光学显微镜下不可见的某些材料过度扩散现象，并检测单个聚合物点内部的相分离情况。

单体聚合过程示意图：预混、转移、紫外照射、聚合、提取。
图1. 聚合物点形成的各个步骤示意图。

微阵列分析示意图；比色检测；DNA杂交结果展示。
图2. 针式点样方法的示意图，首先将针从源板中吸取单体，然后通过接触将单体沉积到基底上。针由X-Y-Z机械臂控制。插图显示了阵列制备完成后自荧光的典型图像。

静态平衡；光谱学、X射线显微镜示意图；化学分析、生物测定。
图3. 示意图，突出显示与高通量筛选技术（HTSC）以及应用于聚合物微阵列研究的生物测定方法相关的技术。

GFP细菌生长过程、荧光定量、聚合物微阵列示意图、荧光扫描仪。
图4. 细菌黏附实验示意图。

斑点直径与湿度关系图；化学结构符号；环境影响的数据分析。
图 5. 两种不同单体在不同湿度下打印的聚合物斑点直径：丙烯酸-4-叔丁基环己酯和乙二醇二甲基丙烯酸乙基醚。

紫外光暴露图，绘制C=C=C=O随时间（秒）的变化，误差线表示变异性。
图6. 不同紫外光暴露条件下，丙烯酸-4-叔丁基环己酯聚合物斑点在1640 cm-1处C=C拉曼位移与1720 cm-1处C=O拉曼位移的拉曼强度比值。误差线表示一个标准差（n = 3）。

Raman spectroscopy graph; chemical peak data; analysis for monomer and polymer under varied O2 levels.
图7. 不同 O 条件下打印的丙烯酸-4-叔丁基环己酯聚合物斑点的拉曼光谱测量结果2谱图左侧所示的水平，(A) 真空提取前和 (B) 真空提取后。1640 cm⁻¹ 处 C=C 拉曼位移的拉曼强度比值-1 以及在 1720 cm⁻¹ 处的 C=O 拉曼位移-1 显示在每个谱图的右侧。

小鼠胚胎受精，显微镜图像，细胞发育，生殖生物学研究。
图 8. 两个聚合物点的光学显微镜图像。左侧的点显示了一个形态良好的点，而右侧的点则是单体分布极不均匀的示例。比例尺为 500 μm。

讨论

聚合物微阵列已成功用于通过在生物测定中筛选数百种新型聚合物并鉴定出“命中”材料，从而发现新材料，这些“命中”材料随后可被放大用于制备有用的器件。在此情况下，所描述的表面表征可在生物测定之后仅针对“命中”材料进行，以更详细地研究这些材料。如果实验人员无法获得高通量表面表征（HTSC）技术，该策略可能具有参考价值。然而，为了充分利用聚合物微阵列研究生物-材料相互作用，应在进行生物测定之前，使用HTSC方法对包含数百种材料的整个阵列进行分析，从而能够进一步观察结构-功能之间的普遍规律。

接触式打印依赖于金属针在针 holder 中自由上下滑动。针和针 holder 的清洁度对于确保打印成功至关重要，必须严格执行。在开始打印运行之前，可通过在无单体存在的条件下进行干运行，来测试针在针 holder 内的适当运动。清洁步骤应持续进行，直至针的运动能够稳定重复实现。

在设计单体混合物时应进行周密考虑。为了便于构建聚合物的组合库，通常通过将少数几种单体以不同比例混合，从而形成数百种共聚物。通常我们制备包含576个成员的组合库，因其可形成24×24阵列，适合玻璃载片的几何结构。为了最大限度地探索组合空间，最简便的方法是将24种单体两两组合，并以2:1的比例进行混合。另一种方法是在阵列中引入组成梯度，有助于观察变化趋势，从而确定最优的单体组成。例如，可将22种单体分别作为共聚单体混合物中的第一组分，依次与6种不同的第二组分进行梯度稀释。若设置5个稀释梯度，例如第一与第二组分的比例分别为90:10、75:25、50:50、25:75和10:90，则可得到488种独特的共聚物溶液。为使总数达到576种，可加入所用单体的均聚物重复样本作为补充，这些样本常作为重要的参照样品。应将576种单体溶液分配至2块384孔板中。为便于机器人编程，两块板中单体的位置应完全相同，因此单体溶液应在两块板之间均等分配。

使用多通道移液器可显著节省源板制备过程中的时间，因此应根据多通道移液器的使用需求来设计源板的布局。

为了实现阵列的高通量自动表面表征（HTSC），必须成功将阵列上的点位与表征装置对准。通常，丙烯酸酯阵列的间距为500–1000 μm，聚合物点的直径为300 μm。大多数X-Y位移平台的分辨率为10 μm以下，因此只要在样品定位软件中输入正确的尺寸参数，表面表征装置即可在允许的误差范围内可靠地访问阵列的各个位置。实际上，自动定位的限制因素在于阵列打印的准确性。为确保打印精度，必须防止基底在打印平台上发生移动，可通过真空吸附或弹簧夹具配合适当尺寸的载玻片来实现（需注意，存在美国和欧洲两种标准载玻片尺寸）。

飞行时间二次离子质谱（ToF-SIMS）是一种对表面极为敏感的技术，能够检测样品表面的任何污染。因此，必须格外小心以避免接触样品表面。样品应仅在不触碰待测表面的前提下，使用洁净的手套（推荐聚乙烯材质）和新近清洗过的镊子进行操作。我们通常使用氯仿和正己烷进行清洗。在测量前，样品最好存放在可将载玻片彼此隔开的样品架中，例如5片装或20片装样品架。

这些阵列经过专门设计，可兼容多种生物学检测方法和读出方式，即所使用的基底为显微镜载玻片，非常适合荧光扫描仪和光学显微镜。这意味着该格式非常适合研究多种材料-生物相互作用。此外，该格式可实现数百种材料的并行筛选，从而能够检测的材料数量远超传统方法——在传统方法中，每种新材料化学成分需单独进行测试。更广泛的生物-材料相互作用研究范围有助于阐明生物表面相互作用的机制，并有助于找到特定应用中的最优材料。

致谢

谨此感谢惠康基金会（Wellcome Trust）的资助（资助编号 085245/Z/08/Z）。同时感谢诺丁汉纳米技术与纳米科学中心提供拉曼系统的使用权限，以及东米德兰兹开发署对本设备的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
环氧树脂载玻片GenetixK2652
接触式点样仪BiodotXYZ3060 Platform
金属针头ArrayIt946MP6B
ToF-SIMS 仪器ION-TOF
XPS 仪器Kratos Analytical
水接触角测量仪KrüssDSA 100
原子力显微镜（AFM）Bruker CorporationDimension Icon
RPMI-1640 细胞培养基Sigma-AldrichR0883
SYTO17InvitrogenS-7579

参考文献

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