杂交原位和蚊虫唾液腺，卵巢，胚胎

答:软组织原位杂交 :蚊子的唾液腺和卵巢

表1列出下列程序所需的解决方案和缓冲区的食谱。

1。 RNA探针的制备及质量分析

1. 设计引物进行PCR扩增利益的成绩单目标。据建议，扩增≥600个核苷酸长度，更重要的是，扩增序列是唯一的目标成绩单。是不是唯一的序列，是可以避免的，以消除可能产生交叉反应的RNA探针。
2. 到pCR4-TOPO载体，或类似的克隆载体克隆PCR产物。 pCR4-TOPO克隆载体含有T7和T3 RNA聚合酶的的吸网站，使生产的意识和反义转录产物运行，从一个单一的克隆。
3. 序列的克隆扩增，以验证序列FIDelity内载体和方向。
4. 执行适合生产体外转录产物的反义酶酶切反应。质粒线性-TOPO载体，如SPE我，我的Pst pCR4多个克隆地区选择限制网站或简单一确保所选的酶切位点是在片段中不存在。同一克隆可以用来产生从某种意义上链RNA探针，作为背景控制。 在一定意义上探针的原位杂交，应给予很少或没有信号时，比较互补的反义探针。
5. 凝胶电泳，的pCR4-TOPO的克隆是完全线性的验证。
6. 执行酚氯仿抽提，乙醇沉淀，净化线性质粒DNA。沉淀质粒DNA时，建议使用最后concent2米，2.5倍体积乙醇醋酸铵的口粮，以减少结转残留盐在体外转录反应。
7. 准备地高辛（DIG），单链RNA探针标记，使用1微克的线性质粒DNA为模板进行体外转录反应决胜。准备与RNA聚合酶转录缓冲液和地高辛RNA标记的组合，作为制造商的指示反应。
8. 净化在体外转录产物的DIG标记，乙醇沉淀和悬浮颗粒RNA的DEPC处理的蒸馏水。
9. 验证甲醛凝胶电泳的质量与预期分子量DIG标记的纯化RNA探针。制备的RNA探针可分为等份，并保存在-80°C，直到使用。

2。解剖蚊子的唾液腺和卵巢

1. 解剖蚊子的唾液格兰DS使用探针和镊子作为先前描述的AE。对于埃及伊蚊^。1,2。为AE，冈比亚 ，唾液腺可以解剖。埃及斑蚊 ，或者描述按蚊的研究在MR4方法的手册^3。
2. 使用如AE先前所述的钳解剖蚊子的卵巢。埃及伊蚊 ^。4简言之，用一个钳子抓住胸部，而另一钳子拉倒数第二腹节释放卵巢。
3. 收集解剖Ambion公司无RNase的1.5 ml离心管50μL的PBS或唾液腺卵巢。
4. 保持直到固定冰的样品。

3。固定术

1. 解剖组织修复新鲜准备的软组织固定的解决方案（ 见表1），在室温下用30分钟到1小时的垂头。固定的解决方案是准备新鲜，以防止oxidat离子甲醛固定液。建议唾液腺固定1-1.5小时。 1毫升的最低量是固定在1.5毫升的离心管组织的建议。
2. 允许组织解决的离心管的底部。这是一个重要的步骤，如下协议中的所有变化的解决方案，将最大限度地减少重大损失样本。
3. 小心移液倒出固定的解决方案，离开50-100微升体积的离心管中，然后洗3×5分钟每个与PBT。
4. 组织存储可选的平衡步骤。逐步冲洗无论是乙醇或甲醇PBT。执行与PBT /乙醇（3:1，1:1和1:3，每5分钟）分步进行清洗。在-20°C的商店100％的酒精（200证明）组织可以存储几个月没有组织超微结构的退化。在执行该协议的后续步骤之前，组织必须逐步平衡返回PBT的酒精/ PBT（3:1，1:1，1:3，每次5分钟）。
5. 执行PBT的洗3倍，每5分钟。
6. 0.01 mg / ml的蛋白酶K / PBT，5分钟在室温下进行蛋白质的消化。另外，如果这两个目标蛋白质的RNA 原位杂交免疫组化需要，卵巢可以在-20°C孵育10分钟，而不是用蛋白酶K处理用80％丙酮/ H _{2 O}
   蛋白酶K处理省略唾液腺的准备。直接进行步骤3.10。
7. 立即调迁小心移液消化解决方案。洗2×5分钟，冰冷的PBT的每个停止消化。
8. 执行额外的PBT的洗2×，在室温下各5分钟。
9. 修复后在室温下30分钟垂头软组织固定的解决方案。唾液腺后固定的步骤进行。
10. 执行PBT的洗5×，每5分钟。

4。杂交

1. 倒出尽可能HYB / PBT。每个样品管中加入1毫升的HYB。
2. 包裹在样品管密封空气防护包装（泡沫包装）内杂交瓶的地方。杂交瓶盖密封的瓶子。
3. 预杂交和杂交步骤可以很容易地在杂交炉。 30分钟旋转55°C时进行预杂交。
4. 留出足够的时间，组织解决的离心管的底部，为HYB超过PBT的密集。精心调迁预杂交液。组织可能会变得半透明，很难想象。可减少留在每个样品管溶液的体积50-100微升样品损失。
5. 添加到HYB 50μL体积样品管和热块保持在55°C。
6. 变性RNA探针在85°C为5-10分钟。立即放在冰上5分钟变性的探针。
7. 到样品管中吸取的RNA探针。 RNA探针，将浮的HYB表面。混合管轻轻弹。
8. 总量在50-100 HYB每个样品液进行杂交。在一个固定的离心机架内杂交炉，或在水浴浮动离心管架，在55℃为16-24小时，孵育样品。

5。核糖核酸酶的治疗

1. 删除包含探针的HYB。重要的是要保持在55°C样品在洗涤步骤，以减少非特异性剩余未结合的探针结合。如果几个样品杂交，建议保持在55°C样品管设置在热块，以保持整个洗涤步骤的杂交温度。
2. 执行与HYB快洗溶液1毫升移液进入离心浴缸e和反相样品管的5-6倍。
   同样通过添加所需的解决方案和反相几次样品管中的所有协议的后续进行快速清洗。
3. 执行两个额外的清洗HYB 55°C间，在杂交炉旋转各30分钟。
4. HYB / PBT（1:1）在室温下孵育15分钟垂头PBT的平衡。
5. 执行PBT的洗5×，每5分钟。
6. 准备新鲜的核糖核酸酶的缓冲区。执行核糖核酸酶A在20微克/ ml的RNA酶A / PBT在37°C间，为30分钟的孵育治疗。 RNA酶A的克里弗斯单双链RNA和RNA探针unhybridized退化导致。
7. 倒出核糖核酸酶A的缓冲区，并执行与PBT快洗。
8. 执行PBT的洗3倍，每5分钟。

6。抗体孵育

1. 准备新鲜的封闭液（5％鸡血清/ 1％西方封锁试剂/ PBT）和块样品incuba婷在1毫升的溶液在室温与垂头30分钟。
2. 加入200μL的抗地高辛碱性磷酸酶（AP）的标记抗体在封闭液1:1000稀释。在4℃孵育过夜垂头。

7。碱性磷酸酶染色

1. 取出的抗体和封闭液。
2. 执行PBT快洗。
3. 执行额外的PBT的洗5×，每次10分钟。此外，样品可以冲3倍，10分钟扩展洗4°C间，垂头过夜。
4. 准备新鲜的AP染色缓冲。
5. 执行与AP染色缓冲快洗。
6. 执行额外的清洗与AP染色缓冲3×，垂头每5分钟。
7. 做好准备，根据制造商的说明，包含AP底物NBT​​ / BCIP新鲜AP染色溶液。
8. 孵育每个样品500μLAP染色溶液在室温。温度E与垂头，在黑暗中。样品可以覆盖一个不透明的容器或铝箔管培养。反应级数应监测形成一个紫色的沉淀，每1-2分钟。根据探针浓度，靶RNA的浓度和非特定目标的存在，染色可能继续为几分钟到几个小时。
9. 删除尽可能染色液多。在随后的洗涤步骤，在一个白色的絮状沉淀形成令人满意的调迁的结果。
10. 染色完全停止执行与PBT的快速清洗。
11. 执行额外的PBT的洗3×，每次5分钟。

8。甘油安装

1. 从井用Pyrex现货板成单个圆底离心管，使用大口径的200μL枪头，转移样品。
2. 小心取出样品尽可能多尽可能的PBT。
3. 吸管上的样品70％甘油/ H _{2 O}顶部允许甘油渗透样本组织，在4°C隔夜。甘油治疗期间将安装防止组织干燥。
4. 准备抹滑动面清洁Kimwipes显微镜幻灯片。申请幻灯片两个件无形磁带并行对方，使他们形成一个狭窄的通道（ 图2）。
5. 使用艺术画笔，拿起样品一，他们将沿通道长度，前/后和背/腹路线，每个样品相同的方向与定位。
6. 定位每个样品后，使用Kimwipe拭，吸收多余的甘油溶液，周围的组织（ 图3）。重要的是要防止泡沫的形成，密封盖玻片下安装到幻灯片样品时，去除过剩的甘油。
7. 中心和地方仔细交流超过包含对准样品的通道滑。加盖盖玻片上的幻灯片semipermanently用透明的指甲油涂抹在盖玻片的角落。
8. 使用200微升移液器，免除慢慢进入渠道不够70％的甘油通过毛细作用填满整个空间的渠道和领域的掩护下单的一端。
9. 永久安装的样品沿盖玻片四面都用指甲油密封。让指甲油充分晾干后方可拍摄的杂交整个安装组织。建议在拍摄后立即安装的样本图像。

B.蚊子胚胎原位杂交

在蚊子胚胎原位杂交所需的解决方案和缓冲区描述（ 见表1）。固定和杂交过程，这里已被修改，从thosé首先报道冈比亚按蚊 ^，5,6 埃及伊蚊和致倦库蚊 。

1。胚胎收集

1. 胚胎收集300交配，雌性成蚊允许交配男性为48小时，3天出现后72小时后，血液喂养。蚊子都保持在3米的蔗糖溶液，以防止产卵前，旨在收集期间。
2. 准备排队16盎司的胚胎收集容器。纸杯与Saatilene海泰网，使杯内表面被完全覆盖。网格可以通过使用一个单一的主食贴。使用该网格大大降低，目前如果使用滤纸过滤纸，纸巾的纤维污染物。
3. 半满填充容器用蒸馏水。
4. 胚胎收集1小时，放置在笼子里的收集容器，这是后来覆盖由暗布来刺激产卵。
5. 允许收集胚胎发育阶段所需的以外，在标准饲养条件下（相对湿度85％/ 29°C）笼成熟。近似的描述（ 见表2）胚胎的发育时间当然可以与成熟的胚胎不同阶段时间（小时后产卵）。此表总结为埃及伊蚊由Raminani和Cupp的报道，在胚胎发育过程中的重大事件^，9,10 冈比亚按蚊描述由诺娃-Kazas ¹¹首，进一步阐述的Goltsev和同事^，12,13和致倦库蚊戴维斯报告^。14全日制课程描述的目的是作为初步估计，而不是绝对的时间点，收集胚胎，在特定的发展阶段。

2。 dechorionation，固定，Endochori在中断

1. 从收集容器转移到Saatilene网dechorionation渔获管（ 图3）胚胎。
   对于白胚，将进入一个充满足够的蒸馏水的烧杯中，使渔获管的体积是一个半满的渔获管。艺术画笔可以用来从Saatilene网打跑胚胎转移到他们的充满水的渔获管。
   按蚊胚胎，脱离Saatilene网收集容器，并仔细折叠网格形成一个漏斗。用一只手拿着网状漏斗，用另一只手沿着漏斗双方免除蒸馏水通过聚乙烯喷瓶，洗到渔获管的胚胎。此方法可应用于按蚊胚胎，因为他们缺乏白胚表面，使鸡蛋坚持产卵基板上的粘性物质。
2. 公关epare 40毫升dechorionation解决方案（1卷5.25％次氯酸钠:3体积的蒸馏水）。倒入100毫米培养皿的解决方案。
3. 准备100毫升烧杯中含有50毫升的蒸馏水，并预留。 dechorionation一步是敏感的时间和紧随其后的次氯酸钠处理的胚胎将沉浸在这水，，稀释dechorionation解决方案。
4. Dechorionate放置在充满培养皿dechorionation解决方案的管网格中捕捉管的胚胎。使用一次性聚乙烯移液管或巴斯德吸管洗胚胎，使胚胎仍然淹没和激动在dechorionation解决方案，而纷飞的catch小瓶。
   为白胚dechorionation的需要最多35秒，而75秒是足够按蚊和库蚊胚胎（ 见表3）。 dechorionation是PROT最敏感的步骤之一ocol和次氯酸钠处理扩展，特别是白胚将防止绒毛膜适当的开裂。
5. 立即在烧杯中含有水淹没的渔获小瓶。
6. 从胚胎洗掉渔获管从装满水的烧杯和蒸馏水从喷瓶或管道安装水龙头冲洗的渔获管的内，外壁其余dechorionation解决方案。
7. dechorionation可以验证通过可视化的胚胎，在解剖显微镜低倍率。胚胎dechorionated 伊蚊缺乏网般的exochorion和光滑，抛光表面的黑色endochorion是显而易见的，对于dechorionated 按蚊胚胎exochorionic彩车和山脊结构缺席（ 图4）。
8. 使用艺术画笔，转入闪烁小瓶5毫升蒸馏水华dechorionated胚胎之三（ 图5-1）。如果多个样品正在准备，保持渔获管水，以防止干燥的胚胎。
9. 让胚胎定居闪烁瓶的基地，并尽可能多的水从小瓶尽可能。
10. 添加到闪烁瓶（ 图5-2）5庚毫升。除去残留的水，仍然在闪烁瓶。
11. 添加到闪烁瓶5毫升新鲜制备的胚胎固定的解决方案（ 见表1）。
12. 修正反转30分钟的胚胎，使有机相和水相调匀，但不起劲。
13. 取出内固定的解决方案，使用玻璃巴斯德吸管，小心不要打扰相间，其中包含了胚胎（ 图5-3）。
14. 由闪烁瓶灌装与尽可能多的蒸馏水尽可能洗掉残留的固定解决方案。颠倒小瓶5倍，然后取出所有的蒸馏水。
15. 填写闪烁瓶20毫升蒸馏水和混合颠倒小瓶30分钟。
16. 从闪烁瓶中的水。
17. 补充足够的闪烁瓶中沸腾的蒸馏水，使无机庚相达到小瓶的顶部。
18. 孵育30秒，然后取出所有的沸水。
19. 加入冰冷的蒸馏水，直到无机相达到小瓶顶部。孵育10分钟的冰瓶。
20. 先取出水相和有机相。庚会出现不透明的，在这一步（ 图5-4）。
21. 添加到小瓶5毫升新庚。删除所有剩余的水从瓶中。
22. 添加到小瓶5毫升甲醇。 1-2倍大力摇动小瓶，无晃动（ 图6）。如果动摇大力的正庚烷和有机无机甲醇阶段的胚胎无线endochorion破裂过程中会被摧毁。值得注意的是，更何况我们已经观察endochorion中断的效率在不同品系的埃及伊蚊胚胎的变化。
23. 在室温下孵育15-20分钟。在这一阶段，将成为混浊由于蛋黄组件（ 图5-5）释放阶段。
24. 除去有机和无机相，并用甲醇洗3次，以消除所有剩余的正庚烷。
25. 胚胎可以在-20°C的甲醇储存长达数月。

3。去皮

1. 假发胶带双面放置在一块3厘米的培养皿的中心。因为胶粘剂甲醇和乙醇的存在是稳定的，在使用假发胶带。
2. 使用双面胶带从甲醇到一个大孔（直径约3毫米），200μL枪头，移植胚胎。
3. 允许1-2分钟解决胚胎和ADHERE的磁带表面。
4. 倒出过量甲醇，使表面稍干1-2分钟。
5. 到培养皿中，加入4毫升95％（190证明）乙醇。
6. 吸取600μL蒸馏水混合成乙醇和漩涡。磁带将成为不透明的颜色。除了蒸馏水会导致磁带成为俗气的和固定的胚胎中剥离。如果需要的话，这一步可以省略。
7. 使用27.5号针头，1毫升针筒关闭的破获endochorion（ 图7）剥离。释放后从的黑色endochorion残余的白胚，胚胎转移，从磁带到培养皿乙醇水库，用细尖的艺术画笔。用3毫米的孔枪头，转移到1 Ambion公司1.5 ml离心管500μl200证明乙醇的胚胎。
   去皮的胚胎不应该长时间保持在磁带上，因为他们可能坚持每manently到磁带。
8. 执行2-3 100％的快速清洗（200证明）乙醇和一丝不苟的乙醇于-20°C储存胚胎去皮的胚胎可以保存几个月不影响形态或随后的杂交信号在-20°C。

4。蛋黄的澄清

1. 执行200证明乙醇的快洗。应一丝不苟的乙醇用于所有随后的洗涤步骤的P-二甲苯的蛋黄澄清溶液的制备。
2. 执行一个乙醇洗，垂头5分钟。
3. 在室温下孵育1-1.5垂头ĤP-xylene/ethanol（9:1）。二甲苯一步，允许的蛋黄群众的澄清，以提高信噪比。
4. 删除二甲苯乙醇溶液和执行两个快速洗涤用乙醇。
5. 执行一个乙醇洗，垂头5分钟。
6. 执行两个快速甲醇清洗，其次是一个甲醇洗，5分钟垂头。
7. 甲醇/甲醛固定溶液（1:1）洗涤一次到4％甲醛固定溶液平衡。

5。固定和原位杂交

固定和杂交原位程序协议A节中所描述的是相同的

C.代表结果

这里描述的在原位协议杂交，结果表明彩色染色模式的目标mRNA的存在和定位。重要的是要强调的是，不能用原位杂交确定转录丰度的相对水平。杂交结果是根据特定的基因在杂交过程中使用的探头，在杂交组织的靶mRNA，探针浓度，杂交温度以及丰富的依赖。杂交，反义组织的比较和相应的感基因探针，使可能的染色模式的准确解释。

雌性伊蚊埃及伊蚊基因探针目标amylase1（AAEL006719），D7s2（AAEL006423），D7L2（AAEL006424）表明这些记录在外侧近端，远端外侧积累唾液腺整个安装原位杂交和远端¹全装三个蚊种的卵巢外侧/内侧叶，分别为（ 图8）。杂交基因探针，针对各自的直系成绩单奥斯卡（ 图^9）。7,8杂交整个安装胚胎原位AE的。埃及斑蚊，安。冈比亚和CX。倦了，用反义RNA探针，针对各自的蚊子奥斯卡的直系成绩单（ 图^10）。7,8

1 igure"SRC ="/ files/ftp_upload/3709/3709fig1.jpg"/>
图1。杂交后的示意图安装设置。

图2。 Kimwipe拖把准备用于安装在样品。一个Kimwipe组织扭紧紧地产生细尖的拖把，以吸收多余的安装介质从样品和幻灯片。

图3。原理的Saatilene网dechorionation渔获管。一）50毫升聚苯乙烯锥管底部被切断，产生一个空心管长4.5厘米，两端开口。锥形管的盖子，允许液体通过一个6.5厘米²平方米Saatilene网片洗净切出一个圆形开口是。每英寸330线程，34微米直径的螺纹丝网保留蚊子胚胎。 b）肛门embled赶上管。

图4。 埃及伊蚊和冈比亚按蚊卵，前后dechorionation。） 埃及伊蚊卵前dechorionation。网格状exochorion首先在于黑endochorion，使鸡蛋质感的外观（插图扩大）。继拆除exochorion，只有平稳和抛光endochorion仍然（B和插图扩大）。 c） 冈比亚按蚊卵之前dechorionation。如彩车exochorion结构是可见的（箭头）。 d）顺利和抛光表面的endochorion可见光后dechorionation。酒吧= 100微米。

图5。的AE固定和endochorion的中断的一系列连续的步骤。 A） 埃及斑蚊卵倾斜的正面视图和B）横向视图闪烁小瓶含AE。埃及伊蚊卵期间固定和endochorion中断的顺序步骤。蒸馏水1）胚胎。 2）胚胎漂浮在上正庚烷相和较低的水相之间的相间。 3）以下的固定的胚胎包一起在一个圆形肿块。胚胎留在庚和固定液阶段之间的相间。 4）治疗后，用开水和冰孵化，正庚烷相变得稍微不透明。 5）具有破坏endochorions的胚胎庚相之间的不透明和透明的甲醇相相间。

图6。固定AE endochorion中断。埃及斑蚊卵 。一）后立即精力充沛，庚烷和甲醇相纷飞，泡沫的形成和破坏的endochorion可以可视化。乙）Followi吴五分钟的潜伏期，在室温下。

图7。蚊卵，破坏和拆除endochorion。AE鸡蛋。埃及伊蚊 （A） 一个。冈比亚 （B）和CX。倦 （c）以下的固定和破坏的endochorion。白色，半透明的胚胎可以看出内破获endochorion。搬迁后的endochorion，AE半透明的胚胎。埃及斑蚊 （D） 一个。冈比亚 （E）和CX。倦 （女）都清晰可见。酒吧= 100微米。

图8。 在三个基因表达在不同肺叶的整个安装，女AE原位杂交。埃及伊蚊唾液腺 。染色是本地化和积累amylase1（AAE指示 L006719）（A）D7s2（AAEL006423）（B）和D7L2（AAEL006424）（乙）。酒吧= 100微米。

图9。蚊子奥斯卡整个安装蚊子的卵母细胞和护士细胞反义RNA探针原位杂交 。第四阶段的卵母细胞（OOC）解剖从一个卵巢。冈比亚 （一），AE。埃及伊蚊 （B）和CX。倦 （C）和RNA靶向各自的蚊子奥斯卡基因探针杂交。初级卵泡与左前导向。染色后极（蓝色箭头）显示累计奥斯卡基因。中学（F2）和三级（F3）毛囊和染色（黑色箭头）指示护士细胞的细胞质（NCC）在奥斯卡mRNA的积累。染色护士细胞核（NCN）被排除。酒吧= 50微米。

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图10。蚊子奥斯卡整个安装蚊子胚胎反义RNA探针原位杂交 。胚胎是在左前导向。 一个阶段的胚胎细胞胚。冈比亚 （A）和CX。倦 （三）与各自的蚊种具体奥斯卡 RNA探针杂交。 B）合胞体胚盘阶段AE。埃及伊蚊胚胎杂交的RNA探针定位AE。埃及伊蚊奥斯卡成绩单。染色是明显的，在所有胚胎后极细胞，说明在这些细胞中的蚊子奥斯卡基因的定位和积累。酒吧= 50微米。

表1。甲醛凝胶电泳，固定和原位杂交的解决方案和缓冲区。

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表2。发展的事件和相应的蚊子胚胎发育过程中的连续阶段的形态学观察。

表3。摘要预杂交的步骤，为各种组织类型的主要区别。

作者有没有披露。