时间和空间上的基因表达分析在功能基因组学中具有重要作用。原位杂交可用于确定转录本在组织及亚细胞区室中的定位。本文概述了一种针对蚊子特定靶组织优化的原位杂交实验方案。
本文内容
摘要
摘要
蚊子是多种病原体的传播媒介，包括节肢动物传播病毒、原生动物寄生虫和线虫。研究蚊子体内病原体与宿主相互作用组织以及生殖器官中表达的转录本和基因调控因子，对于开发阻断蚊媒疾病传播和干扰卵子发育的策略具有重要意义。已有多种工具被用于研究和验证基因表达的时间特异性和组织特异性调控。本文描述了为获取基因表达空间信息而开发的一系列实验方案，这些信息有助于我们更深入理解特定基因的表达位置及其产物的积累情况。所述方案已被用于验证转录本的表达，并确定其在与蚊媒病原体传播相关的组织（如雌性蚊子的唾液腺）以及与蚊子生殖和发育相关的卵巢和胚胎亚细胞结构中的积累模式。
以下步骤代表了一种经过优化的方法，可在不损失靶标特异性杂交信号的前提下，提高本实验方案中多个步骤的效率。A 部分介绍了 RNA 探针制备、软组织解剖以及固定和杂交的一般性操作流程，而 B 部分则详细描述了蚊子胚胎收集、固定、预杂交及杂交的特定操作步骤。
方案
A. 杂交 原位 用于软组织：蚊子唾液腺和卵巢
下表中列出了后续实验步骤所需的溶液和缓冲液的配制方法（见表1）。
1. RNA探针制备与质量分析
- 设计引物以通过PCR扩增目标转录本。建议扩增片段长度≥600个核苷酸，更重要的是扩增片段序列应特异性针对目标转录本。应避免使用非特异性序列，以防止产生交叉反应的RNA探针。
- 将PCR产物克隆至pCR4-TOPO载体或类似的克隆载体中。pCR4-TOPO克隆载体含有T7和T3 RNA聚合酶引物结合位点，可从单个克隆产生正义链和反义链的截短转录产物。
- 对克隆的扩增片段进行测序，以验证其在载体质粒中的序列保真度和方向性。
- 使用一种适合产生反义链的酶进行限制性消化反应 体外 转录产物。通过选择位于pCR4-TOPO载体多克隆区域中的限制性酶切位点，可简便地实现质粒线性化，例如 光谱我， Pst我或 不I. 确保所选的限制性酶切位点在克隆片段中不存在。同一克隆可用于制备正义链RNA探针，作为背景对照。杂交 原位 与互补的反义探针相比，正义探针应产生微弱或无信号。
- 通过凝胶电泳验证 pCR4-TOPO 克隆是否完全线性化。
- 通过苯酚-氯仿抽提，随后进行乙醇沉淀，纯化线性化的质粒DNA。在沉淀质粒DNA时，建议使用终浓度为2 M的乙酸铵和2.5倍体积的乙醇，以减少残留盐分的带入 体外 转录反应
- 制备地高辛（DIG）标记的单链RNA探针，通过体外转录法进行合成 体外 转录反应，使用 1 μg 以线性化的质粒DNA作为模板。按照制造商说明书，使用RNA聚合酶、转录缓冲液和DIG RNA标记混合物制备反应体系。
- 纯化地高辛标记的， 体外 通过乙醇沉淀法沉淀转录产物，并将沉淀的RNA重悬于经DEPC处理的蒸馏水中。
- 通过甲醛凝胶电泳验证纯化的地高辛标记RNA探针的质量及预期分子量。制备好的RNA探针可分装后于-80°C保存。80 °C 直至使用。
2. 蚊子唾液腺和卵巢的解剖
- 使用探针和镊子解剖蚊子唾液腺，操作方法如前所述 埃及伊蚊.1,2 对于 An. gambiae，唾液腺可按所述方法进行解剖 埃及伊蚊，或另见MR4方法中的描述 按蚊属 研究手册3
- 使用镊子按照先前所述方法解剖蚊子卵巢 埃及伊蚊.4 简言之，用一对镊子夹住胸部，同时用另一对镊子撕下倒数第二腹节以释放卵巢。
- 收集解剖后的唾液腺或卵巢，置于含有 Ambion RNA酶-free 1.5 ml 微离心管中 50 μl PBS。
- 将样品置于冰上保存直至固定。
3. 固定
- 将解剖所得组织置于新鲜配制的软组织固定液中固定（表1在室温下以旋转振荡方式孵育30分钟至1小时。固定液需现配，以防止甲醛固定剂氧化。唾液腺组织建议固定1-1.5小时。在1.5 ml离心管中固定组织时，建议使用不少于1 ml的固定液体积。
- 让组织沉降到微量离心管底部。此步骤至关重要，每次更换溶液后均需进行，以尽量减少样品的显著损失。
- 小心吸去固定液，留下50-100 μl 微离心管中体积，然后用PBT洗涤3次，每次5分钟。
- 可选的组织保存平衡步骤。使用乙醇或甲醇逐步置换PBT。依次用PBT/醇溶液（3:1、1:1 和 1:3，每步5分钟）进行梯度洗涤。最后在100%（200 proof）醇中于-20°C保存。20 °C组织可在不破坏超微结构的情况下储存数月。在进行后续实验步骤之前，必须通过梯度酒精/PBT溶液（3:1、1:1、1:3，每步5分钟）逐步平衡，使组织重新回到PBT环境中。
- 进行PBT洗涤，每次5分钟，共3次。
- 使用 0.01 mg/ml 蛋白酶 K/PBT 在室温下进行蛋白质消化，5 分钟。或者，若需同时进行蛋白质靶标的免疫定位与杂交 原位 若需要 RNA，可将卵巢与 80% 丙酮/H2O 在 -20 °C 10分钟，代替蛋白酶K处理。
唾液腺制备过程中省略蛋白酶K处理步骤，直接进入步骤3.10。 - 立即用移液管小心倾出消化液。用预冷的PBT洗涤2次，每次5分钟，以终止消化反应。
- 在室温下用PBT再洗涤2次，每次5分钟。
- 室温下用软组织固定液进行后固定，同时采用旋转振荡处理30分钟。唾液腺样本不进行后固定步骤。
- 进行PBT洗涤，每次5分钟，共5次。
4. 杂交
- 将组织在杂交溶液（Hyb）中平衡：于室温下，用 1 ml Hyb/PBT（1:1）孵育 30 分钟，并伴随振荡。
- 尽可能倒出 Hyb/PBT 溶液，向每个样品管中加入 1 ml Hyb 溶液。
- 用密封气垫包装材料（气泡膜）包裹样品管，并放入杂交瓶中，用杂交瓶盖密封瓶口。
- 预杂交和杂交步骤可在杂交炉中便捷进行。在 55 °C 下以旋转方式预杂交 30 分钟。
- 给予足够时间使组织沉降至微量离心管底部，因为 Hyb 溶液密度高于 PBT。小心倾去预杂交溶液；组织可能变得半透明而难以观察。为减少样品损失，可在每管中保留 50–100 μl 溶液。
- 向样品管中加入 50 μl Hyb 溶液，并置于 55 °C 的加热块中保温。
- 在 85 °C 下对 RNA 探针变性 5–10 分钟，随后立即将变性后的探针置于冰上冷却 5 分钟。
- 用移液器将 RNA 探针加入样品管中。RNA 探针会浮在 Hyb 溶液表面，轻轻弹击管壁以混匀。
- 每份样品的杂交总体积为 50–100 μl Hyb 溶液。将样品置于杂交炉内的固定微量离心管架中，或置于水浴中的浮动微量离心管架上，在 55 °C 下孵育 16–24 小时。
5. RNA酶A处理
- 移除含有探针的杂交液。在洗涤步骤中，保持样品温度为 55 °C 非常重要，以减少未结合探针的非特异性结合。如果同时处理多个样品，建议将样品管置于设定为 55 °C 的加热块中，以在整个洗涤过程中维持杂交温度。
- 通过移液将 1 ml 杂交液加入微量离心管中，并将样品管颠倒 5–6 次，进行快速洗涤。
本方案中后续所有快速洗涤步骤均以类似方式进行，即加入所需溶液并多次颠倒样品管。 - 在杂交炉中于 55 °C 下用杂交液再进行两次洗涤，每次 30 分钟，并保持旋转。
- 用 Hyb/PBT（1:1）溶液在室温下孵育 15 分钟并进行振荡，使样品平衡至 PBT 溶液环境。
- 用 PBT 溶液洗涤 5 次，每次 5 分钟。
- 配制新鲜的 RNAse A 缓冲液。在 37 °C 下用含 20 μg/ml RNAse A 的 PBT 溶液孵育 30 分钟，进行 RNAse A 处理。RNAse A 可切割单链 RNA，从而降解未杂交的 RNA 探针。
- 倒出 RNAse A 缓冲液，并用 PBT 溶液进行一次快速洗涤。
- 用 PBT 溶液洗涤 3 次，每次 5 分钟。
6. 抗体孵育
- 配制新鲜的封闭液（5% 鸡血清/1% Western 封闭试剂/PBT），将样品在 1 ml 该溶液中于室温下振荡孵育 30 分钟进行封闭。
- 在封闭液中加入 200 μl 1:1000 稀释的抗 DIG-碱性磷酸酶（AP）偶联抗体，于 4 °C 振荡孵育过夜。
7. 碱性磷酸酶染色
- 移除抗体和封闭液。
- 用PBT进行快速洗涤。
- 再用PBT洗涤5次，每次10分钟。或者，可先用PBT洗涤3次，每次10分钟，随后在4 °C下避光、振荡过夜进行长时间洗涤。
- 配制新鲜的碱性磷酸酶（AP）染色缓冲液。
- 用AP染色缓冲液进行快速洗涤。
- 再用AP染色缓冲液洗涤3次，每次5分钟，并持续振荡。
- 根据试剂盒说明书，配制含有AP底物NBT/BCIP的新鲜AP染色溶液。
- 每个样本加入500 μL AP染色溶液，在室温下避光振荡孵育。可通过将管子置于不透光容器或铝箔包裹的方式实现避光。应每隔1–2分钟观察一次反应进程，监测紫色沉淀的形成。染色时间可能从数分钟至数小时不等，具体取决于探针浓度、靶RNA浓度以及非特异性结合的存在情况。
- 尽可能彻底移除染色溶液。若倾倒不充分，后续洗涤步骤中将产生白色絮状沉淀。
- 通过进行两次PBT快速洗涤，完全终止染色反应。
- 再用PBT洗涤3次，每次5分钟。
8. 甘油封片
- 使用大孔径的 200 μl 移液枪头，将样品从微量离心管转移至 Pyrex 点板的各个圆底孔中。
- 小心地尽可能去除样品中的 PBT 溶液。
- 在样品上加入 70% 甘油/H2O 溶液。于 4 °C 下静置过夜，使甘油充分渗透样品组织。甘油处理可防止封片过程中组织干燥。
- 用 Kimwipes 擦拭载玻片表面以清洁之。在载玻片上平行粘贴两条透明胶带，使其形成一条狭窄的通道（图 2）。
- 使用绘画用毛笔逐个拾取样品，并将其沿通道长度方向依次放置，确保每个样品的前后、背腹方向保持一致。
- 每放置一个样品后，使用 Kimwipe 棉签吸除组织周围多余的甘油溶液（图 3）。去除多余甘油对防止封片时产生气泡至关重要。
- 将盖玻片小心地居中覆盖在含有排列整齐样品的通道上。用透明指甲油轻点盖玻片四角，将其半永久性固定于载玻片上。
- 使用 200 μl 移液器，缓慢将足量的 70% 甘油从通道一端加入，依靠毛细作用使甘油充满整个通道及盖玻片下方区域。
- 用指甲油沿盖玻片四边完全密封，以永久固定样品。在拍摄杂交后的整体组织图像前，应确保指甲油充分干燥。建议在封片后立即进行显微摄影。
B. 杂交 原位 用于蚊子胚胎
杂交实验所需的溶液与缓冲液 原位 蚊虫胚胎的制备方法如下所述（表1）。此处介绍的固定和杂交步骤已根据最初报道的方法进行了修改 Anopheles gambiae,5,6 埃及伊蚊7 和 致倦库蚊.8
1. 胚胎收集
- 从300只交配后的雌性成蚊中收集胚胎，这些雌蚊在羽化后3天允许与雄蚊交配48小时，并在吸血后72小时进行收集。为防止在预定收集期前产卵，蚊虫始终维持在3 M蔗糖溶液饲养条件下。
- 准备胚胎收集容器时，将Saatilene Hitech尼龙网衬在16 oz纸杯内，使纸杯内表面完全被覆盖。可用单个订书钉将网固定。使用该尼龙网可显著减少使用Whatman滤纸或纸巾时常见的纤维状污染物。
- 将容器装入一半的蒸馏水。
- 将收集容器放入笼中，再用深色布料覆盖，以刺激产卵，收集胚胎1小时。
- 收集的胚胎在标准培养条件下（85%相对湿度）置于笼外发育至所需发育阶段 26 °C）。胚胎发育至不同阶段的时间（产卵后小时数）可与所描述的胚胎事件大致的发育时间进程相对应。表2）。此表格总结了胚胎发育过程中的主要事件 埃及伊蚊，由 Raminani 和 Cupp 报道9,10 Anopheles gambiae 首次由 Ivanova-Kazas 描述11 并由 Goltsev 及其同事进一步阐述，12,13 和 致倦库蚊 由 Davis 报道。14 所述时间进程仅作为收集特定发育阶段胚胎的初步估算，而非绝对的时间点。
2. 脱卵壳、固定及内壳膜破坏
- 将胚胎从收集容器转移到Saatilene网状去壳捕获管中（图3）。
对于Aedes胚胎，将捕获管放入盛有足够蒸馏水的烧杯中，使捕获管体积约一半浸没在水中。可使用艺术毛笔将胚胎从Saatilene网膜上轻轻刷下，并转移至盛水的捕获管中。
对于Anopheles胚胎，将Saatilene网膜从收集容器上取下，并小心折叠成漏斗状。一手持网状漏斗，另一手用聚乙烯洗瓶沿漏斗壁缓慢冲洗蒸馏水，将胚胎冲入捕获管中。此方法适用于Anopheles胚胎，因为其表面缺乏Aedes胚胎所具有的黏性物质，而该物质可使卵附着于产卵基质上。 - 配制40 ml去壳溶液（1体积5.25%次氯酸钠：3体积蒸馏水）。将溶液倒入100 mm培养皿中。
- 准备一个100 ml烧杯，加入50 ml蒸馏水，备用。去壳步骤对时间敏感，在次氯酸钠处理后需立即将胚胎浸入此水中，以稀释去壳溶液。
- 将装有胚胎的网状捕获管置于盛有去壳溶液的培养皿中进行去壳处理。使用一次性聚乙烯移液管或巴斯德吸管冲洗胚胎，同时轻轻旋转捕获管，使胚胎持续浸没并搅动于去壳溶液中。
Aedes胚胎的去壳时间最长不超过35秒，而Anopheles和Culex胚胎则需75秒即可（表3）。去壳是本实验方案中最敏感的步骤之一，尤其是对Aedes胚胎而言，若次氯酸钠处理时间过长，将导致卵壳无法正常破裂。 - 立即把捕获管浸入盛水的烧杯中。
- 将捕获管从盛水烧杯中取出，用装有蒸馏水的洗瓶或连接软管的水龙头冲洗捕获管内外壁，以去除残留的去壳溶液。
- 可在体视显微镜下低倍观察胚胎，以验证去壳效果。Aedes去壳胚胎失去网状外壳膜，仅可见黑色内壳膜光滑、有光泽的表面；而去壳后的Anopheles胚胎则不再具有外壳膜的浮泡和脊状结构（图4）。
- 使用艺术毛笔将去壳后的胚胎转移至含有5 ml蒸馏水的闪烁瓶中（图5-1）。若同时处理多个样品，应将捕获管保持在水中，以防胚胎干燥。
- 让胚胎沉降至闪烁瓶底部，并尽可能吸除瓶中水分。
- 向闪烁瓶中加入5 ml正庚烷（图5-2）。去除闪烁瓶中残留的水分。
- 向闪烁瓶中加入5 ml新配制的胚胎固定液（表1）。
- 固定30分钟，期间轻轻颠倒混匀，使有机相与水相充分混合，但避免剧烈震荡。
- 使用玻璃巴斯德吸管小心移除固定液，注意不要扰动含有胚胎的界面层（图5-3）。
- 尽可能向闪烁瓶中加入蒸馏水以清洗残留固定液，颠倒混匀5次后，彻底吸除所有蒸馏水。
- 向闪烁瓶中加入20 ml蒸馏水，颠倒混匀30分钟。
- 彻底吸除闪烁瓶中的水分。
- 向闪烁瓶中加入足量沸腾的蒸馏水，使有机相（正庚烷）升至瓶口顶部。
- 孵育30秒后，立即移除所有沸水。
- 加入冰冻蒸馏水至有机相升至瓶口顶部。将闪烁瓶置于冰上孵育10分钟。
- 先移除水相，再移除有机相。此时正庚烷将呈现不透明状（图5-4）。
- 向瓶中加入5 ml新鲜正庚烷。彻底去除瓶中残留水分。
- 向瓶中加入5 ml甲醇。剧烈旋转1–2次，但不要震荡（图6）。若剧烈震荡使正庚烷（水相）与甲醇（有机相）充分混合，将在内壳膜破裂过程中破坏胚胎。值得注意的是，我们观察到不同品系的Aedes aegypti胚胎在内壳膜破裂效率上存在差异。
- 室温孵育15–20分钟。在此阶段，由于卵黄成分释放，两相将变得浑浊（图5-5）。
- 移除有机相和水相，并用甲醇洗涤3次，以彻底去除残留的正庚烷。
- 胚胎可在-20 °C甲醇中保存数月。
3. 剥离
- 在直径3 cm的培养皿中央贴上一条双面假发胶带。使用假发胶带是因为其黏合剂在甲醇和乙醇存在下保持稳定。
- 使用大孔径（直径约3 mm）的200 μl移液枪头，将胚胎从甲醇中转移至双面胶带上。
- 静置1–2分钟，使胚胎沉降并黏附于胶带表面。
- 倾去多余的甲醇，并让表面略微干燥1–2分钟。
- 向培养皿中加入4 ml 95%（190 proof）乙醇。
- 用移液器加入600 μl蒸馏水至乙醇中，轻轻涡旋混匀。此时胶带颜色会变为不透明。加入蒸馏水可使胶带表面变黏，有助于在剥离过程中固定胚胎。此步骤可根据需要省略。
- 使用连接在1 ml注射器筒上的27.5号针头剥离破裂的内壳膜（图7）。在将白色胚胎从黑色的内壳膜残余物中释放后，用细头艺术画笔将胚胎从胶带上转移至培养皿中的乙醇储存区。再使用直径3 mm的移液枪头，将胚胎转移至含有500 μl 200 proof乙醇的Ambion 1.5 ml微量离心管中。
剥离后的胚胎不应长时间停留在胶带上，以免永久黏附。 - 用100%（200 proof）乙醇快速洗涤2–3次，随后将胚胎保存于无水乙醇中，置于-20 °C。剥离后的胚胎可在-20 °C下保存数月，其形态及后续杂交信号不受影响。
4. 卵黄澄清
- 用200 proof乙醇进行快速洗涤。后续所有洗涤步骤及P-二甲苯卵黄澄清液的配制均应使用高纯度乙醇。
- 用乙醇洗涤一次，于旋转振荡仪上孵育5分钟。
- 在P-二甲苯/乙醇（9:1）溶液中室温孵育1–1.5小时，并持续旋转振荡。该二甲苯步骤可澄清卵黄团块，从而提高信噪比。
- 移除二甲苯-乙醇溶液，并用乙醇快速洗涤两次。
- 用乙醇洗涤一次，于旋转振荡仪上孵育5分钟。
- 用甲醇快速洗涤两次，随后用甲醇洗涤一次，于旋转振荡仪上孵育5分钟。
- 通过甲醇/4%甲醛固定液（1:1）洗涤一次，使样本平衡至4%甲醛固定液中。
5. 固定与杂交 原位
固定与杂交 原位 步骤与方案A部分所述相同。
C. 代表性结果
杂交 原位 此处所述方案可产生有色染色模式，指示靶标 mRNA 的存在及其定位。需要强调的是，转录本丰度的相对水平无法通过杂交方法确定。 原位杂交结果取决于杂交过程中所用的特异性mRNA探针、杂交组织中靶mRNA的丰度，以及探针浓度和杂交温度。通过比较使用反义mRNA探针和相应正义mRNA探针杂交的组织，可实现对染色模式的准确解读。
杂交 原位 埃及伊蚊雌蚊唾液腺整体原位杂交结果显示，靶向淀粉酶1（amylase1, AAEL006719）、D7s2（AAEL006423）和D7L2（AAEL006424）的mRNA探针分别在近端侧叶、远端侧叶以及远端侧叶/中叶区域有转录本积累（图8).1 三种蚊子的完整卵巢与特异性靶向各自oskar直系同源转录本的mRNA探针进行杂交图9).7,8 杂交 原位 整体胚胎的 埃及伊蚊, An. gambiae 和 Cx. quinquefasciatus 使用靶向相应蚊虫的反义RNA探针进行 oskar 直系同源转录本 (图10).7,8
图1. 杂交后封片装置的示意图。
图 2. 样品封片过程中使用的 Kimwipe 擦拭棒的制备方法。 将 Kimwipe 纸巾紧密扭转，制成细尖的擦拭棒，用于吸除样品和载玻片上多余的封片介质。
图 3. Saatilene 网格去壳捕获管示意图。 A) 将一个 50 ml 聚苯乙烯锥形管底部切除，得到一个长度为 4.5 cm、两端开口的中空管。在锥形管盖上切出一个圆形开口，以便液体通过一块面积为 6.5 cm2 的方形 Saatilene 网格。该网格每英寸有 330 根丝线，丝线直径为 34 微米，可截留蚊子胚胎。B) 组装好的捕获管。
图 4. Aedes aegypti 和 Anopheles gambiae 蚊卵在去壳前后的形态。A) 去壳前的 Aedes aegypti 蚊卵。网状的外壳膜位于黑色内壳膜之上，使卵表面呈现纹理状外观（插图为放大图像）。去除外壳膜后，仅剩下光滑且有光泽的内壳膜（B 及插图放大图像）。C) 去壳前的 Anopheles gambiae 蚊卵。可见外壳膜结构，如浮器（箭头所示）。D) 去壳后可见内壳膜光滑且有光泽的表面。标尺 = 100 μm。
图 5. 埃及伊蚊（Ae. aegypti）卵固定及内 chorion 层破坏的连续步骤示意图。A) 倾斜前视图和 B) 侧视图，显示在固定和内 chorion 层破坏过程中含有埃及伊蚊（Ae. aegypti）卵的闪烁小瓶。1) 胚胎置于蒸馏水中。2) 胚胎漂浮于上层庚烷相与下层水相之间的界面处。3) 固定后，胚胎聚集形成圆形团块，仍位于庚烷相与固定液相之间的界面。4) 经沸水处理并在冰上孵育后，庚烷相变得略微浑浊。5) 内 chorion 层已被破坏的胚胎位于浑浊的庚烷相与透明的甲醇相之间的界面处。
图 6. 固定的埃及伊蚊（Ae. aegypti）卵的内 chorion 层破坏。A) 在剧烈涡旋庚烷和甲醇相后，可立即观察到气泡的形成以及内 chorion 层的破坏。B) 在室温下孵育五分钟后的结果。
图 7. 去除内壳膜并破坏后的蚊卵。 埃及伊蚊（Ae. aegypti）（A）、冈比亚按蚊（An. gambiae）（B）和致倦库蚊（Cx. quinquefasciatus）（C）的卵在固定及内壳膜破坏后，可见白色半透明的胚胎位于破裂的内壳膜内。去除内壳膜后，埃及伊蚊（Ae. aegypti）（D）、冈比亚按蚊（An. gambiae）（E）和致倦库蚊（Cx. quinquefasciatus）（F）的半透明胚胎清晰可见。比例尺 = 100 μm。
图8. 杂交反应 原位 在整体雌性不同叶中表达的三个基因 埃及伊蚊 唾液腺染色表明定位和积累情况 amylase1 (AAEL006719) (A)、D7s2 (AAEL006423) (B) 和 D7L2 (AAEL006424) (B)。比例尺 = 100 μm.
图9. 杂交 原位 用于蚊子 oskar 对完整蚊子卵母细胞和滋养细胞进行反义RNA探针检测. 从卵巢中分离的IV期卵母细胞（ooc） An. gambiae （A）， 埃及伊蚊 （B）和 Cx. quinquefasciatus （C）并与靶向相应蚊虫的 RNA 探针杂交 oskar mRNAs。初级卵泡的朝向为左侧为前端。在后极的染色（蓝色箭头）表明有累积的 oskar mRNAs。图中显示次级（f2）和三级（f3）卵泡，染色信号（黑色箭头）表明oskar mRNA在滋养细胞胞质（ncc）中的聚集，而滋养细胞核（ncn）区域无染色信号。比例尺 = 50 μm.
图10. 杂交 原位 用于蚊子 oskar 对蚊子胚胎整体进行反义RNA探针检测胚胎的前端位于左侧。囊胚期细胞阶段的胚胎 An. gambiae （A）和 Cx. quinquefasciatus （C）与相应蚊种特异性的 oskar RNA探针。B）合胞胚层囊胚期 埃及伊蚊 胚胎经靶向RNA探针杂交 埃及伊蚊 oskar 转录本。所有胚胎的后极细胞中均可见染色，表明蚊子中该转录本的定位与积累 oskar 这些细胞中的 mRNA。比例尺 = 50 μm.
表1. 用于甲醛凝胶电泳、固定和杂交的溶液与缓冲液 原位.
表 2. 蚊子胚胎发育连续阶段对应的发育事件和形态学观察结果。
表 3. 不同组织类型在杂交前步骤中的关键差异总结。
讨论
杂交 原位 此处介绍的针对完整蚊虫组织和胚胎的比色染色方案，是一种用于定位特定器官和细胞类型中转录本的有用技术。这些操作步骤相较于我们先前报道的方法有所改进，不仅简化了繁琐的洗涤步骤，还提供了更详尽的技术细节和试剂来源信息。
根据我们的经验，与基于荧光的检测方法相比，比色法检测杂交信号在灵敏度和信号清晰度方面更具优势。此外，比色法可避免胚胎本身具有自发荧光所带来的信号分辨问题。当靶向低丰度转录本且出现明显背景染色时，杂交信号的检测会受到限制。将杂交温度提高至 65 °C 可降低背景杂交信号，但不能替代设计特异性靶向的唯一RNA探针这一关键步骤。
该方案已用于执行杂交 原位 埃及伊蚊唾液腺整体装片，以及卵巢和胚胎的 冈比亚按蚊，斯氏按蚊，埃及伊蚊 和 致倦库蚊该方法也适用于其他蚊虫组织，可能还适用于其他昆虫的组织。此外，我们首次编制了三种媒介蚊虫胚胎发育分期的比较指南， 埃及伊蚊、冈比亚按蚊和白纹伊蚊已有针对这三种物种特定品系在特定饲养条件下的观察报道。需要注意的是，不同蚊虫品系的发育时间进程可能因品系差异以及饲养条件不同而有所变化。杂交实验 原位 补充正在进行的蚊子及其他节肢动物转录组分析工作，可能为这些生物中基因表达调控提供更全面的认识。
致谢
作者感谢 Marika Walters 在开发杂交技术方面提供的建议 原位 软组织方法及Yury Goltsev对杂交实验方案的讨论 原位 的 Anopheles gambiae 胚胎，随后经过调整和修改，用于建立本文所述的杂交实验方案 原位 的 伊蚊 和 库蚊 胚胎。我们还感谢Adam Paré和David Kosman提供的有益建议。感谢Osvaldo Marinotti参与科学讨论并对实验方案文本进行编辑。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 M EDTA | Ambion | AM9261 | |
| 1M Tris-HCl | Ambion | AM9855G | pH8.0 |
| 10X PBS | Ambion | AM9625 | |
| 20X SSC | Ambion | AM9763 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | Ambion | AM12400 | 比标准管更透明，便于观察样品 |
| 去离子甲酰胺 | Ambion | AM9342 | 4 °C 保存 |
| DEPC 水 | Ambion | AM9932 | |
| 蛋白酶 K | Ambion | AM2546 | |
| 5.25% 次氯酸钠 | Austin’s | A-1 品牌 | |
| T3 RNA 聚合酶-Plus | Ambion | AM2733 | -20 °C 保存 |
| T7 RNA 聚合酶 | Ambion | AM2082 | -20 °C 保存 |
| 95% 乙醇 | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Fisherbrand 一次性聚乙烯移液管 | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 37% 甲醛 | Fisher Scientific | F79-500 | |
| 高效液相色谱级甲醇 | Fisher Scientific | A452-1 | |
| 氯化镁 | Fisher Scientific | M87-500 | |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12-542A | 18 × 18 mm |
| 正庚烷 | Fisher Scientific | H350-1 | |
| 对二甲苯 | Fisher Scientific | O5082-500 | |
| Pyrex 9 孔点样板 | Fisher Scientific | 13-748B | 100 × 85 mm |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | AC32730-0025 | |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Superfrost/Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25 × 75 × 1.0 mm |
| Davlyn 红色透明衬里假发胶带 | Hair Direct | RED-75R12 | 聚酯/皮肤基材，0.75 英寸 × 12 码卷 |
| TOPOTA 克隆试剂盒（用于测序，含 One Shot Top10 化学感受态 E. coli） | Invitrogen | K457501 K457540 | 20 次反应 40 次反应 |
| 超声处理的鲑鱼精子 DNA | Invitrogen | 15632-011 | -20 °C 保存 |
| 抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段 | Roche Applied Science | 1093274 | 4 °C 保存 |
| DIG RNA 标记混合物 | Roche Applied Science | 1277073 | -20 °C 保存 |
| NBT/BCIP 储存液 | Roche Applied Science | 1681451 | 4 °C 保存 |
| Western 封闭试剂 | Roche Applied Science | 11921673001 | 4 °C 保存 |
| Saatilene Hitech 聚酯网（330.130） | Saati Print | 330.34 UO PW | 330 根/英寸，34 微米丝径，橙色 |
| 甘油 | Sigma | G6279-1 | PBT 中 70% |
| 肝素钠盐 | Sigma | H3393 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500 | |
| 37% 甲醛 | Ted Pella | 18508 | 10 ml 棕色安瓿瓶分装 |
| 16 盎司带盖 Solo 纸容器 | The Paper Company | SOLOKH16AJ8000 | |
| 带未固定螺旋盖的硼硅酸盐玻璃闪烁小瓶 | VWR International | 66022-128 | 20 ml，每箱 500 个 |
| Sealed Air 气泡膜蜂窝缓冲材料 | VWR International | 500018-081 | 每卷 10 英尺，厚度 0.188 英寸 |
| 鸡血清 | 从幼鸡的翅静脉或心脏穿刺采集全血。血液在 37 °C 孵育 1 小时至凝固，然后冰上放置 30 分钟。收集血清，3000 × g 离心 10 分钟。收集上清液（澄清血清），-20 °C 保存备用。 | ||
| 表 4. 原位杂交专用试剂与设备表 in situ。 |
参考文献
- Juhn, J. Spatial mapping of gene expression in the salivary glands of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Parasit. Vectors. 4, 1(2011).
- Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. (5), e228(2007).
- Benedict, M. Q. Dissecting Plasmodium-infected Mosquitoes: Salivary Glands, Chapter. 5.4.2. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). (2007).
- Sappington, T. W., Brown, M. R., Raikhel, A. S. Culture and analysis of insect ovaries, Chapter. 42.3. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A methods manual. , Chapman & Hall. London. (1997).
- Goltsev, Y., Hsiong, W., Lanzaro, G., Levine, M. Different combinations of gap repressors for common stripes in Anopheles and Drosophila embryos. Dev. Biol. 275, 435-446 (2004).
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- Juhn, J., James, A. A. oskar gene expression in the vector mosquitoes, Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 15, 363-372 (2006).
- Juhn, J., Marinotti, O., Calvo, E., James, A. A. Gene structure and expression of nanos (nos) and oskar (osk) orthologues of the vector mosquito, Culex quinquefasciatus. Insect Mol. Biol. 17, 545-552 (2008).
- Raminani, L. N., Cupp, E. W. Early Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Int. J. Insect Morphol. & Embryol. 4, 517-528 (1975).
- Raminani, L. N., Cupp, E. W. Embryology of Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae): Organogenesis. Int. J. Insect morphol. & Embryol. 7, 273-296 (1978).
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- Papatsenko, D., Levine, M., Goltsev, Y. Clusters of temporal discordances reveal distinct embryonic patterning mechanisms in Drosophila and Anopheles. PLoS Biol. 9, e1000584(2011).
- Davis, C. W. C. A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilla seriata Meigen (Diptera: Calliphoridae) I. Description of embryonic development. Aust. J. Zool. 15, 547-579 (1967).
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