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一种经过抛光和加固的减薄颅窗，用于小鼠大脑的长期成像

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DOI：

10.3791/3742

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2012年3月7日

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1Department of Physics, University of California, San Diego, 2Department of Engineering Science and Mechanics, Pennsylvania State University , 3Department of Neurosurgery, Pennsylvania State University , 4Section of Neurobiology, University of California, San Diego

本文内容

摘要

我们介绍一种在小鼠颅骨上制备成像窗口的方法，该窗口可跨越数毫米，并且在数月内保持稳定，且不会引起脑部炎症。该方法非常适合利用双光子显微镜进行血流、细胞动态以及细胞/血管结构的长期研究。

摘要

在不破坏颅内环境的前提下，对皮层功能进行活体成像需要实现对脑组织的光学通路。本文介绍一种在小鼠颅骨上制备抛光加固的薄颅骨（PoRTS）窗口的方法，该窗口直径可达数毫米，且可稳定维持数月。通过手持钻头将颅骨磨薄至10至15 μm以实现光学透明，随后覆盖氰基丙烯酸盐胶水和盖玻片，以达到以下目的：1）提供机械刚性；2）抑制骨组织再生；3）减少骨表面不规则结构引起的光散射。由于颅骨未被穿透，可能影响研究过程的炎症反应显著降低。使用双光子激光扫描显微镜可实现皮层表面下深达250 μm的成像。该窗口适用于在麻醉或清醒状态下研究脑血流及细胞功能。此外，该方法还可结合光遗传学技术调控细胞活性，或通过照射循环中的光敏剂选择性阻断目标血管的血流。

方案

1. 手术准备 i

  1. 使用超声波清洗机，在Maxizyme和Surgical Milk的混合液中对手术器械进行超声清洗。每次实验前对手术器械进行高压灭菌。
  2. 确保所有必要的试剂和一次性耗材均已备齐。试剂和一次性耗材清单见表2。尽可能使用无菌的、会接触暴露组织的试剂和耗材。
  3. 诱导麻醉。适用于存活实验的典型麻醉剂见表1。通过检查足趾夹捏反射是否消失来确认动物已达到手术麻醉水平。小鼠的最佳年龄为3至6周。较年幼小鼠的颅骨较软且更难变薄，而较年长小鼠的颅骨较厚，在变薄过程中更容易出血。
  4. 将动物固定在立体定位仪中1。手术设备清单见表2。
  5. 使用反馈调节的直肠探针和加热垫维持动物体温在37°C。
  6. 在眼睛上涂抹眼用软膏以保持湿润。
  7. 使用小型电动剃刀剃除头皮毛发。
  8. 用碘伏清洁头皮，随后用70%（v/v）异丙醇擦拭。
  9. 如有需要，可使用脉搏血氧仪检测心率和呼吸率是否处于正常范围。对于小鼠，心率和呼吸率应分别约为10 Hz和2 Hz。
  10. 将一份无菌过滤的人工脑脊液（ACSF）预热至37°C（125 mM NaCl, 10 mM葡萄糖, 10 mM HEPES, 3.1 mM CaCl2, 1.3 mM MgCl2, pH 7.4）（所有化学试剂均来自Sigma）2。

2. 安装头架

  1. 使用镊子和手术剪将整个颅骨背侧表面的头皮去除。沿颅骨两侧颞肌边缘及颈部肌肉后方修剪皮肤（图 1A）。
  2. 使用手术刀片去除颅骨表面的薄层骨膜。
  3. 用湿润的棉签清洁颅骨，并用除尘罐中的气流吹干颅骨表面。随后在整个颅骨表面涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水。待胶水完全干燥。此胶水层对于后续步骤中牙科水泥的牢固粘附至关重要。氰基丙烯酸酯胶水无需灭菌。
  4. 将一个金属连接器固定在颅骨表面，位置应避开拟开窗区域。对于麻醉状态下的实验准备，可在颅骨上用少量氰基丙烯酸酯胶水固定一个小螺母，之后可通过螺栓将其旋入成像装置（图 1B、1L 和 1N）。在将螺母粘附到颅骨前，应使用胶带封住其背面螺纹部分，以防胶水渗入螺纹。螺母和胶带应在手术前通过高压灭菌法进行灭菌。
  5. 对于清醒动物成像准备，应使用具有两个固定点的更 rigid 的定制连接器（图 1M 和 1N）。在对侧大脑半球颅骨上使用½ mm钻头钻出两个孔，然后插入两枚#000自攻螺钉。这些螺钉有助于将头部固定装置锚定于颅骨上。每枚螺钉仅旋转一圈，以避免对下方皮层施加压力。随后，在小脑上方用少量氰基丙烯酸酯胶水固定定制的金属横杆。待氰基丙烯酸酯胶水完全干燥。该金属连接器显著减少了自由度，便于在纵向研究中重新定位相同的成像区域。较宽的横杆为电极放置和触须刺激提供了充足空间。生成该定制头部固定装置及连接器件的详细方案可在线获取（http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html）。螺钉和横杆应在手术前通过高压灭菌法进行灭菌。
  6. 除开窗位置外，用一层牙科水泥覆盖整个颅骨表面（图 1C 和 1D）。确保所有暴露的皮肤边缘均被水泥覆盖。牙科水泥的各组分无需灭菌。

3. 抛光并加固的薄颅窗（PoRTS）制备

  1. 确保钻头锋利，避免重复使用。使用牙科钻机的低速档，用½ mm钻头在体感皮层上方区域磨薄一块2 mm × 2 mm的颅骨。交替使用人工脑脊液（ACSF）润湿颅骨表面，然后用气体除尘器的轻柔气流吹干；润湿用于降温，吹干有助于进一步减薄。此过程需磨除颅骨的松质骨层，该层可能出血，但可通过冲洗ACSF加以控制（图1E）。当颅骨厚度约为50 μm时，在钻头轻微压力下会开始出现弹性变形，此时应能透过湿润的骨片观察到软脑膜血管（图1F）。在此厚度下，当干燥的颅骨表面被润湿后，骨内会出现持续数秒的小白点。
  2. 此时需进一步减薄骨片。使用更慢的钻速（即1000 rpm），仅以极轻的接触力对颅骨表面进行刮削。手持钻机如执笔状，进行小范围、可控的移动，仅施加横向力。最终骨片厚度应约为10至15 μm（图1G）。当骨片足够薄时，干燥颅骨表面润湿后将不再出现小白点。
  3. 用氧化锡粉末抛光窗口区域。安装一个预先制备的钻头，该钻头曾浸入硅酮水族密封胶后抽出，形成锥形刷头（插图，图1H）。硅胶刷头应至少在手术前一天制备，并在使用前用70%异丙醇灭菌。在窗口处放置少量粉末，并加入一滴ACSF（图1H）。通过轻轻将旋转中的刷头尖端接触颅骨表面，搅动悬浊液持续最多十分钟。用ACSF彻底冲洗掉窗口上的氧化锡粉末，并用轻柔气流彻底吹干骨面。钻孔过程中遗留的表面不平整和附着骨屑应在抛光后被清除（图1H和1I）。氧化锡粉末无需灭菌。
  4. 裁剪略小于窗口尺寸的0号盖玻片成方形。使用划线器配合直尺，在盖玻片上轻轻划出相互垂直的水平线和垂直线。然后将盖玻片放入培养皿中，轻敲培养皿边缘使其沿刻痕断裂分离。整个培养皿可进行高压灭菌以确保无菌。
  5. 将合适大小的盖玻片放置在已干燥的窗口附近。用折断的木质棉签尖端蘸取少量氰基丙烯酸酯胶水，滴于窗口上，迅速将预裁的盖玻片压在胶水上。避免在盖玻片下方产生气泡。轻轻按压盖玻片使其紧贴颅骨表面，并保持数秒（图1J和1O）。让胶水充分干燥15分钟。胶水干燥后，可用手术刀片刮除盖玻片上表面多余的氰基丙烯酸酯。用牙科水泥密封盖玻片边缘，并构建一个略凸起的储液井，用于容纳浸没式物镜的液体（图1K和1O）。

4. 恢复

  1. 手术后将动物置于温暖的笼子中。定期监测动物，直至其完全从麻醉中恢复。
  2. 如果准备让动物存活超过一天，需给予丁丙诺啡（每克啮齿类动物0.03 μg）以镇痛。我们通常在初次植入后至少一天再对动物进行成像。

5. 成像准备

  1. 将动物固定在用于成像的光学面包板上，使用框架作为头部支撑（图 1L 和 1M）。限制装置可使用 Qioptiq 或 ThorLabs 公司提供的商用光学机械组件制作。我们的独立载板可在动物与所有生理监测设备组装为一个整体单元后，在手术室与双光子成像室之间转运3。
  2. 若需进行血流成像，可在全身麻醉下通过尾静脉或眶下静脉注射 0.05 mL 5%（w/v）荧光标记葡聚糖染料（溶于无菌生理盐水），以标记血液血清（图 2A 及 2C 至 2H）4-7。初学者可优先选择眶下静脉给药，因为葡聚糖溶液黏度较高，操作更易。在深色毛发小鼠中，尾静脉较难定位，且在注射失败后静脉容易塌陷。若需进行绿色荧光成像，可使用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖；若需红色荧光成像，则使用德克萨斯红标记的葡聚糖。使用高分子量葡聚糖时，染料可在循环系统中保留数小时。此外，也可直接在适当的双光子激发波长下对具有内源性荧光标记的动物进行成像。葡聚糖溶液可分装后冷冻保存，以备后续使用。
  3. 使用湿润的棉签轻轻清洁窗口表面。
  4. 对麻醉状态下需长时间成像的动物，应每隔 2 小时以每克体重 3 μL 的剂量腹腔注射无菌乳酸林格液，以维持体液和能量需求。
  5. 对清醒动物进行成像时，每次头部固定时间应限制在数小时内，以降低应激水平。成像间歇期间应将动物放回饲养笼，供其进食饮水。

6. 代表性结果

成功的窗口将允许成像深度达到 250 μm 软脑膜表面下方数月。该方法已被用于研究 体内 毛细血管血流 4, 8小胶质细胞活化 8, 9以及皮质实质内的树突结构 8以一个实例为例，我们采用双光子成像技术展示经静脉注射Texas Red葡聚糖标记血液血清后，麻醉状态下Thy1-黄色荧光蛋白（YFP）小鼠的皮层血管结构。图 2A）。硬脑膜中的血管通常可见于皮层表面稍上方的硬脑膜内（图2C，箭头。大的软脑膜小动脉和小静脉位于大脑皮层表面 （图 2D））。穿通血管由此表面网络分支并深入皮层，在皮层内进一步分枝形成致密的毛细血管网，为皮层组织提供血液供应（图2E至图2H）。可同时在第二通道中成像该小鼠品系内源性表达的深部YFP标记皮层神经元的树突树 10 (图2B至图2H）。骨组织的二次谐波信号在一个第三通道中被收集，可用于在采集图像堆栈后评估颅骨减薄的厚度（图2A至图2C).

皮层血管动态受到麻醉剂的显著影响11。在第二个示例中，我们展示了一段通过双光子显微镜从一只已适应的清醒小鼠采集的自发性血管活动视频。可见软脑膜小动脉的管腔直径出现明显的血管运动振荡，而邻近的小静脉则无此现象。这种基础状态下的血管活动在乌拉坦麻醉下会减弱4。为了定量分析血流的自发性和诱发性变化，我们采用改进的线扫描技术，同时捕捉单个血管的管径和红细胞流速。有关使用双光子显微镜进行定量血流成像的详细资源可参见文献3, 12。

啮齿类动物PoRTS颅窗制备；分步手术示意图及实验装置。
图 1. PoRTS颅窗制备流程。（A 至 K） 生成PoRTS颅窗操作步骤的连续示意图。详细操作说明见正文。β = 前囟，λ = 后囟。（L）用于固定麻醉状态下动物头部进行成像的螺栓与螺母固定系统。（M）专为清醒动物制备设计的定制加工十字横杆头固定装置。本示例中还植入了一个连接器，用于重复进行皮层脑电图记录。（N）示意图显示头固定装置的背侧视图及各组件位置。L图中使用的螺母可作为M图中十字横杆的替代方案。在使用十字横杆固定时，额外添加两枚#000自攻螺钉，以增强清醒动物成像时的稳定性。（O）PoRTS颅窗横截面的示意图。

血管和树突结构成像；共聚焦显微镜；颅骨深度图；实验结果。
图 2. 小鼠皮层中血管系统与神经元结构的双光子成像。所有图像均通过 Thy1-YFP 转基因小鼠植入 PoRTS 窗口后第 2 天采集10。冠状面方向上 150 μm 组织厚度的最大投影图像，显示了颅骨变薄区域与血管系统（A）及树突（B）之间的关系。骨组织（蓝色）通过采集激发波长为 900 nm、发射波长为 450 nm 的二次谐波荧光信号检测得到8。血管系统（红色）通过静脉注射 70 kDa Texas Red 葡聚糖标记6。神经元的树突区域（绿色）来自 Thy1-YFP 转基因小鼠品系内源性表达。（C-H）水平方向上不同皮层下深度处 50 μm 组织厚度的最大投影图像，数据来源于 A 和 B 图所示的同一图像序列。硬脑膜血管可能出现在皮层表面稍上方（C 图中的箭头）。

缩写

ACSF = 人工脑脊液
PoRTS = 抛光并加固的减薄颅窗
YFP = 黄色荧光蛋白

i确保所描述的操作程序已获得您所在机构的动物护理和使用委员会批准。

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讨论

通过PoRTS窗口进行双光子成像需要激光穿透变薄的颅骨和硬脑膜，这会在较大深度处导致激光衰减并引入光学像差 8然而，尽管存在这一缺点，使用900 nm激发光仍可实现距软脑膜表面下深达250 μm的成像深度。原则上，采用更长的激发波长可能实现更大的成像深度。 13该方法的一个主要优势在于避免了可能出现于全颅骨开颅术中的短暂性皮层炎症。 14, 15一个制备良好的PoRTS窗口在植入后应无明显的血管生成或炎症迹象 8。这可以通过以下方式评估 体内 通过成像血管结构，或通过检测CX(3)CR1-GFP小鼠品系中小胶质细胞的形态学变化，在实验过程中进行观察 8, 16, 17此外， 事后检验 应通过免疫组织化学检测确认浅层皮质中无星形胶质细胞增生，例如使用胶质纤维酸性蛋白抗体 8.

在制备PoRTS窗口的过程中，最具挑战性的步骤是将颅骨减薄至10到15 μm的厚度。在减薄过程中，定期使用宽场荧光解剖显微镜观察窗口区域，有助...

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致谢

本工作由美国心脏协会（对AYS的博士后奖学金）和美国国立卫生研究院（DK获得的项目编号MH085499、EB003832和OD006831）资助。我们感谢Beth Friedman和Pablo Blinder对稿件提出的修改意见。

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