放射性 原位 用于检测组织中多样化基因表达模式的杂交技术

摘要

本方案已成功用于定量检测多种脊椎动物组织类型中 mRNA 表达的水平和空间分布模式。该方法能够检测低丰度的转录本，并可同时处理数百张切片。本文以鸟类胚胎脑发育过程中的表达谱分析为例介绍该方案。

摘要

了解基因表达的时间、水平、细胞定位及表达的细胞类型，有助于我们理解基因的功能。上述每项特征均可通过以下方法实现 原位 与细胞内mRNA的杂交。本文介绍了一种放射性标记方法 原位 根据Clayton方法改良的杂交法 等 (1988)¹ 在我们实验室已成功应用多年，尤其适用于成年脊椎动物大脑^2-5长链互补RNA（cRNA）探针可针对目标序列实现对低丰度转录本的检测^6,7. 将放射性核苷酸掺入cRNA探针可进一步提高对低丰度转录本的检测灵敏度，并可通过感光X射线胶片或组织切片上涂布的乳胶膜进行定量分析。这些检测方法可提供目标基因表达的长期记录。与非放射性探针方法（如DIG标记）相比，放射性探针杂交方法无需使用HRP抗体和/或TSA试剂盒进行多步信号放大即可检测低丰度转录本。因此，该方法在信号强度与靶向mRNA含量之间具有线性关系，适用于定量分析。该方法可同时处理100–200张载玻片，适用于胚胎不同发育阶段的研究。目前大多数胚胎发育阶段的基因表达研究采用整体胚胎样本及非放射性检测方法。^8,9部分原因在于胚胎组织比成年组织更为脆弱，细胞间黏附性较弱，导致通过组织切片难以观察到细胞群体之间的边界。相比之下，我们的放射性方法由于具有更广的检测灵敏度范围，能够在不同组织区域间获得更高对比度的基因表达分辨率，从而更易于识别细胞群体间的边界。利用该方法，研究人员可揭示新发现基因的潜在意义，并进一步预测目标基因的功能。

方案

1. 组织制备

1. 采集新鲜组织。对于鸟类胚胎，小心打开蛋壳，将胚胎置于培养皿中，用1×PBS清洗两次。对于成年动物脑组织，迅速取出脑组织，并用1×PBS轻轻冲洗。
2. 将胚胎或成年脑组织置于充满OCT包埋剂的模具中，根据切片需要调整组织方向，然后将模具放入乙醇与干冰混合物中快速冷冻，注意避免混合物进入组织块内部。
3. 在恒冷切片机中将冷冻样品切成10–12 μm厚的切片。对于脑组织和胚胎组织，最佳切片温度范围为-18 °C至-20 °C。
4. 将冷冻切片贴附于超粘附载玻片上。
5. 将切片置于切片盒中，于-80 °C保存。

2. 放射性核糖探针的制备（请遵循您所在机构的辐射安全操作规程）

1. 通过酶切消化含有RNA聚合酶启动子位点的质粒DNA中的克隆片段，或通过将插入片段与RNA聚合酶启动子结合位点相连进行PCR扩增，获得目标cDNA的纯化线性DNA模板。也可设计在3'和5'端包含RNA聚合酶启动子序列的PCR引物，直接扩增出带有启动子的PCR片段。使用GENECLEAN凝胶纯化试剂盒对酶切或PCR产生的片段进行凝胶纯化。
2. 向一个0.5 ml的Eppendorf管中加入0.5–1 μg纯化的线性DNA模板、转录缓冲液、DTT、RNasin、AGC核苷酸混合液以及无RNase的水，调整总体积至所需体积。然后加入S³⁵-UTP和相应的RNA聚合酶，以合成反义或正义核糖探针。
3. 将反应混合物在37 °C水浴中孵育1小时，随后加入另一份等量的RNA聚合酶，继续孵育1小时。
4. 向Eppendorf管中加入3M醋酸钠溶液（总体积的0.1倍）和100%乙醇（总体积的2.5倍），以沉淀合成的RNA核糖探针。
5. 在干冰或-80 °C条件下孵育15分钟以上，或在-80 °C放置超过3小时，以促进沉淀完全。
6. 在4 °C、15,000 rpm条件下，使用台式Eppendorf离心机离心30分钟，收集RNA沉淀。
7. 弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，并用手指轻弹管壁使沉淀充分混匀。
8. 再次在4 °C、15,000 rpm条件下离心30分钟，重新收集RNA沉淀。
9. 用移液器彻底去除上清液，然后加入40 μl杂交溶液，通过反复吹打充分混匀。
10. 取1 μl该溶液加入含有3 ml Safety-Solve溶液的闪烁瓶中，充分混匀后，在闪烁计数器中测定放射性计数。
11. 将含有核糖探针的Eppendorf管置于-20 °C保存，并在一周内使用。

3. 组织处理

1. 在通风橱内，配制新鲜的 PBS 缓冲 4% 多聚甲醛溶液，使其温度约为室温以上 3–5 °C。将存放在 -80 °C 的载玻片置于干冰上的金属架中，转移至通风橱内的操作区域，然后将金属架放入 4% 多聚甲醛溶液中，在室温下孵育 5 分钟。
2. 用 1 × PBS 洗涤 3 次，每次约浸洗 15 下（每下约 1 秒）。
3. 在通风橱内配制乙酰化缓冲液，并在 10 秒内剧烈振荡。立即倒入盛有载玻片架的染色盘中，孵育 10 分钟，以减少核糖探针的非特异性结合背景。
4. 用 2 × SSPE 溶液漂洗 3 次，每次 15 下。
5. 依次在 70%、95% 和 100% 乙醇中进行脱水处理，每步 2 分钟（此步骤无需在通风橱内进行）。
6. 在通风橱内将载玻片干燥至少 10–15 分钟。

4. 杂交

1. 计算核糖探针用量（0.5–1 × 10⁶ 每张载玻片的cpm值）和杂交溶液（100 μ每张载玻片所需量）所有载玻片。将核糖探针-杂交混合液预热至65℃ °在 95°C 下孵育 5 分钟以变性核糖探针。
2. 移液100 μ在载玻片上沿直线加入核糖探针杂交溶液，用玻璃盖玻片将其均匀铺展至组织及盖玻片表面。将载玻片水平放入金属染色架中，保持正面向上，随后缓慢将染色架直立置于65℃ °C油浴至少4小时，最多16小时。油能在盖玻片周围形成气密性密封。
3. 从油浴中取出金属架，并用纸巾擦去金属架周围的多余油渍。
4. 用玻璃或金属托盘中的氯仿将盖玻片和金属架上的油清洗两次。^nd 氯仿洗涤可用于下一次实验的首次处理。
5. 将载玻片架（盖好盖子）转移至含有0.1%的托盘中 β-巯基乙醇 + 2 × SSPE 溶液中上下移动数次，以松动盖玻片并去除溶解的过量杂交溶液。
6. 将载玻片架连同盖好的载玻片转移至新鲜配制的0.1%溶液中 β-巯基乙醇 + 2 × SSPE，然后用无RNase的镊子在溶液中取下盖玻片，以防止划伤组织切片。将去除了盖玻片的载玻片转移至水平载玻片架托盘中的新染色缸架内，放入0.1%溶液中 β-巯基乙醇于2 x SSPE中
7. 将载玻片架放入新鲜的0.1%溶液中孵育 β-巯基乙醇 + 2 × SSPE 溶液，在室温下孵育 1 小时，以去除未结合的过量 RNA 探针。将此溶液及之前的水相洗涤液以及盖玻片作为放射性废物丢弃。
8. 将载玻片架转移至预热的65℃ 2x SSPE溶液中 °C，添加 β-巯基乙醇至终浓度0.1%，并在65℃下孵育 °C 反应 1 小时。作为放射性废物丢弃。
9. 将载玻片架转移至预热的0.1 x SPPE溶液中，在65℃下孵育两次 °每次30分钟，共处理两次。此步骤中去除的放射性物质极少，经过此步骤后不再被视为过量放射性废物。
10. 将玻片架及玻片依次在70%、95%和100%乙醇中各脱水2分钟。
11. 在通风橱中干燥载玻片至少30分钟。

5. 放射性信号的可视化

1. 将干燥的载玻片放入片盒中，在暗室中将X射线胶片（Kodak BioMax MR胶片）覆盖在载玻片上，然后盖上片盒。确保载玻片朝向X射线胶片的乳剂面。根据预期转录本的丰度，曝光时间约为1–7天。
2. 在标准显影液和定影液中显影X射线胶片。杂交信号在胶片上显示为黑色（乳剂层中的曝光银颗粒）（图1）。
3. 1. （可选）为了获得细胞分辨率并观察组织上的信号，需要将载玻片浸入摄影乳剂中并进行复染。如果最终将使用焦油紫（cresyl violet）复染，则需先将切片脱脂：在二甲苯中室温孵育两次，每次5分钟；然后依次在100%、100%、95%、95%、70%和50%乙醇中各再水化1分钟，最后进入去离子水中。如果后续染色所用染料无需脱脂处理，则无需进行脱脂步骤。将载玻片在通风橱中充分干燥至少2–3小时。
   2. 在暗室安全灯下，用玻璃浸渍容器取足量Kodak NTB乳剂，使其足以覆盖载玻片长度的一半（即组织区域），然后在42 °C水浴中融化20–30分钟。随后用蒸馏水按1:1比例稀释。稀释后的乳剂液面应能完全覆盖浸入其中的载玻片上的所有切片区域。若载玻片数量较多，可能需要额外配制乳剂。
4. 将载玻片浸入42 °C水浴中的稀释乳剂中，然后将浸过乳剂的载玻片置于密闭避光容器中，在暗室中过夜干燥，或在37 °C烘箱中避光干燥2–3小时。
5. 将载玻片小心转移至装有干燥器的黑色盒子内的支架槽中，注意避免载玻片相互接触而产生伪影。缓慢用黑色电工胶带密封盒边，以防静电引发光火花，然后用铝箔包裹整个盒子。将盒子置于4 °C保存数天至数周（X射线胶片上1天的信号强度相当于乳剂下曝光约5天）。
6. 将装有载玻片的盒子在室温下回温1小时。
7. 在暗室中，从盒子中取出带载玻片的支架（若使用带槽盒子，则将载玻片放入金属支架中），在16 °C条件下用Kodak D-19显影液显影3.5分钟。
8. 用室温自来水冲洗显影后的载玻片1分钟。
9. 在19 °C条件下，用定影液孵育载玻片两次，每次6分钟。第二次定影孵育期间可打开灯光。
10. 用流动的室温水冲洗载玻片至少30分钟，并在湿润状态下用刀片刮除载玻片背面的乳剂，以防止划伤玻璃。
11. 用自来水配制的0.3%焦油紫溶液染色组织5分钟。
12. 用新鲜自来水漂洗多余的焦油紫溶液，约漂洗15次。
13. 依次在每种酒精溶液中各漂洗约15次进行脱水：50%、70%、95%、95%、100%和100%乙醇。
14. 在室温下将载玻片于二甲苯中孵育两次，每次5分钟。
15. 用Permount封片剂封片，并将封片后的载玻片在通风橱中过夜干燥（>16小时）；需数天后胶体才足够牢固，方可进一步清洁载玻片。

6. 生成暗场彩色图像

1. 如有必要，用清水润湿玻片背面（无盖玻片且无组织的一侧），并用刀片刮除多余的包埋剂，以进一步清洁。
2. 用80%乙醇溶液冲洗玻片，并轻轻擦拭1-2次，以去除碎屑和灰尘。
3. 在暗场或明场照明下拍照。为获得无灰尘颗粒的良好图像（在解剖显微镜下暗场中灰尘颗粒极易观察到），步骤6.2和6.3可能需要重复2-3次。

7. 代表性结果

主要有两种查看方式 原位 组织切片与S探针杂交的结果³⁵ 放射性探针：1）置于载玻片上方的X射线胶片，或2）涂覆于载玻片表面的乳胶膜。第三种方法是使用置于载玻片上方的磷屏成像仪屏幕，但我们对该方法的分辨率不满意。X射线胶片可提供快速结果，并可用于杂交整体状况的分析。X射线胶片数据还具有较宽的解剖学分辨率，可用于定量分析。¹⁰FoxP1 和 CoupTF2 基因表达的反义探针杂交的晚期鸟类胚胎头部X射线胶片图像示例如下 图1A和B这两个基因在特定脑区中均高度富集。优质的X射线胶片结果应清晰锐利（无模糊），且具有高信噪比。图像模糊可能是由于X射线胶片与载有杂交组织的玻片之间接触不均匀所致。

对于乳剂浸镀载玻片，乳剂中含有对光敏感的银盐，这些银盐直接涂布在组织上，而不是像X射线胶片那样位于塑料膜上。在显影过程中，被S³⁵辐射暴露的银盐会转化为金属银颗粒，其原理与X射线胶片类似。然而，这些银沉积物可直接在细胞上方可见，代表基因表达的位置，可在显微镜下进行定性观察和测量。金属银颗粒会阻挡透射光，在明场视野下呈现为黑色斑点。焦油紫复染剂呈紫色（图3A、3C和图4）。在暗场下，银颗粒反射来自侧面的光线，呈现为白色斑点（图1C、1D、3B和3D），此时焦油紫染色呈红色。在明场下，杂交信号在高倍镜下以细胞分辨率更易于观察；而在暗场下，除了高倍观察外，还可于低倍镜下观察整个组织的杂交信号分布。我们通常采用暗场观察来展示整体的基因表达模式。然而，与X射线胶片可快速获得结果相比，乳剂浸镀载玻片所需时间较长（一至数周），且更容易产生背景信号。

强背景信号的常见来源有四种：1）X射线胶片整体出现背景信号，通常是由于显影液或定影液的问题，或胶片部分曝光所致；2）载玻片上的背景信号，通常是由于洗涤不充分或载玻片制备问题引起，例如商业来源或自行制备的载玻片硅烷化处理不当；3）乳胶显影过程中的曝光与显影背景；4）组织切片上的背景信号，可能源于杂交后洗涤步骤操作不仔细、杂交温度过低、杂交液质量不佳、洗涤容器中存在多聚甲醛污染导致探针与组织发生永久性交联、核糖探针降解产生小分子非特异性标记组织、DTT失活或 β-巯基乙醇，导致S的交联³⁵- RNA探针与组织中的二硫键结合，以及乙酰化等待时间过长。在混合乙酸酐与三乙醇胺后数秒内必须将玻片放入乙酰化溶液中。若混合后数分钟内未将溶液加入玻片，则乙酰基团无法被有效去除，导致RNA非特异性结合。其他影响因素包括杂交时间超过20小时，可能导致信号过强；以及玻片上存在过多油滴，在水洗过程中会截留杂交液，造成组织和玻片上出现放射性斑点，产生较深的背景信号。若同时处理大量玻片（超过100张切片），需添加3^rd 氯仿洗涤或更换氯仿洗涤液，以防止过量的油性颗粒残留在切片上。组织处理不当，例如解剖后未能在5–10分钟内迅速冷冻，或发生 thawing 和再冷冻，也会因mRNA降解而增加背景信号。注意不要将背景信号误认为曝光过度。

浸渍载玻片上的乳胶背景可能出现，因为乳胶对光极为敏感，需要在暗处进行长时间曝光。常见的背景问题包括显影液和定影液的温度过高。当温度高于19 °C，接近或高于室温时，会产生更多的银颗粒背景。暗室中有微弱光线泄漏也会导致乳胶背景的产生。定影液冲洗时间不足（在流动水中至少需30分钟），会导致残留的定影液与焦油紫（cresyl violet）反应，在乳胶层中生成棕褐色沉淀。然而，若在固定后、焦油紫染色前，将载玻片在水中冲洗超过90分钟，则可能导致乳胶层松动，切片染色效果变差。如果在固定和洗涤后30至90分钟的时间窗口内无法及时完成染色，可在30分钟洗涤后将载玻片干燥过夜，并于次日继续进行焦油紫染色。通常情况下，大多数mRNA具有特异性的基因表达模式，而背景信号则更为均匀。

组织折叠可能会导致X射线胶片上的基因表达结果出现误导性，表现为信号较深的区域。为确定组织是否发生折叠，可在暗视野下观察未染色切片，或在明视野下观察经焦油紫（cresyl violet）染色的切片。焦油紫复染是评估组织状态的更佳方法。

为了更好地解释探针的特异性，应在多个相邻切片上应用对照意义链探针。大多数意义链探针不显示信号，但部分会显示，当出现信号时，我们发现其分布通常与反义链信号不同。我们认为这可能与反义链的合成过程有关，或与基因组反义链上的另一个基因有关。我们展示了Pax6意义链和反义链探针的示例（图2A和B）。反义链探针显示出预期的信号分布，即在前脑、小脑和眼睛的室管膜区有标记（图2A），而意义链探针则在视网膜的色素层中显示出标记信号（图2B）。

对于探针大小，我们使用的cDNA探针长度范围通常在300-5000 bp之间。小于300 bp的探针也可使用，但信号通常较弱。我们未尝试过大于5000 bp的探针。如果可能，最好使用与组织来源相同物种的探针。若无法实现，则可将探针用于其他物种的组织切片，并根据已知的序列同源性，以3-5 °C为梯度逐步降低杂交和洗涤温度。若序列同源性未知，则需通过试错法确定合适的杂交和洗涤温度。若温度降低过多，cDNA探针可能与不同物种或同一物种中序列相似的其他mRNA发生交叉杂交¹¹。实践中我们发现，当cDNA与组织中靶mRNA序列的同源性约为95%或更高时，采用严格的杂交和洗涤温度（65 °C）条件效果良好。对于序列同源性在约85%至94%范围内的探针，杂交和洗涤温度可能需要降至约50至60 °C的范围内。

在大多数步骤中使用金属架的原因在于会用到氯仿洗涤和二甲苯。这两种有机溶剂会使许多类型的塑料熔化。玻璃和某些类型的塑料对这些有机溶剂具有抗性。但玻璃更容易破碎，而一些起初具有抗性的塑料在长期接触有机溶剂后也会发生熔化。

图1. 来自X射线胶片和涂乳胶载玻片的原位杂交图像的放射自显影。（A-B）使用解剖显微镜在明场照明下拍摄的斑胸草雀胚胎第10天全头矢状切片的X射线胶片图像，分别与针对（A）FoxP1 或（B）CoupTF2 的反义核糖探针杂交。胶片上显示为黑色的曝光颗粒，代表mRNA表达。比例尺 = 500 μm。（C-D）使用解剖显微镜在暗场照明下拍摄的斑胸草雀出壳后第6天全头矢状切片的涂乳胶载玻片图像，分别与针对（C）FoxP1 和（D）CoupTF2 的反义核糖探针杂交。组织上方乳胶中显示为白色的曝光银颗粒代表mRNA表达。红色为焦油紫染色。比例尺 = 200 μm。所有图像中，喙部位于左侧（头端）。X射线胶片曝光时间为1天，涂乳胶载玻片曝光时间为3天。FoxP1探针长度为178 bps，对应mRNA的1544–1711 bp区域；CoupTF2探针长度为545 bps，对应mRNA的1–545 bp区域。可见在前脑中，FoxP1 mRNA在新纹状体（M）、纹状体（St）和背侧丘脑（DT）中富集，而CoupTF2在新纹状体核（N）、弓状皮质（A）以及更腹侧的丘脑区域富集。不同曝光方式（及不同发育阶段）之间的表达模式具有一致性。然而，使用涂乳胶载玻片可获得更高分辨率的标记，组织边界和亚区可被直接识别。本文展示的这些及其他所有图像均来自采用标准65 °C高严谨性杂交条件处理的切片。

图2. 反义链与有义链标记的比较，显示不同的表达模式。（A）Pax6 反义链在脑组织中表达，尤其在脑室区（白色箭头所示）。图中显示的是对胚胎发育第12天的斑胸草雀头部矢状切片进行放射自显影后在X光胶片上的结果。（B）相邻切片使用 Pax6 有义链探针进行杂交，结果显示在整个胚胎头部无背景表达，但在视网膜色素层中可见明显信号（黑色箭头所示），该信号与反义链探针结果一致。虚线表示全脑轮廓。C：小脑。

图3. 原位 斑胸草雀胚胎晚期脑组织切片经乳剂浸蘸后在明场和暗场显微镜下观察到的基因表达信号。（A）胚胎第10天D1B基因表达的明场图像，乳剂正常曝光。在此放大倍数下，标记信号（黑色）几乎不可见。探针为mRNA第1-625位碱基的625 bp片段。（B）与（A）相同的切片和放大倍数，切换至暗场观察，可见纹状体（St）和丘脑（TH）中的标记信号（白色）。（C）胚胎第12天Slit3基因表达的明场图像，乳剂过曝光。标记信号（黑色）清晰可见。探针为mRNA第1243-2021位碱基的779 bp片段。（D）与（A）相同的切片和放大倍数，切换至暗场观察，可见脊髓（SC）中的标记信号（白色），与明场图像结果一致。头端朝左。Cb：小脑。

图4. 细胞水平上的银颗粒分辨率。图中显示了斑胸草雀前脑中FoxP1 mRNA的标记情况，银颗粒（黑色斑点）位于不同脑区和不同年龄阶段的细胞（焦油紫染色）上方，并与图1A和1C中的低倍图像进行比较。（A）成年斑胸草雀新纹状体中部（mesopallium）单个细胞上方的高丰度表达（黑色箭头）。（B）同一组织切片相邻的新纹状体nidopallium区域单个细胞上方的低丰度表达（黑色箭头头）。（C）胚胎第12天（embryonic day 12）新纹状体中部细胞上方的高FoxP1 mRNA表达（黑色箭头）。（D）同一组织切片相邻的nidopallium区域细胞上方的低丰度表达（黑色箭头头）。示例细胞以黄色线条圈出。胚胎期细胞（C和D）较成年细胞（A和B）更小且排列更为紧密。由于细胞与乳胶涂层之间存在一定间隙，因此来自S³⁵探针的曝光银颗粒区域略大于细胞体的实际面积。比例尺 = 10 μm。

讨论

放射性原位杂交技术用于检测mRNA表达，被广泛应用于多种研究目的，包括研究组织的区域结构、细胞类型以及大脑功能活动^2-5,10,12-14。后者主要针对那些在脑中mRNA表达依赖于神经元活动增强的基因，这类基因常被称为活动依赖性基因或即早基因。基于这些应用，我们的方法已成功应用于多种物种，包括鸟类、哺乳动物（例如人类）、鱼类和两栖类；多种组织，包括脑、皮肤和肌肉；以及多个发育阶段，包括初生个体、幼体、成体，以及本文所述的全胚胎切片^2,3,5,15-17。本实验方案的特殊优势包括：（1）在解剖学特异性和定量特异性之间实现了良好平衡。为在X光胶片上对基因表达进行定量，我们拍摄图像的数码照片（例如：图1A和1B），利用Photoshop（Adobe）的直方图功能测量感兴趣区域的像素密度，并减去玻璃载片上组织以外区域的背景信号值^2,4。为在细胞水平上定量表达，我们在高倍镜下（40–100×；图4）拍摄覆盖细胞的银颗粒图像。随后使用美国国立卫生研究院（NIH）Wayne Rasband开发的Image J软件中的阈值和测量功能，统计图像中银颗粒的数量，减去载玻片上无细胞区域的背景计数，再除以细胞数量，从而获得每个细胞的表达值^4,18。（2）具有相对较高的通量，可同时处理100–200张载玻片，这得益于矿物油浴形成的紧密盖玻片密封效果。传统的原位杂交方法需使用Parafilm封膜、指甲油或其他方式密封载玻片，操作耗时且占用空间较大；（3）由于杂交缓冲液中含有硫酸葡聚糖和Denhardt溶液，本方法对低丰度转录本具有高度敏感性^2,13；（4）暗场成像方法可产生高对比度图像，因其在解剖显微镜下采用暗场照明拍摄图像^4,5。此外，该方法能够灵敏地检测基因表达的微小变化，例如通过检测活动依赖性基因的表达，识别在特定行为感知与产生过程中被激活的特定脑区¹⁹。与非放射性原位杂交方法相比，本方法的局限性在于后者在细胞分辨率以及mRNA在细胞内定位方面更为清晰，且乳胶膜操作过程对机械扰动和光照极为敏感。本方法可与其他技术联合使用，例如与非放射性原位杂交结合，以在同一组织中同时标记多个基因的mRNA表达^10,17,20；也可与免疫细胞化学结合，在同一样本中同时标记RNA和蛋白质表达，从而实现mRNA与特定细胞类型的共定位¹⁰。此类双重标记实验所需的方案修改详见所引用的参考文献。

总之，我们的方法有助于理解基因表达的时间和细胞定位，从而阐明区域组织结构、组织功能活性以及基因功能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸酐	VWR	MK242002
氯仿	VWR	BDH1109
醋酸克雷斯紫	Sigma	C5042
冷冻切片机	Thermo scientific	Microm HM550
去离子甲酰胺	Sigma	F9037
DTT	Promega	P1171	100mM
EDTA	Sigma	ED
包埋模具	VWR	15160-215
Fisher品牌 Superfrost plus 载玻片	Fisher Scientific	22-034-979
甲醛	VWR	BDH0506-4LP
甲酰胺	Sigma	F7508
GENECLEAN试剂盒	Q-Bio gene	1001-200
Kodak BioMax MR胶片	Sigma	Z350370
Kodak NTB乳胶	Carestream Health	8895666
Kodak专业显影剂D19	Kodak	1462593
Kodak专业定影剂	Kodak	1971746
β-巯基–乙醇	Calbiochem	444203
矿物油	VWR	IC15169491
NaOH	VWR	SX0600-1
多聚甲醛	Sigma	76240
Poly A	Invitrogen	POLYA.GF
rATP	Promega	P1132	10mM
rCTP	Promega	P1142	10mM
rGTP	Promega	P1152	10mM
RNasin	Promega	N2111	40单位/μl
S35 UTP	PerkinElmer	NEG039C001MC
安全溶解液	Safety Solve Research Products International	111177
醋酸钠	Sigma	S7899	3M
磷酸氢二钠	Sigma	S3264
磷酸二氢钠	Sigma	S3139
SP6 RNA聚合酶	Promega	P1085
染色金属架	Electron Microscopy Sciences	70312-54
T7 RNA聚合酶	Promega	P2075
组织基质OCT	Sakura	4583
5x 转录缓冲液	Promega	P1181
三乙醇胺	VWR	IC15216391
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	VWR	101449-446
tRNA	Roche	10109509001
溶液：
制备核糖探针的试剂：1.5 μl DNA模板 (0.2–0.3 μg/μl)，2 μl 5x优化转录缓冲液，1 μl 100 mM DTT（随Promega的聚合酶提供，室温下充分混匀），0.3 μl RNasin（40单位/μl），1.5 μl AGC核糖核苷酸混合液，3.5 μl S35 UTP，以及1 μl RNA聚合酶。用无核酸酶水补足至10 μl。 AGC核糖核苷酸混合液：将等体积的10 mM ATP、GTP和CTP混合。 用于乙醇沉淀以去除游离S35 UTP的醋酸钠溶液：40 μl 无RNase和DNase的水，5 μl 3M醋酸钠，以及125 μl 100%乙醇。 杂交缓冲液（10 ml储备液）：5 ml 100%去离子甲酰胺，600 μl 5M NaCl，1M Tris-HCl（pH = 8.0），240 μl 0.5M EDTA（pH = 8.0），100 μl 100x Denhart's溶液，100 μl 1M DTT，250 μl 20 mg/ml tRNA，125 μl 20 mg/ml poly A，以及1 g硫酸葡聚糖钠。加入DEPC处理的水至总体积为10 ml。剧烈振荡，然后在55 °C孵育直至硫酸葡聚糖钠完全溶解。将杂交缓冲液在-20 °C保存，可稳定约6个月。 4%缓冲多聚甲醛溶液：在专用于多聚甲醛的烧瓶中，将40 g多聚甲醛加入760 ml蒸馏水中，置于加热板上搅拌并加热至50 °C。加入320 μl 10N NaOH以助溶解。溶解后（约10分钟），加入100 ml 10x PBS，并用蒸馏水补足体积至1升。持续搅拌并加热直至多聚甲醛完全溶解。pH应为7.4。 乙酰化缓冲液：将13.6 ml三乙醇胺与2.52 ml乙酸酐加入1升蒸馏水中。 20x SSPE溶液：将3M NaCl、200 mM NaH2PO4-H2O和200 mM EDTA溶于蒸馏水中。用10N NaOH调节pH至7.4。 10x PBS缓冲液：将80 g NaCl、2.0 g KCl、14.4 g Na2HPO4和2.4 g KH2PO4溶于蒸馏水中。调节pH至7.0，并加水至总体积为1升。 第二次洗涤液：在2x SSPE中含0.1% β-巯基–乙醇和50%甲酰胺 醋酸克雷斯紫溶液：将3%醋酸克雷斯紫溶于自来水（使用蒸馏水会妨碍良好染色），在室温下于烧瓶中搅拌过夜。用真空抽滤装置通过1 mm Whatman滤纸和布氏漏斗过滤。