悬尾实验

摘要

尾悬试验已被验证为一种用于评估药物治疗在小鼠中抗抑郁效果的实验方法。将小鼠尾部悬挂持续六分钟，观察其与逃脱相关的行为。本文描述了进行尾悬试验所采用的操作步骤。

摘要

尾悬吊试验是一种小鼠行为学检测方法，可用于筛选潜在的抗抑郁药物，以及评估其他预期会影响抑郁相关行为的操作。实验中，用胶带将小鼠尾巴悬吊固定，使其处于无法逃脱或抓握周围表面的位置。在通常持续六分钟的测试过程中，对由此产生的以逃逸为导向的行为进行量化。尾悬吊试验是药物研发中用于高通量筛选潜在抗抑郁化合物的重要工具。本文详细描述了实施该试验所需的具体步骤，并特别强调了可能出现的问题及其规避方法。我们还提出了一种解决尾部攀爬行为的方案，这种常见问题会使某些小鼠品系（例如广泛使用的C57BL/6）无法适用于本试验。具体而言，我们在悬吊前将小鼠尾巴穿过一个小的塑料圆筒，以防止其发生尾部攀爬行为。最后，我们详细说明了如何对本试验中出现的行为进行人工评分。

方案

1. 材料

1. 悬浮箱

尾悬试验（TST）是将小鼠通过其尾巴悬吊于地面之上。从最基本层面而言，该操作仅需一根悬吊横杆或支架边缘以及胶带。然而，实验人员应考虑使用能够提供最佳对比度的背景。此外，应采取措施防止小鼠观察到正在接受测试的其他动物。在本实验室中，我们使用专门制造的尾悬箱（Four-Hour Day，巴尔的摩，马里兰州），该箱由塑料制成，尺寸为（55 高 × 60 宽 × 11.5 厘米深）。为防止动物之间相互观察或接触，每只小鼠被悬吊在各自独立的三面围合矩形隔间内（55 高 × 15 宽 × 11.5 厘米深）。小鼠被悬吊于该隔间的中央，隔间的宽度和深度足够大，以确保小鼠无法接触到侧壁。在此设置下，小鼠鼻尖与装置底面之间的距离约为 20–25 cm。该装置包含四个完全相同的隔间，可同时测试四只小鼠。一根铝制悬吊横杆（1 cm 高 × 1 cm 宽 × 60 cm 长）被置于箱体顶部，用于悬挂每只小鼠的尾巴。本实验室所使用的尺寸应视为一般性参考。例如，若使用体型较大的远交系小鼠品系（如 CD-1），尾悬箱的单个隔间尺寸可相应增大。

在每个隔间的底部，我们放置一个可拆卸的铝制托盘，用于收集动物的粪便或尿液。对于白化动物，我们使用深灰色的盒子；对于其他毛色的小鼠，则使用乳白色的盒子。这种设置能够提供更好的对比度，从而提高实验行为评分的可靠性。

2. 胶带

胶带应能牢固地粘附在小鼠尾巴和悬挂杆上，并具有足够的强度以承受被测小鼠的体重（例如 TimeMed Labeling Systems, Inc, Burr Ridge IL，宽度 1.9 cm）。然而，胶带不应过于黏稠，因为在测试结束后需将其从小鼠尾巴上取下。我们裁剪出长度为 17 cm 的胶带片段，并在一端距离 2 cm 处做一标记。此 2 cm 段用于将胶带固定在尾巴上，其余 15 cm 则用于悬挂小鼠。

3. 计时器

4. 视频记录设备

需要使用摄像机和三脚架（或其他支撑结构）。由于该实验通常需要同时测试多只动物，因此不建议进行实时评分。摄像机应以足够高的分辨率进行录制，以获得可用于后续行为评分的高质量图像。在开始实验前，务必确保摄像机有足够的录制存储空间。我们使用的摄像机可直接进行数字录制，无需使用物理介质（例如录像带），便于视频的直接传输。

5. 白噪声发生器

噪声发生器应能掩盖间歇性的环境声音。在可能听到突然巨大噪音并因此惊吓小鼠的实验室环境中，尤其建议使用噪声发生器。在我们的实验室内，未开启白噪声发生器时的环境噪声水平约为60 dB；在进行悬尾实验（TST）的位置开启白噪声发生器后，总声级为70–72 dB。然而，需要注意的是，这些数值仅作为示例提供，各实验室应根据自身独特的环境和具体情况选择合适的噪声水平。

6. 清洁用品

每次使用后，应使用消毒溶液（如 MB-10，Quip Laboratories Inc.，Wilmington，DE，或类似产品）彻底擦拭悬浮箱。

7. 爬行抑制装置（可选：取决于所使用的品系）

某些品系的小鼠（如 C57BL/6）在实验过程中可能会出现缠绕尾巴的行为¹。为防止此类行为，可将透明中空圆筒（长 4 cm，外径 1.6 cm，内径 1.3 cm，重量 1.5 克）套在小鼠尾巴上^2,3。这些圆筒由聚碳酸酯管材（#8585K41，McMaster-Carr，Santa Fe Springs, CA）制成，并由 FourHourDay 公司（Baltimore, MD）切割为 4 cm 长度。此类装置可在配备常规工具和材料的实验室中自行制备。

2. 行为学实验步骤

整体实验设计应体现对实验特定变量之间的适当平衡。例如，在我们的实验中，我们力求在每次TST实验中均等表示每个组别（即，若有四个处理组，则每次实验中均会包含这四个组）。此外，小鼠的放置位置也进行轮换，使得每个处理组的小鼠在每次实验中处于不同的位置。

1. 将摄像头放置到位。摄像头应尽可能靠近动物，以获得最高的动物图像分辨率。
2. 剪裁并标记好实验过程中将使用的胶带片段，并为实验做好准备。
3. 在将小鼠带入测试室之前，启动白噪声发生器（如使用）。白噪声的音量应仅足以掩盖外界噪音，避免音量过高，并确保所有动物使用相同的白噪声水平。
4. 将动物带入测试室。如果动物饲养室与测试室相邻且环境条件相似，则可能无需适应期。否则，应将动物在测试室内放置一段时间以适应环境（通常至少一小时）。需注意，同房间内的其他动物可能会感知到嗅觉和超声信号。
5. 如果使用已知会用尾巴攀爬的品系（如 C57BL6/J），则在粘贴胶带前应在尾巴上安装防攀爬装置（Climbstoppers）。
6. 将胶带粘贴到小鼠尾巴上。使用已标记的一端，确保胶带粘住尾巴末端并回折固定。胶带应贴在尾巴最末端，尾部末端留出 2–3 毫米不被胶带覆盖。
7. 每条胶带粘贴到小鼠尾巴后，将胶带中间部分固定在笼子内壁上。这有助于防止胶带相互缠绕。请注意，以这种方式限制动物活动可能引起应激，因此应尽快完成对每只动物的胶带粘贴过程。
8. 所有胶带粘贴完成后，在小鼠悬挂前开始录像，并标记记录实验会话信息。
9. 通过将胶带自由端依次固定在悬挂横杆或架子上，将动物悬挂起来，不同处理组之间应采用交叉平衡顺序。悬挂方式应避免遮挡摄像头视野，因为整个TST实验过程都需要进行行为评分，遮挡摄像头将导致无法评估该时间段内的行为表现。检查所有胶带末端是否平行悬挂于横杆或架子上，每只小鼠胶带的松垂长度应基本一致。
10. 实验结束时（通常为六分钟），将动物放回其原饲养笼，并小心地轻轻撕下每条胶带。切勿快速撕扯胶带，以免对小鼠造成疼痛。
11. 将小鼠送回饲养室后，清除收集盘中的粪便颗粒和尿液，并用消毒液擦拭装置。

3. 行为分析

1. 通常情况下，悬尾实验（TST）的整个过程持续六分钟。与另一种广泛使用的抗抑郁药效评估方法——强迫游泳实验不同，TST 的整个实验过程均需进行评分。这是因为普遍发现小鼠在 TST 中较早表现出静止行为。
2. 在本实验室中，我们将视频文件直接从摄像机上传至计算机，并在计算机上进行分析。
3. 在行为分析过程中，测量每只小鼠处于活动状态的时间。尽管可以直接测量静止时间，但我们发现识别和测量主动运动比判断运动缺失更为简便。
4. TST 行为分析中最重要的方面是始终如一地识别被记录为真实活动的运动行为。小鼠尤其在实验初期会表现出明显的逃避相关行为，包括试图触碰装置的器壁或悬挂杆、剧烈抖动身体，以及类似奔跑的肢体运动。这些行为明显属于活动状态。随后这些行为逐渐减弱并变得细微。在本实验室中，仅限于前肢的小幅度运动，若不涉及后肢活动，则不计为活动行为。此外，由于前期活动产生的动量所引起的摆动或钟摆样晃动，也不计为活动行为。
5. 在本实验室中，我们使用屏幕计时软件进行时间测量（Xnote Stopwatch，dnSoft Research Group）。屏幕上同时使用两个独立的秒表。第一个秒表从 360 秒开始倒计时，并在行为分析期结束时提醒观察者。第二个秒表由观察者手动控制，用于记录活动时间。某些秒表软件允许将按键分配给启动和停止功能，从而可通过键盘在屏幕上控制秒表。我们并未使用常规键盘，而是采用一种通常称为“游戏手柄”的输入设备来控制秒表。
6. 如果屏幕上同时显示多只小鼠，建议遮挡其他动物，以避免其运动干扰观察者。可通过使用另一个程序窗口，或用纸张物理遮盖屏幕上其他小鼠的方式实现。
7. 若在分析过程完成前，观察者可看到某只小鼠已累计的总活动时间，则可能引入偏差。若使用屏幕秒表，我们建议仅保留秒表的毫秒位数字可见，其余部分均予遮盖。通过遮盖秒表，观察者仅能判断秒表当前是否运行，而无法得知已流逝的总时间，从而避免偏差影响。采用此方法后，观察者在不了解动物分组信息的情况下，也无法对每只动物的总体活动水平形成先验判断。
8. 每位新观察者在开始采集实验动物数据前，均应进行观察者间信度测试。在本实验室中，每位新观察者首先观摩经验丰富的观察者进行评分。当新观察者能够充分区分活动与静止行为后，再与经验丰富的观察者同步实时评分，后者将实时指出任何错误。成功完成该阶段后，新观察者将对本实验室保存的一组特定 TST 视频进行分析，这些视频专用于培训目的。只有当新观察者与经验丰富的观察者之间达到较高的一致性相关水平后，方可参与实际实验的 TST 视频分析。我们归档这些培训分析的数据，作为实验室内部的标准。我们已观察到不同品系小鼠在表达活动（和静止）行为方式上存在差异，以及两性间平均静止时间的差异。当实验室测试新的品系、性别或基因修饰小鼠模型时，必须重新进行此类信度分析。

4. 典型结果

我们已采用悬尾实验（TST）评估了不同小鼠品系对锂盐治疗的抗抑郁样反应（图1）³。该实验的详细方法发表于 Can et al., 2011³。

图 1. 五种近交系小鼠在长期给予锂后，悬尾实验中的静止时间。小鼠以每笼4只为一组进行群养。锂处理组小鼠给予含4 g/kg LiCl的锂饲料，持续三周。对照组动物给予不含氯化锂的相同饲料。**:p<0.01，***:p<0.001 表示经非配对t检验具有显著性差异。数据以均值 ± 标准误表示。每种品系每组n=10–12只动物。（该图引自³）。

本示例中，仅在 C57BL/6J 和 DBA/2J 品系中观察到食物给予的慢性锂治疗具有显著作用。在其余三个品系中，均未观察到静止时间出现统计学意义上的显著减少。这些数据表明，对慢性锂治疗产生类似抗抑郁药的反应具有品系依赖性，这一点也与其他抗抑郁药物的观察结果一致^4-8。

讨论

Steru 开发的 TST 等⁹ 受到先前建立的强迫游泳实验的影响^10-12与强迫游泳实验类似，在悬尾实验（TST）中，小鼠被置于一种无法逃脱但具有中等应激强度的情境中。缺乏与逃脱相关的行为被视为静止不动。与强迫游泳实验一样，TST 是用于评估药物抗抑郁效果的验证最为充分的实验方法，同时也被用于评估环境、神经生物学及遗传学操作的影响。^13-18与强迫游泳实验不同，悬尾实验不存在因浸入水中而导致低体温的风险¹⁹实验人员应牢记，尽管强迫游泳实验与悬尾实验具有相似性 初步的，这两种检测方法在灵敏度和性能方面存在多种重要差异，一种检测的结果不一定能在另一种检测中得到重复。有关这两种检测方法差异的详细说明，请参见以下参考文献^4,20,21尽管大多数抗抑郁药物需要数周时间才能在患者中产生临床显著效果，但抗抑郁药物在急性及慢性给药后均可在悬尾试验（TST）和强迫游泳试验中发挥效应。^20,22,23然而，还有许多其他行为学测试通常仅对慢性治疗敏感，可用于评估小鼠的类抗抑郁作用，其中包括慢...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶带
计时器
摄像机
白噪声发生器（可选）
防爬挡板（可选；根据所用品系而定）