一种用于研究单纯疱疹病毒潜伏与再激活的原代神经元培养系统

摘要

本方案描述了一种高效且可重复的模型系统，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的潜伏感染与再激活。该检测方法采用均一的交感神经元培养体系，可利用多种工具（包括RNA干扰和重组蛋白表达）对病毒与神经元之间的相互作用进行分子层面的解析。

摘要

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在外周神经元中建立终身潜伏感染。这种潜伏储存库是病毒反复再激活的来源，导致病毒传播并引发临床疾病。目前的抗病毒药物无法清除潜伏储存库，且尚无有效疫苗。尽管裂解性复制的分子机制已被充分阐明，但调控神经元中潜伏感染的机制仍不清楚。目前对潜伏感染的认识主要来源于使用小型动物模型的体内研究，这些模型在定义病毒基因需求以及免疫应答作用方面发挥了不可替代的作用。然而，在活体动物中，无法区分对病毒-神经元相互作用的特异性影响与免疫细胞或非神经元支持细胞介导的感染的一般性后果。此外，动物实验成本高、耗时长，且在宿主过程调控方面的可选手段有限。为了克服这些局限性，迫切需要一种仅包含神经元的系统，既能重现体内潜伏与再激活的特征，又能提供组织培养在均一性和可及性方面的优势。

本文介绍了一种利用培养自大鼠颈上神经节（SCG）的原代交感神经元的体外模型（图1），用于研究HSV-1的潜伏感染与再激活，该模型符合大多数甚至全部理想标准。在去除非神经元细胞后，获得近乎均一的TrkA⁺神经元培养体系，并在阿昔洛韦（ACV）存在下接种HSV-1，以抑制裂解性复制。去除ACV后，可高效建立非生产性HSV-1感染，该感染状态忠实呈现公认的潜伏感染特征。值得注意的是，即使不进行筛选，裂解期mRNA、蛋白质和感染性病毒均无法检测到，但潜伏相关转录本（LAT）在神经元细胞核中持续表达。病毒基因组以平均每神经元25个拷贝的数量维持，并可通过干扰PI3-激酶/Akt信号通路或单纯撤除神经生长因子¹来诱导其进入生产性复制。一种编码EGFP与病毒裂解蛋白Us11融合蛋白的重组HSV-1，可作为再激活后复制过程的功能性实时标记物，便于定量检测。除化学处理外，该系统还可成功应用RNA干扰或慢病毒载体介导的基因递送等遗传学方法，从而开展在动物体内极难甚至无法实现的机制性研究。综上所述，基于SCG的HSV-1潜伏/再激活系统为解析控制HSV-1在神经元中潜伏与再激活的分子机制提供了强大而必要的工具。这一长期困扰病毒学领域的难题，其解答可能为靶向潜伏性疱疹病毒储存库的新疗法开发带来全新见解。

方案

1. 大鼠胚胎交感神经节神经元的分离与培养

为帮助理解本实验方案，并全面讨论早期文献中建立的SCG神经元培养方法及相关理论基础，特提供以下背景信息 体外 培养、培养板包被基质以及无血清培养基的组分，读者可参考相关文献^2-4.

1. 使用大鼠作为SCG神经元来源的操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行，并经机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care & Use Committee，IACUC）批准的有效方案执行。
2. 开始解剖前，准备经胶原蛋白和层粘连蛋白包被的96孔组织培养板。使用多通道移液器，将96个孔全部加入含0.66 mg/ml大鼠尾胶原蛋白的溶液。立即吸除胶原蛋白溶液，该溶液可回收并用于最多8次解剖。去除胶原蛋白后，必须在层流罩下将各孔彻底干燥，此步骤极为重要。干燥所需时间取决于培养板的孔数。例如，96孔板通常需要约5–10分钟干燥，若使用较大规格的24孔板，则可能需要30–40分钟。若未充分干燥，将导致SCG贴壁不良。随后使用2 μg/ml层粘连蛋白溶液重复上述操作。将含层粘连蛋白的培养板置于湿润的CO₂培养箱中，37 °C孵育至少2小时，直至准备接种神经元（步骤1.14）。
3. 通过商业途径获得的妊娠雌性大鼠采用CO₂安乐死。尸体用70%乙醇喷洒消毒后，在腹部做U形切口。掀开皮肤后，再通过腹肌层做第二个U形切口。提起腹肌层即可看到子宫。取出子宫并置于15 cm培养皿中。使用钝头剪刀小心打开子宫，避免损伤其中的仔鼠。每只仔鼠需从胎膜中释放，剪断脐带，并用70%乙醇和Kimwipes纸巾擦拭干净。
4. 在解剖显微镜下操作，通过剪断头部与躯干连接处的方式处死E21期未出生大鼠仔鼠。剪切时剪刀应朝向颈部基部，略高于肩部位置。为暴露神经节，使用23 G针头将头部（颈部朝上）固定于三个位置：i）脊髓；ii）前部皮肤向上拉至鼻部并固定；iii）食管/气管必须从颈部基部分离并固定。
5. 在颈动脉分叉处两侧寻找两个SCG*（每个胚胎有两个SCG）。SCG位于分叉支的正下方。通过拉开颈动脉分叉将SCG与血管分离。将分离的神经节置于盛有12 ml L15培养基（添加0.4% D(+)-葡萄糖）的15 ml锥形管中，冰上保存。

*与包裹分叉处的不透明、淡黄色脂肪组织相比，颈上神经节呈半透明且无色。在收集神经节之前，应尽量去除残留的脂肪组织和血管。

6. 重复步骤 1.4 和 1.5，直至从胚胎中收获所有背根神经节（SCGs）。
7. 将神经节在 600 rpm 条件下轻柔离心 1 分钟，并吸除多余培养基。
8. 将神经节重悬于 1 ml 含胰蛋白酶（0.25%，不含 EDTA）和胶原酶（1 mg/ml）的 L15 培养基中。于 37 °C 孵育 30 分钟，每 10 分钟振荡一次。
9. 加入 10 ml C-培养基（1× MEM，0.4% D(+)-葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺，10% 胎牛血清）以终止胰蛋白酶消化作用，随后在 600 rpm 条件下离心 1 分钟。
10. 尽可能彻底去除胰蛋白酶/胶原酶混合液*，并用 10 ml C-培养基洗涤神经节。在 600 rpm 条件下离心 1 分钟。重复此步骤一次。

*残留的胶原酶会干扰细胞在培养板上贴壁所需的胶原基质。

11. 移除洗涤液，将神经节重悬于 1 ml C 培养基中，使用连接 5 ml 注射器的 21 G 针头进行吹打以分散大的细胞团块*。再用 23 G 针头继续吹打，直至可见的细胞团块完全分散。

*注意避免过度吹打，以免损伤细胞。如果胰蛋白酶和胶原酶处理成功，使用21 G针头进行最多十五次上下吹打，以及使用23 G针头进行三次吹打即可。

12. 将解离的神经元通过70 μm尼龙滤膜[BD Biosciences细胞筛]过滤至50 ml锥形管中，以去除任何残留的细胞团块。
13. 取10 μl过滤后的细胞悬液，与台盼蓝混合，以确定活细胞数量。使用血细胞计数板计数能够主动排除染料的细胞数目。
14. 从37 °C培养箱中取出预先包被的96孔板，吸去板内的层粘连蛋白溶液（见步骤1.2）。切勿让孔板干燥，去除层粘连蛋白后可立即用于接种细胞。向经胶原和层粘连蛋白预包被的96孔组织培养板中每孔加入5,000–6,000个总活细胞（每孔50–100 μl）。在C培养基中添加50 ng/ml神经生长因子（NGF）。

*必须采用良好的无菌组织培养技术，因为培养基中未添加抗生素。此外，不同供应商提供的胶原蛋白可能存在显著差异。我们使用 Millipore 公司的鼠尾胶原蛋白在多个批次中均获得了稳定一致的结果。

15. 在DIV（体外培养天数) 1，用 50 替换用于铺板细胞的 C 培养基 μl NBM（0.4% D(+)-葡萄糖，2 mM L-谷氨酰胺，含50 ng/ml NGF的B-27添加剂） μM 蚜虫素和 20 μM 5-氟尿嘧啶［5-氟-2'-脱氧尿苷］。将培养物孵育5天*。此时，可通过胰酶消化并计数多个孔中剩余的细胞，以确定经抗有丝分裂剂处理后存活的神经元数量。通常情况下，在96孔板中每孔约剩余1,000个神经元。

*真菌或细菌污染问题通常在培养的最初24小时内即可明显观察到。在更换铺板培养基之前，应仔细检查每个孔是否存在微生物生长。若仅有少数孔受到污染，可用稀释的漂白剂溶液处理，再用PBS冲洗并干燥，以继续实验。我们建议，即使仅有少量孔出现微生物污染，也应重复实验。若在96孔板中观察到广泛的微生物污染，则必须终止实验。

2. 使用 HSV-1 Us11-EGFP 感染 SCG 培养物并建立潜伏感染

关于病毒学技术的相关背景知识，包括病毒的基本扩增、病毒滴度的测定以及感染复数（MOI）的确定，读者可参考文献⁵。关于疱疹病毒生物学的讨论，读者可参考文献⁶。最后，对于α-疱疹病毒感染背根神经节（SCG）神经元的裂解性感染的先前实例、其他实验方案以及相关背景资料，以及与本方案在研究潜伏感染和再激活方面的改进之处的比较，读者可参考文献^7-10。

1. 在 DIV 6 时，向每孔已有的培养基中加入阿昔洛韦（ACV），终浓度为 100 μM*。例如，若每孔含有 50 μl 培养基，则加入 25 μl 的 300 μM ACV 储存液。通常在感染前一晚加入 ACV，也可在感染前 6–8 小时加入。

*在任何时候都必须极其注意尽量减少对神经元不必要的物理操作。更换培养基或接种病毒原液时必须操作轻柔、缓慢。否则，由此产生的机械应力可能对神经元的存活率产生不利影响。

2. 在DIV 7时，用HSV-1 Us11-EGFP（见参考文献¹¹）感染SCG培养物，感染复数（MOI）为1–2（参见下方关于确定最佳MOI的重要说明）*。将稀释后的病毒直接加入孔中现有的培养基中。设置未感染的对照组以及不含ACV的裂解性感染阳性对照组。在37 °C条件下继续培养2–3小时。

*MOI 是通过在 Vero 细胞中进行噬斑实验测定病毒滴度¹²，并结合步骤 1.14 中每孔接种的活细胞数量计算得出。该计算仅在操作层面上具有参考意义，因为接种的总细胞数中包含神经元以及混杂的胶质细胞和成纤维细胞。由于这些混杂的增殖性细胞会被抗有丝分裂试剂处理所清除，因此对存活神经元而言，实际的 MOI 值实际上更高。从最初接种的 5,000 - 6,000 个活细胞中，在使用抗有丝分裂试剂处理后（通过胰酶消化和直接细胞计数评估），大约仅剩 1,000 个神经元。在感染神经元培养物时，最佳 MOI 可能因不同批次的病毒储备液而略有差异。每次制备新的病毒时，我们建议测试 MOI 为 1 至 2 的有限范围，以确定对神经元活力影响最小且能产生最多可诱导再激活事件（见第 3 节定义）的条件。Us11-EGFP 病毒在快速优化实验条件方面特别有用，但也可使用其他检测方法，如噬斑实验或定量 PCR。使用经蔗糖垫纯化的病毒有助于去除可能降低细胞活力的杂质，尽管这并非必需步骤，也未被常规执行。

3. 小心地将感染培养基更换为含有 50 ng/ml NGF 和 100 μM ACV* 的新鲜 NBM。

*更换感染培养基时必须极其轻柔。应将移液枪头对准孔板的孔壁，而非孔底，让培养基沿孔壁缓缓流下。即使快速弹出移液枪中的液体，也可能产生足够的冲击力，导致轴突从基质上脱落，细胞通常成片剥落。如果仅有少量神经元脱落（20-30%），且细胞状态良好，则影响较小。脱落的神经元可能随时间重新附着，但其轴突将不再整齐延伸，需重新生长新的轴突。尽管这种情况并非理想，只要受影响的孔数量有限，实验仍可继续进行。若神经元大量脱落（70-80%），则不建议将受影响的孔纳入实验。若大多数孔中均有70-80%的神经元脱落，建议终止该实验。虽然这些神经元仍可能重新附着，但通常会形成较大的细胞团块，从而干扰对单个再激活神经元的准确评估。我们建议重复任何观察到神经元脱落孔的实验，以确保神经元在孔板中的附着差异未对再激活率造成影响。

此外，它还 关键的 到 始终尽可能轻柔地操作培养物不必要的突然机械应力（包括反复开关培养箱门或用力添加培养基）可能会影响培养物维持HSV-1潜伏感染的能力，导致在特定实验中自发再激活的发生率异常升高。

4. 将培养物维持培养6天，期间病毒将建立潜伏感染。在此期间，使用荧光显微镜监测神经元的健康状态以及Us11-EGFP的表达，后者作为裂解性复制的指示指标。应能检测到Us11-EGFP 仅 在未接受ACV处理的对照孔中，表明原发感染成功且存在活跃的裂解性复制。即使在无活跃病毒增殖的情况下，神经元也可能出现细胞病变效应。感染的培养物应密切监测，并与模拟感染的神经元进行比较。

3. 重新激活与评估

1. 在DIV 14时，小心地将含ACV的培养基更换为新鲜培养基 缺乏 ACV。如果适用，此时应加入药理学（或生物学）变量。务必遵循2.3节中所述的预防措施。
2. 在5至6天内，使用荧光显微镜监测活体培养物，以检测发生再激活的神经元。或者，收集样品用于其他类型的分析（蛋白质、核酸、斑块测定等）。
3. 通过计数含有EGFP阳性神经元的孔数，并将其表示为样本总孔数的比例，来计算再激活频率。需要注意的是，单个孔中EGFP的表达无法区分初始再激活事件与病毒传播引起的继发感染。由于感染性传播局限于单个培养孔内，在本实验条件下，将每个孔中存在一个或多个EGFP阳性神经元操作性定义为一次再激活事件。

在培养物中可能发生多次再激活事件，如文献¹所述。为了区分初次再激活事件与由再激活引起的病毒扩散，可加入包膜抑制剂 WAY-150138。通过阻断病毒的包膜过程，无法产生具有感染性的病毒，从而阻止再激活所导致的传播。因此，在存在 WAY-150138 的情况下检测到的 EGFP 信号反映了单个培养孔内独立发生的再激活事件的数量^1,13-15。需要注意的是，WAY-150138 仅对 HSV-1 Patton 毒株有效，且目前未商品化。作为 WAY-150138 的替代方案，可考虑以下任一方法：i）使用在向邻近细胞扩散能力上存在缺陷的突变病毒；ii）使用一种报告病毒，使其在持续存在 ACV 的条件下，由立即早期（IE）启动子驱动 EGFP 的表达；iii）使用 PAA 或 ACV 处理以抑制晚期基因表达（及感染性病毒的产生），随后采用针对立即早期基因产物的抗体进行免疫荧光检测。

4. 利用该检测方法评估再激活的替代方案

单次实验的个体结果应来自同一份 SCG 制备样品。只要每次重复实验均使用单独一批次的 SCG 样品，便可利用独立的 SCG 制备样品进行重复实验。

1. HSV-1 裂解期转录本的检测。在去除ACV后，在存在或不存在不同实验性再激活诱导剂的条件下，于所需时间点收集RNA。当使用96孔培养板时，建议每个样本至少合并20个孔（每个RNA样本约含10⁵个细胞）。或者，SCG也可接种于更大的孔板中（例如24孔板，每孔接种4-5×10⁴个细胞/孔）。尽管从少于20个孔中检测RNA是可能的，但因体积过小会导致样本间不必要的变异。
2. HSV-1 裂解期蛋白的检测。在诱导再激活后的特定时间点收集裂解液。向96孔板中的每10个孔各加入7.5 μl裂解缓冲液，随后通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析。或者，可通过间接免疫荧光显微镜检测病毒蛋白。初始接种必须在可用于成像的可固定基质上进行，例如预先用聚-D-赖氨酸（0.2 mg/ml，Sigma）包被的无菌玻璃盖玻片，之后再涂布胶原蛋白和层粘连蛋白（参见1.10）。
3. 感染性病毒颗粒的检测。在再激活后收集培养上清液。使用上清液的系列稀释液对Vero细胞单层进行空斑试验。此外，还可对经反复冻融处理的细胞裂解物进行空斑试验，以包含细胞相关性病毒颗粒，从而测定滴度。

5. 代表性结果

图2A 展示了1的一个示例 μM trichostatin A（TSA），一种已知的再激活诱导剂^16-18，应用于潜伏感染野生型HSV1 EGFP-Us11报告病毒株的SCG培养物。使用TSA处理后，2天内再激活率达到最大值的50%，到第5天时，约60%的孔中再激活达到平台期。本实验中基础水平（“自发”）再激活率约为10%，通常使用该方法时自发再激活率范围为10–20% 体外 系统。最大再激活水平取决于所使用的再激活诱导剂。许多再激活诱导剂可在整个实验过程中持续使用，因其不会干扰病毒的 productive 复制，但这一点需通过实验确定。其他诱导剂，包括任何影响神经元存活率或阻碍病毒 productive 生命周期完成的试剂，可能需要采用短暂脉冲处理以诱导再激活。

尽管图2A所示实验中每个孔内EGFP-Us11的积累表明病毒从潜伏状态发生了再激活，但这无法区分单个神经元中的Us11-EGFP信号是来源于独立的再激活事件，还是来源于再激活病毒在培养体系中的传播。为了评估每个孔中发生独立再激活事件的神经元数量，实验预先使用了WAY-150138处理培养物，该化合物可通过阻止病毒DNA基因组的衣壳化而特异性抑制病毒传播^13-15。感染的交感神经元培养物经WAY-150138处理后，使用TSA诱导再激活。与DMSO处理的对照组培养物相比，仅在TSA处理的孔中检测到大量EGFP阳性神经元，表明在每个独立培养物中均发生了多次独立的再激活事件（图2B）。

在我们的检测中，Us11-EGFP 报告基因由内源性 Us11 启动子表达¹¹。由于 Us11 是一种“真晚期”（γ₂）病毒裂解期基因，其高效表达需要病毒DNA复制。这一点在图3中得到证实：在使用PI3-激酶抑制剂LY294002诱导再激活的培养物中，病毒DNA聚合酶抑制剂磷onoacetic acid（PAA）可抑制EGFP-Us11的积累。

图1. 使用培养神经元的典型实验方案示意图 体外 用于研究HSV-1潜伏与再激活的系统 1) 从E21大鼠分离上颈交感神经节（SCG）后，将解离的神经元接种于96孔板中，并使用抗有丝分裂试剂处理以去除非神经元细胞。2) 培养6天后 体外 （DIV）在存在抗病毒药物阿昔洛韦（ACV）的条件下，用携带增强型绿色荧色蛋白（EGFP）与病毒编码的Us11晚期基因融合的重组HSV-1（EGFP-HSV-1）感染培养物。ACV可抑制裂解性复制。3）至第14天（DIV 14），去除阿昔洛韦，此时未检测到EGFP表达。培养物可在此状态下稳定维持一个月或更长时间，或加入待测变量以评估其诱导潜伏病毒再激活的能力。该变量可为小分子化学抑制剂、针对可溶性神经营养因子或细胞表面蛋白的抗体，或表达基因特异性shRNA或异位表达蛋白的慢病毒。随后通过实时计数EGFP阳性孔来监测再激活情况。

图 2. TSA 在 SCG 培养物中重新激活 HSV-1。 SCG 培养物的潜伏感染建立如 图 1 所述。在 DIV 14 时，去除 ACV，并替换为含有 1 μM 伏立诺他（trichostatin A, TSA）的培养基。（A）药物处理后每天使用荧光显微镜观察并评分培养物，持续 5 天。图中显示了实验过程中发生再激活的孔所占百分比，并与经 DMSO 对照处理的培养物进行比较。再激活百分比通过 96 孔培养板中 20 个孔内表达 EGFP 的孔数计算得出。误差线表示均值的标准误。（B）潜伏感染的培养物用 TSA 及病毒 DNA 衣壳化抑制剂 WAY-150138（20 μg/ml）处理。在药物处理 48 小时后，将 EGFP+ 神经元数量与经 DMSO 和 WAY-150138 处理的对照组进行比较。每个数据点代表一个培养孔中 1,000 个神经元内 EGFP+ 神经元的比例。柱状图显示一个孔中 EGFP+ 神经元的平均百分比。

图3. EGFP的检测依赖于病毒DNA的复制。 SCG神经元培养物经潜伏感染后，用已知的再激活诱导剂LY29004（10 μM）处理¹。比较了仅使用LY（蓝色）诱导的再激活、使用病毒DNA合成抑制剂磷ono乙酸（PAA，300 μg/ml，红色）处理的样本，以及同时使用这两种化合物处理的样本（绿色）。

讨论

这种原代神经元培养与感染系统为研究HSV-1潜伏与再激活的分子机制提供了一种简单而有效的方法。该系统能够真实再现人体感染及活体动物模型中公认的潜伏感染特征。当病毒在SCG培养物中处于潜伏状态时，无法检测到感染性病毒颗粒及病毒裂解期基因产物。在潜伏感染的神经元中唯一可检测到的病毒基因产物是不编码蛋白的LAT转录本，其在细胞核内积累。再激活过程伴随着病毒裂解期基因的表达，并最终产生具有感染性的病毒颗粒。此外，这种原代神经元细胞培养模型对公认的再激活诱导剂（如TSA）具有响应性，TSA可有效诱导病毒裂解性复制。

不同的化学诱导剂以不同程度和特征性动力学刺激再激活。例如，在5天的观察期内，TSA可重复地在60%–70%的培养物中诱导再激活。使用潜伏感染的、已分化的鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞¹⁷或小鼠三叉神经元培养物¹⁸，已有报道显示TSA诱导的再激活水平相似。我们观察到的再激活动力学以及TSA无法在100%培养物中诱导再激活的现象，可能反映了潜伏基因组在去抑制能力上的异质性。与此假设一致的是，据报道TSA诱导再激活...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70μm 尼龙滤器（细胞筛）	BD 生物科学	352350
1× Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）-/-)	Invitrogen	14175	无 CaCl₂2 和 MgCl2
1x 最小必需培养基（MEM）	Invitrogen	11095-080
5-氟-2’-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	F0503	在1×MEM中配制20 mM储备液；于-20℃保存°C
96孔平底TC培养板	康宁	3599
阿昔洛韦	Calbiochem	114798	在DMSO中配制31 mM储备液；于-20℃保存°C
阿糖胞苷	Calbiochem	178273	在DMSO中配制10 mM储备液；于-20℃保存°C
B-27 补充剂	Invitrogen	17504-44
胶原酶	Sigma-Aldrich	C2674	在 HBSS 中配制 10 mg/ml 的储备液-/-；于 -20 保存°C
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G6152	在 H 中配制 40% 储存液2O；滤膜除菌 && 储存于 4°C
L-谷氨酰胺	Invitrogen	25030-081
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020	在 H 中配制 1 mg/ml 储存液2O；快速冷冻20 μl 分装 && 储存于 -80°C；稀释至2 μg/ml 工作浓度，在无菌 H2O
Leibovit’z L-15 培养基	Invitrogen	11415
神经生长因子	Harlan Laboratories	BT.5017	准备 50 μg/ml 储存液，溶于 HBSS-/-；于 -80 保存°C
Neurobasal 培养基	Invitrogen	12348
磷ono乙酸（PAA）	Sigma-Aldrich	P6909	在 H 中配制 75 mg/ml 储存液2O；于 -20 保存°C
聚-D-赖氨酸氢溴化物	Sigma-Aldrich	P0899	在 H 中配制 20 mg/ml 的储备液2O；于 -20 保存°C
大鼠尾胶原	EMD Millipore	08-115	浓度因供应批次而异；4 ℃ 保存°C，并在无菌 H 中稀释至 0.66 mg/ml 的工作浓度2O
曲古抑菌素 A	Sigma-Aldrich	T8552	在DMSO中配制1 mM储备液；于-20℃保存°C
胰蛋白酶 2.5%	Invitrogen	15090-04