本方案描述了一种高效且可重复的模型系统，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的潜伏感染与再激活。该检测方法采用均一的交感神经元培养体系，可利用多种工具（包括RNA干扰和重组蛋白表达）对病毒与神经元之间的相互作用进行分子层面的解析。
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本文内容
摘要
摘要
单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在外周神经元中建立终身潜伏感染。这种潜伏储存库是病毒反复再激活的来源，导致病毒传播并引发临床疾病。目前的抗病毒药物无法清除潜伏储存库，且尚无有效疫苗。尽管裂解性复制的分子机制已被充分阐明，但调控神经元中潜伏感染的机制仍不清楚。目前对潜伏感染的认识主要来源于使用小型动物模型的体内研究，这些模型在定义病毒基因需求以及免疫应答作用方面发挥了不可替代的作用。然而，在活体动物中，无法区分对病毒-神经元相互作用的特异性影响与免疫细胞或非神经元支持细胞介导的感染的一般性后果。此外，动物实验成本高、耗时长，且在宿主过程调控方面的可选手段有限。为了克服这些局限性，迫切需要一种仅包含神经元的系统，既能重现体内潜伏与再激活的特征，又能提供组织培养在均一性和可及性方面的优势。
本文介绍了一种利用培养自大鼠颈上神经节（SCG）的原代交感神经元的体外模型（图1），用于研究HSV-1的潜伏感染与再激活，该模型符合大多数甚至全部理想标准。在去除非神经元细胞后，获得近乎均一的TrkA+神经元培养体系，并在阿昔洛韦（ACV）存在下接种HSV-1，以抑制裂解性复制。去除ACV后，可高效建立非生产性HSV-1感染，该感染状态忠实呈现公认的潜伏感染特征。值得注意的是，即使不进行筛选，裂解期mRNA、蛋白质和感染性病毒均无法检测到，但潜伏相关转录本（LAT）在神经元细胞核中持续表达。病毒基因组以平均每神经元25个拷贝的数量维持，并可通过干扰PI3-激酶/Akt信号通路或单纯撤除神经生长因子1来诱导其进入生产性复制。一种编码EGFP与病毒裂解蛋白Us11融合蛋白的重组HSV-1，可作为再激活后复制过程的功能性实时标记物，便于定量检测。除化学处理外，该系统还可成功应用RNA干扰或慢病毒载体介导的基因递送等遗传学方法，从而开展在动物体内极难甚至无法实现的机制性研究。综上所述，基于SCG的HSV-1潜伏/再激活系统为解析控制HSV-1在神经元中潜伏与再激活的分子机制提供了强大而必要的工具。这一长期困扰病毒学领域的难题，其解答可能为靶向潜伏性疱疹病毒储存库的新疗法开发带来全新见解。
方案
1. 从大鼠胚胎中分离和培养颈上神经节神经元
为理解本方案提供有用的背景信息，并全面讨论早期文献中建立的SCG神经元培养方法，包括SCG的理论基础 体外 培养、培养板包被基质以及无血清培养基的组分，读者可参考相关文献2-4.
- 使用大鼠作为SCG神经元来源的操作严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并在机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care & Use Committee，IACUC）批准的有效实验方案下进行。
- 开始解剖前，准备经胶原蛋白和层粘连蛋白包被的96孔组织培养板。使用多通道移液器，将0.66 mg/ml大鼠尾胶原溶液加入所有96个孔中。立即吸除胶原溶液（可回收并用于最多8次解剖）。去除胶原后，必须在层流罩下将各孔彻底干燥，此步骤极为重要。干燥所需时间取决于培养板的孔数。例如，96孔板通常需要约5–10分钟干燥，若使用较大规格的24孔板，则可能需要30–40分钟。若未充分干燥，将导致SCG贴壁不良。随后使用2 μg/ml层粘连蛋白溶液重复上述操作。将含层粘连蛋白的培养板置于37 °C、加湿的CO2培养箱中孵育至少2小时，直至准备接种神经元（步骤1.14）。
- 通过商业途径获得的妊娠雌性大鼠采用CO2实施安乐死。尸体用70%乙醇喷洒消毒后，在腹部做U形....
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讨论
这种原代神经元培养与感染系统为研究HSV-1潜伏与再激活的分子机制提供了一种简单而有效的方法。该系统能够真实再现人体感染及活体动物模型中公认的潜伏感染特征。当病毒在SCG培养物中处于潜伏状态时，无法检测到感染性病毒颗粒及病毒裂解期基因产物。在潜伏感染的神经元中唯一可检测到的病毒基因产物是不编码蛋白的LAT转录本，其在细胞核内积累。再激活过程伴随着病毒裂解期基因的表达，并最终产生具有感染性的病毒颗粒。此外，这种原代神经元细胞培养模型对公认的再激活诱导剂（如TSA）具有响应性，TSA可有效诱导病毒裂解性复制。
不同的化学诱导剂以不同程度和特征性动力学刺激再激活。例如，在5天的观察期内，TSA可重复地在60%–70%的培养物中诱导再激活。使用潜伏感染的、已分化的鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞17或小鼠三叉神经元培养物18，已有报道显示TSA诱导的再激活水平相似。我们观察到的再激活动力学以及TSA无法在100%培养物中诱导再激活的现象，可能反映了潜伏基因组在去抑制能力上的异质性。与此假设一致的是，据报道TSA诱导再激活.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢审稿人提出的宝贵建议，这些建议有助于改进本手稿。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）向 MVC（NS21072、HD23315）、ACW（GM61139、S10RR017970）和 IM（AI073898、GM056927）提供的资助。MK 部分由 NIH 培训资助（5T32 AI007180）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70μm 尼龙滤器（细胞筛） | BD 生物科学 | 352350 | |
| 1× Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）-/-) | Invitrogen | 14175 | 无 CaCl₂2 和 MgCl2 |
| 1x 最小必需培养基（MEM） | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5-氟-2’-脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | F0503 | 在1×MEM中配制20 mM储备液；于-20℃保存°C |
| 96孔平底TC培养板 | 康宁 | 3599 | |
| 阿昔洛韦 | Calbiochem | 114798 | 在DMSO中配制31 mM储备液；于-20℃保存°C |
| 阿糖胞苷 | Calbiochem | 178273 | 在DMSO中配制10 mM储备液；于-20℃保存°C |
| B-27 补充剂 | Invitrogen | 17504-44 | |
| 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C2674 | 在 HBSS 中配制 10 mg/ml 的储备液-/-；于 -20 保存°C |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G6152 | 在 H 中配制 40% 储存液2O；滤膜除菌 && 储存于 4°C |
| L-谷氨酰胺 | Invitrogen | 25030-081 | |
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | 在 H 中配制 1 mg/ml 储存液2O；快速冷冻20 μl 分装 && 储存于 -80°C；稀释至2 μg/ml 工作浓度，在无菌 H2O |
| Leibovit’z L-15 培养基 | Invitrogen | 11415 | |
| 神经生长因子 | Harlan Laboratories | BT.5017 | 准备 50 μg/ml 储存液，溶于 HBSS-/-；于 -80 保存°C |
| Neurobasal 培养基 | Invitrogen | 12348 | |
| 磷ono乙酸（PAA） | Sigma-Aldrich | P6909 | 在 H 中配制 75 mg/ml 储存液2O；于 -20 保存°C |
| 聚-D-赖氨酸氢溴化物 | Sigma-Aldrich | P0899 | 在 H 中配制 20 mg/ml 的储备液2O；于 -20 保存°C |
| 大鼠尾胶原 | EMD Millipore | 08-115 | 浓度因供应批次而异；4 ℃ 保存°C，并在无菌 H 中稀释至 0.66 mg/ml 的工作浓度2O |
| 曲古抑菌素 A | Sigma-Aldrich | T8552 | 在DMSO中配制1 mM储备液；于-20℃保存°C |
| 胰蛋白酶 2.5% | Invitrogen | 15090-04 |
参考文献
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia.
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