组合合成和高通量的蛋白质释放的聚合物薄膜和纳米粒子库

摘要

该方法描述了组合化学合成的可生物降解的聚酸酐薄膜和纳米粒子库，，蛋白释放这些库和高通量检测。

摘要

聚酸酐的生物材料是一类具有优良的生物相容性和药物输送能力。虽然他们已经被广泛研究，与传统的单样本在每次一个合成技术，最近的高通量方法已经开发使聚酐¹的合成和试验的大型图书馆。这将有利于更有效地优化和设计过程中这些生物材料，药物和疫苗交付应用。在这项工作中描述的方法的组合合成的可生物降解的聚酐膜和纳米颗粒的图书馆和从这些库的蛋白释放的高通量的检测。在这种机器人的操作方法（ 图1），线性致动器和注射器泵控制的LabVIEW，它使免提自动化协议，消除了用户错误。此外，这种方法可以快速制造微观尺度聚合物图书馆，红色ucing创造多元聚合物系统而导致的批量大小。这个组合的聚合物的合成方法便于用相当量的时间，将采取以往合成聚合物中的15种不同的聚合物的合成。此外，聚合物组合库，可以制作成空白或蛋白质加载的几何形状，包括在溶剂中和沉淀到非溶剂（纳米粒子），或通过真空干燥（薄膜）的薄膜或纳米颗粒溶解时的聚合物库。在加载到聚合物中的图书馆荧光染料共轭蛋白，蛋白质的释放动力学可以在高吞吐量的评估使用基于荧光的检测方法（ 图2和图3），如前面描述^1。组合平台已验证常规方法²和聚酐膜和纳米库的特点体外细胞毒性，细胞因子的产生，表面标志物的表达，黏附，增殖和分化，以及体内生物分布和粘膜粘附^1-11。开发本发明的组合的方法，使高吞吐量的聚合物合成和加载蛋白质纳米粒子的制造和膜的图书馆，可以反过来， 在体外和体内筛选的生物材料的性能的优化。

方案

1。组合聚合物图书馆的合成高分子化学变化-请参阅图1为机器人设定

1. 各单体溶解在适当的溶剂中（浓度为25毫克/毫升），和加载每个成10cc的气密注射器。
2. 将附加抗溶剂的诱惑锁毛细管各注射器的端部。
3. 将注射泵的注射器（新时代可编程注射泵），并锁定到位。
4. 线性致动器（Zaber）的起始位置。
5. 使用环形支架夹的两个毛细管，定位结束进入首发瓶/单体沉积。
6. 启动LabVIEW程序导入各孔中根据所需的共聚物组合物的各单体的可变体积的泵。这是通过在程序中指示的Z轴致动器降低到小瓶/以及，然后每个泵的毛细管，以分配所需的量的。氖XT，程序指示的Z-致动器返回到其起始位置的X-和Y-致动器移动到的位置的下一个小瓶/孔。这是进行，直到每个井的所需体积的单体存入。
7. 单体的沉积之后，多井或多瓶单体库转移到一个预先加热的真空烘箱中，并培养在真空下的缩合聚合反应的持续时间。对于CPH:SA的合成反应进行了在180℃下，0.3乇，1.5小时，但这些反应条件下将不同的聚合物系统之间变化。

2。组合空白和蛋白质加载聚合物纳米电影图书馆的制造-机器人设置，参见图1

1. 填充在第一可编程注射器泵的注射器用溶剂（空白图书馆）或与蛋白质的溶剂中分散在它（蛋白质的加载库），而在第二注射器的注射器泵为空。在相邻的样品架中的纳米粒子的制造管填充有非溶剂（溶剂非溶剂比例是1到100）。对于膜的制造中，利用一个空的多井板在相邻的样本保持器的管代替。
2. 溶剂使用的LabVIEW程序，存入所有聚合物小瓶/井的库（浓度= 20毫克/毫升），并温育1-5分钟。可以引入一个可选的超声处理工序（30秒，在40赫兹），以确保完整的聚合物溶解。
3. 接着，通过启动一个独立的LabVIEW程序中，样品被撤回到空的注射器中，并沉积到其相应的管的非溶剂（纳米颗粒）或空井（电影），在相邻的样本保持器。
4. 此过程进行的每个组合物中的离散聚合物图书馆。
5. 的纳米粒子或薄膜库，然后放置在一个真空室中的溶剂和非溶剂的除去的纳米粒子（天秤座Ry的，也可以使用真空过滤回收）。

3。高通量蛋白释放动力学

1. 为了研究聚合物库，高通量蛋白释放动力学的一个96油然而生（2ml /孔），聚丙烯板被修改，这样的前1/3的孔壁在相邻的列（如:A和B，除去C和D，E和F，G和H）的相邻孔中。的蛋白质 - 加载膜必须制造或纳米粒子转移到该板来执行高通量的释放动力学研究。蛋白质微纳米粒子或薄膜样品只能放置在一个相邻的列（如:A，C，E，和G）。有关详细信息，请参阅图4。
2. 继转移的纳米颗粒96深涌出释放板，颗粒被让其沉淀。 PBS缓冲液中（0.1毫摩尔，pH7.4）中慢慢地添加到每个样品（列A，C，E和G），然后每个相邻阱（列B，D，F和H）的孔，直到充分和缓冲区是自由流动的在相邻的井。为纳米粒子，这个过程需要格外小心进行，以确保颗粒保持在底部的样品以及（列A，C，E和G），而不是转移到毗邻的版本以及（列B，D，F和H）。在某些情况下，需要离心本地化纳米粒子的样品，在样品的底部（列A，C，E和G）。
3. 接着，释放板用盖子密封，并放置在所需的温度（ 即 37℃），搅拌的条件下的实验的持续时间。
4. 在增加的时间点（ 即 0.04，1，2，3，5，7，9，12，15，19，24及30日）发布的荧光标记的蛋白质的量是量化使用9,400台风平板荧光扫描仪（ GE医疗）。释放板被放置在扫描仪上表面，使用适当的激励激光和发射滤清器扫描遥感，和释放的蛋白的释放井（列B，D，F和H）的量化（图像定量）的荧光强度。有人建议，已知浓度的标准蛋白被包括在用于计算蛋白质的量和荧光猝灭占孔板。

4。代表性的成果

制造的聚合物库后，表征已进行^{GPC，1 H} NMR和FTIR来验证这个组合的方法^1,7,8,11。分子量范围从10,000-20,000 g / mol的，多分散性指数范围从1.5-3.0，和化学组合物已被证明是准确和一致的与常规方法的聚酐合成^12-15。同样，SEM图像的纳米颗粒的图书馆表明类似的表面形态，大小和粒度分布的常规制作的纳米粒子^2。蛋白释放kinetics的聚酐纳米粒子或薄膜的改性孔板中进行，如先前描述^1。结果显示一个近似的带或不带一个脉冲串取决于蛋白质加载和高分子化学（ 图2和图^{3）1,12,14,16的}零级释放。

图1。组合的聚合物膜和纳米粒子的制造装置。

图2。得克萨斯红牛血清白蛋白（TRBSA）的高通量的释放从CPH:SA聚合物纳米粒子库。 SA丰富的聚合物释放封装的最迅速的TRBSA，，而CPH丰富的聚合物化学品释放最慢的。误差线表示标准偏差TION和n = 4。转载许可Petersen 等。人 ^1。版权所有2010年美国化学学会。

图3。高通量释放从CPTEG得克萨斯红牛血清白蛋白（TRBSA）:CPH聚合物膜库。 CPTEG丰富的聚合物释放封装的最迅速的TRBSA，，而CPH丰富的聚合物化学品释放最慢的。误差棒表示标准偏差和n = 3。

图4。图像显示两个相邻的井"之前"和"之后"修改中的96深涌出的聚丙烯板。在右侧的"之后"的修改图像还描绘了另外的聚合物膜（底部以及左）与封装的荧光分子成的缓冲液的情况下被释放的两口井之间。将释放的荧光分子，然后检测以及在右。

讨论

知识库的必要的合成条件和所合成的聚合物的玻璃化转变温度（T _克 ）是必不可少的图书馆制造。如果_的 T g是低于室温下，纳米粒子的制造工序中，可能需要进行在受控温度以下的环境中_的 T g的聚合物。此外，应采取谨慎，以确保所有设备在接触高温和溶剂必须适当处理这些情况。此协议的一些参数可以调整，以适应不同的聚合物体系（ 即 ，温度，真空度，孵育时间，溶剂，非溶剂，聚合物浓度，溶剂，非溶剂的比率，等）合成或颗粒/膜制造。在某些情况下，纳米粒子是稳定的溶剂中进行长时间（足以通过真空干燥除去溶剂），以便两个备用溶剂雷姆椭圆形的方法都可以使用。 1）该颗粒可以被缓慢地离心分离，滗析上清液溶剂，和剩余的颗粒干燥，或2）的颗粒，可以通过真空过滤分离，然后干燥。继制造空白或蛋白质加载纳米颗粒/膜，高通量表征或测试的可以进行筛选的生物材料，蛋白质，细胞，或宿主的相互作用。这种高通量的方法可以快速生物材料的性能优化所需的应用程序。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
名称	公司	目录号
电动XYZ阶段:了3倍T-LSM050A，每轴50 mm行程	Zaber技术	T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000单注射泵	新的时代水泵系统	NE-1000
高硼硅* Vista *的无框可重复使用的玻璃文化管	康宁	07-250-125
玻璃比色皿	科学战略	G102
LabVIEW的	美国国家仪器公司	776671-35
的SGE气密性注射器，露儿禄	Sigma Aldrich公司	509507
U96深孔板1.3 ML＆2.0毫升的	赛默飞世尔科技:Nunc公司	278743
井帽垫	赛默飞世尔科技:Nunc公司	276000
台风9400	GE医疗集团	63-0055-79
Whatman公司级50圈90毫米	Whatman公司	1450-090