本方法描述了可生物降解聚酸酐薄膜和纳米颗粒库的组合合成，以及从这些库中高通量检测蛋白质释放的技术。
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摘要
摘要
聚酸酐是一类具有良好生物相容性和药物递送能力的生物材料。尽管过去已广泛采用传统的单一样品逐一合成方法对其进行研究，但近年来发展出一种高通量的新方法，能够实现大量聚酸酐库的合成与测试1。该方法将显著提高这些生物材料在药物和疫苗递送应用中的优化与设计效率。本文所述方法包括可生物降解聚酸酐薄膜和纳米粒子库的组合合成，以及对这些库中蛋白质释放的高通量检测。在此由机器人操作的方法（图1）中，线性执行器和注射泵由LabVIEW控制，从而实现无需人工干预的自动化流程，避免人为误差。此外，该方法能够快速制备微尺度聚合物库，在减小批次规模的同时，生成多变量的聚合物体系。这种组合合成策略可在合成一种聚合物所需的时间内，完成多达15种不同聚合物的合成。另外，通过将聚合物库溶解于溶剂后沉淀至非溶剂中（用于制备纳米粒子）或通过真空干燥（用于制备薄膜），可将组合聚合物库加工成空白或负载蛋白质的几何结构，如薄膜或纳米粒子。当将荧光染料标记的蛋白质载入聚合物库后，可采用基于荧光的检测方法对蛋白质释放动力学进行高通量评估（图2和图3），如先前所述1。该组合平台已通过传统方法验证2，并对聚酸酐薄膜和纳米粒子库进行了1H NMR和FTIR表征。这些库已系统筛选了蛋白质释放动力学、稳定性及抗原性；体外细胞毒性、细胞因子产生、表面标志物表达、黏附、增殖与分化；以及体内生物分布和黏膜黏附性能1-11。本文开发的组合方法实现了高通量聚合物合成及蛋白质负载纳米粒子与薄膜库的制备，进而可对其进行体外和体内筛选，以优化生物材料性能。
方案
1. 组合聚合物文库合成（聚合物化学结构变化）——机器设置见图1
- 将每种单体溶解于适当的溶剂中（浓度 = 25 mg/ml），并分别装入10 cc气密式注射器中。
- 将耐溶剂的鲁尔锁毛细管连接至每个注射器的末端。
- 将注射器放置在注射泵（New Era Programmable Syringe Pumps）上，并固定到位。
- 将线性驱动器（Zaber）设置至起始位置。
- 使用铁架台夹具，将两根毛细管的末端定位至用于单体沉积的起始样品瓶/孔中。
- 启动LabVIEW程序，该程序根据目标共聚物组成，将不同体积的每种单体泵入各个孔中。程序通过指令Z轴驱动器将毛细管下降至样品瓶/孔内，随后控制各泵 dispensing 所需体积来实现此操作。接着，程序指令Z轴驱动器返回初始位置，并控制X轴和Y轴驱动器移动至下一个样品瓶/孔的位置。此过程持续进行，直至每个孔中均沉积了目标体积的单体。
- 完成单体沉积后，将多孔板或多瓶单体库转移至预热的真空烘箱中，在缩合聚合反应期间保持真空状态进行孵育。对于CPH:SA的合成，反应条件为180 °C、0.3 torr，持续1.5小时，但不同聚合物体系的反应条件会有所差异。
2. 组合式空白与载药聚合物纳米颗粒及薄膜文库的制备——参见图1的机器人装置
- 将第一个可编程注射泵中的注射器装入溶剂（空白库）或含有分散蛋白的溶剂（蛋白负载库），第二个注射泵中的注射器保持空置。相邻样品架中用于制备纳米颗粒的试管内装入非溶剂（溶剂与非溶剂体积比为1:100）。若用于薄膜制备，则在相邻样品架中使用空的多孔板代替试管。
- 通过LabVIEW程序，将溶剂注入聚合物库中的所有小瓶/孔（浓度 = 20 mg/ml），并孵育1–5分钟。可选地加入超声步骤（40 Hz下超声30秒），以确保聚合物完全溶解。
- 接着，启动另一个LabVIEW程序，将样品抽吸至空注射器中，并注入相邻样品架中对应的非溶剂试管（用于制备纳米颗粒）或空孔（用于制备薄膜）中。
- 该过程依次对离散聚合物库中的每种组分进行操作。
- 随后将纳米颗粒库或薄膜库置于真空室中，以去除溶剂和非溶剂（纳米颗粒库也可通过真空过滤方式回收）。
3. 高通量蛋白质释放动力学
- 为研究聚合物库中蛋白质的高通量释放动力学，需对一个96深孔（2 ml/孔）聚丙烯板进行改造，即将相邻列（如A和B、C和D、E和F、G和H）的孔壁上部1/3部分切除，使各孔相互连通。必须在此板中制备载蛋白薄膜或将纳米颗粒转移至其中，以开展高通量释放动力学研究。载蛋白纳米颗粒或薄膜样品仅可放置于相邻列中的一个孔内（如A、C、E和G列）。详见图4。
- 将纳米颗粒转移至96深孔释放板后，静置使其沉降。缓慢向每个样品孔（A、C、E和G列）加入PBS缓冲液（0.1 mM，pH 7.4），随后向每个相邻孔（B、D、F和H列）加液，直至孔完全充满，缓冲液可在连通孔之间自由流动。对于纳米颗粒，此过程需格外小心，确保颗粒保留在样品孔底部（A、C、E和G列），不进入相邻的释放孔（B、D、F和H列）。在某些情况下，需通过离心使纳米颗粒样品沉降至样品孔底部（A、C、E和G列）。
- 随后，用盖子密封释放板，并在实验期间置于设定温度（即 37 °C）下持续振荡。
- 在设定的时间点（即 0.04、1、2、3、5、7、9、12、15、19、24和30天），使用9,400 Typhoon平板式荧光扫描仪（GE Healthcare）定量检测释放出的荧光染料标记蛋白的量。将释放板置于扫描仪表面，选择适当的激发激光和发射滤光片进行扫描，并定量释放孔（B、D、F和H列）中释放蛋白的荧光强度（Image Quant）。建议在孔板中加入已知浓度的蛋白标准品，用于计算蛋白含量并校正荧光染料的淬灭效应。
4. 代表性结果
聚合物库制备完成后，采用1H NMR、GPC 和 FTIR 进行表征，以验证该组合方法的有效性1,7,8,11。分子量范围为 10,000–20,000 g/mol，多分散指数范围为 1.5–3.0，化学组成准确，与聚酸酐合成的传统方法结果一致12-15。类似地，纳米粒子库的扫描电镜（SEM）图像显示，其表面形貌、粒径及粒径分布与传统方法制备的纳米粒子相似2。聚酸酐纳米粒子或薄膜的蛋白质释放动力学在改良的孔板中进行，具体方法如前所述1。结果表明，蛋白质的释放近似为零级释放，是否出现突释效应取决于蛋白质载量和聚合物化学性质（图 2 和 图 3）1,12,14,16。
图 1. 组合式聚合物薄膜与纳米颗粒制备装置。
图2. 来自CPH:SA聚合物纳米颗粒库的德克萨斯红标记牛血清白蛋白（TRBSA）的高通量释放。富含SA的聚合物体系最快释放包封的TRBSA，而富含CPH的聚合物体系释放最慢。误差线表示标准偏差，n=4。经Petersen et. al.1许可转载。版权所有 2010 美国化学会。
图3. 从CPTEG:CPH聚合物薄膜文库中高通量释放德克萨斯红标记的牛血清白蛋白（TRBSA）。富含CPTEG的聚合物体系释放包封的TRBSA速度最快，而富含CPH的聚合物体系释放最慢。误差条表示标准偏差，n=3。
图4. 显示96孔深孔聚丙烯板中两个相邻孔在修饰“前”和“后”的图像。右侧的“修饰后”图像还展示了在左侧孔底部形成含包埋荧光分子的聚合物薄膜，该荧光分子从两孔之间释放至缓冲液中，并在右侧孔中被检测到。
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讨论
了解必要的合成条件和玻璃化转变温度（Tg聚合物合成的特性对于文库制备至关重要。如果 Tgs 低于室温时，纳米颗粒的制备步骤可能需要在低于 T 的受控温度环境中进行g 聚合物的。此外，需注意确保所有接触高温和溶剂的设备均能耐受相应条件。本方案中的多个参数可进行调整（即温度、真空度、孵育时间、溶剂、非溶剂、聚合物浓度、溶剂与非溶剂比例等）以适应不同聚合物体系的合成或颗粒/薄膜制备。在某些情况下，纳米颗粒在溶剂中长时间内（足以通过真空干燥去除溶剂）不稳定，因此可采用两种替代的溶剂去除方法：1）将颗粒缓慢离心，倾去上清液溶剂，随后干燥剩余颗粒；或 2）通过真空过滤分离颗粒，然后进行干燥。在制备空白或载蛋白纳米颗粒/薄膜后，可进行高通量表征或测试，以筛选生物材料在蛋白、细胞或宿主相互作用方面的性能。该高通量方法可实现针对特定应用的生物材料性能快速优化。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢ONR-MURI奖（NN00014-06-1-1176）和美国陆军医学研究与物资司令部（项目编号W81XWH-10-1-0806）提供的经费支持。本研究工作得到了美国国家科学基金会（项目编号EEC 0552584和0851519）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 电动XYZ载物台：3台T-LSM050A，每轴行程50 mm | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 单通道注射泵 | New Era泵系统 | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* 无沿可重复使用玻璃培养管 | 康宁 | 07-250-125 | |
| 玻璃比色皿 | 科学策略 | G102 | |
| LabVIEW | 国家仪器 | 776671-35 | |
| SGE 气密型注射器，鲁尔锁扣 | Sigma Aldrich | 509507 | |
| U96 深孔板 1.3 ml & 2.0 ml | 赛默飞世尔科技：Nunc | 278743 | |
| 封板膜 | 赛默飞世尔科技：Nunc | 276000 | |
| 台风 9400 | GE Healthcare | 63-0055-79 | |
| Whatman Grade 50 圆形滤纸 90 mm | Whatman | 1450-090 |
参考文献
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