本文介绍了一种利用多光谱成像流式细胞术定量分析聚酸酐纳米颗粒或细菌被RAW 264.7细胞摄取的方法。
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摘要
摘要
纳米颗粒系统因其能够高效地将包括蛋白质在内的多种物质递送至抗原呈递细胞，已成为疫苗递送领域的重要工具1-5。抗原呈递细胞对纳米颗粒（NP）的内化是引发针对包封抗原的有效免疫应答的关键步骤。为了确定纳米颗粒配方的改变如何影响其功能，我们致力于开发一种高通量、定量的实验方案，该方案能够同时检测内化纳米颗粒和细菌。迄今为止，显微镜和流式细胞术是研究纳米颗粒吞噬作用所依赖的两种独立技术。流式细胞术具有高通量特性，可生成可靠的统计数据。然而，由于分辨率较低，该方法无法准确区分并量化真正内化的纳米颗粒与结合在细胞表面的纳米颗粒。显微镜可获得高空间分辨率的图像，但耗时较长，且样本量较小6-8。多光谱成像流式细胞术（MIFC）是一种新兴技术，结合了显微镜与流式细胞术的特点，可通过层流核心同时进行多色光谱荧光和明场成像。该技术能够在高速条件下，对荧光信号强度以及不同结构与细胞特征之间的空间关系进行精确分析。
本文介绍了一种利用成像流式细胞术（MIFC）来表征已摄取聚酸酐纳米颗粒或伤寒沙门菌鼠伤寒血清型（Salmonella enterica serovar Typhimurium）的细胞群体的方法。同时描述了纳米颗粒悬液的制备、细胞标记、在ImageStreamX系统上获取数据以及使用IDEAS软件进行数据分析的流程。此外，我们还展示了一种技术的应用，该技术可通过使用细胞松弛素D抑制肌动蛋白介导的吞噬作用，以区分纳米颗粒与细菌的内化途径。
方案
1. RAW 264.7 细胞培养
- 当 RAW 264.7 细胞在培养瓶中达到汇合时，用细胞刮轻轻刮取收获细胞。计数后将细胞以每孔 5 × 105 个细胞的密度接种于 24 孔细胞培养板中，每孔加入 0.5 mL 完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM；含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）、2 mM Glutamax 和 10 mM HEPES），于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育过夜。
2. 致病性 Salmonella enterica 血清型鼠伤寒沙门氏菌14028的转化与培养
- 引入表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒 S. 通过电穿孔法转化伤寒沙门氏菌。首先，准备伤寒沙门氏菌的培养物 Salmonella enterica 血清型鼠伤寒沙门菌（ATCC 14028）在LB肉汤中培养，并于37℃过夜培养 37 °C 通气条件下
- 次日，将1 mL细菌在微量离心机中以最大速度离心收集菌体沉淀。用1 mL预冷的MOPS/甘油溶液（含20%甘油的1 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸（MOPS）缓冲液）重悬菌体，轻轻吹打混匀，共洗涤4次，每次洗涤之间均用移液器轻柔重悬菌体沉淀。9最后一次洗涤后，将沉淀重悬于 50 μL MOPS/甘油，其中约0.5 μg 已加入 pAKgfp1 或 pAKgfplux1 质粒 DNA10.
- 将细胞悬液转移至预冷的1 mm间隙电穿孔比色皿中，使用以下参数进行电穿孔：1800 V，200 W，25 mF。脉冲结束后立即加入1 mL LB培养基，将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。让细胞在 37 °C 在通气条件下培养。一小时后，通过离心浓缩细胞，并重悬于约~100 μL 剩余上清液。
- 最后，将细胞接种到含有LB琼脂平板上 100 μg/mL 氨苄青霉素，并在37°C过夜培养 37 °C单菌落通过含抗生素的平板划线法进行纯化，随后使用标准的异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片组照射以确认绿色荧光蛋白（GFP）的表达。
- 接种含有10 mL LB肉汤 25 μg/mL 氨苄青霉素（或适当的抗生素）用接种环取适量加入 沙门氏菌 已转化并稳定表达GFP。
- 在37°C下过夜培养细菌 37 °C.
- 稀释 沙门氏菌 1:10 稀释至含有 10 mL 添加氨苄青霉素的 LB 培养基的新培养管中，于 37°C 摇床培养 5 h 37 °C.
- 在600 nm处测定培养物的吸光度，并计算其浓度 沙门氏菌 每毫升，依据先前建立的生长曲线。
- 稀释 沙门氏菌 在cDMEM中（每孔0.5 mL），使每个RAW 264.7细胞的感染复数（MOI）为100。
3. 纳米颗粒悬液的制备
- 按照先前所述方法制备载有1% FITC的纳米颗粒11。简言之，采用聚酸酐反溶剂纳米封装法制备颗粒，即将聚合物溶解于二氯甲烷中（4 °C，浓度为25 mg/mL），并在戊烷中沉淀（-30 °C，二氯甲烷与戊烷体积比为1:200）。通过真空过滤回收纳米颗粒。蒸发掉任何残留溶剂后，使用灭菌称量纸称取干燥的聚酸酐纳米颗粒。
- 在1.5 mL微量离心管中，将5 mg纳米颗粒加入0.5 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙、无镁，pH 7.4）中，并置于冰上，直至将其加入RAW 264.7细胞中。
- 将纳米颗粒悬液（保持在冰上）使用配备微探头的超声波液体处理器进行超声处理，功率为4至6焦耳，时间约为25秒。
4. 吞噬作用检测
- 用部分预处理 RAW 264.7 细胞 5 μg/mL 细胞松弛素D处理1小时后引入NP或 沙门氏菌 通过吸除培养基并更换为添加抑制剂的新鲜cDMEM继续培养，将培养物放回 37 °C 培养箱
- 孵育1小时后，从培养箱中取出培养板，涡旋振荡纳米颗粒悬浮液，然后加入 10 μL 加入相应的孔中。
- 涡旋混合 沙门氏菌 以感染复数（MOI）100将细菌加入相应的孔中，感染RAW 264.7细胞。
- 轻敲培养板数次以混匀，并在指定条件下孵育 37 °C 或 4 °C （对照）45 分钟。
- 将培养板从培养箱或冰箱中取出，置于冰上。用预冷的 PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+通过吸除并弃去旧培养基以清除未结合的颗粒， 沙门氏菌以及死亡或脱落的 RAW 264.7 细胞。
- 第二次洗涤后，为收获 RAW 264.7 细胞，加入 250 μL 用预冷的PBS冲洗并轻轻刮取孔板。
- 将收获的细胞用移液器转移至透明盖帽离心管中，并置于冰上保存。
- 加入1 mL冷洗涤缓冲液（含2%热灭活FBS、0.1%叠氮化钠的PBS），洗涤细胞，然后以250 × g离心 g 10 分钟 4 °C.
- 弃去上清液，并将倒置的微量离心管轻触纸巾以去除残留缓冲液。通过轻轻将微量离心管在试管架上来回刮擦，重悬细胞沉淀。
- 通过添加固定 RAW 264.7 细胞 100 μL 在 PBS 中加入 4% 多聚甲醛（PFA），室温（RT）孵育细胞 15 分钟。
- 用 1 mL 破膜/洗涤缓冲液（BD Biosciences）洗涤 RAW 264.7 细胞，250 × g 离心 g 10 分钟 4 °C.
- 重复步骤 4.9。
- 将 RAW 264.7 细胞用鬼笔环肽标记肌动蛋白 100 μl 加入含Alexa Fluor鬼笔环肽660（AF 660；1:150稀释）的Perm/Wash缓冲液，室温孵育15分钟。重复步骤4.11和4.12。
- 将 RAW 264.7 细胞重悬于 50 μL 含1% PFA的PBS中，并避光保存于 4 °C 直至采集完成。
提示与注意事项：
- 在此步骤中应制备单色荧光样品，用于在设置 ImageStreamX 仪器时作为补偿对照。本实验中包含的补偿对照有：与纳米颗粒孵育的 RAW 264.7 细胞（未标记肌动蛋白）；与 Salmonella 孵育的 RAW 264.7 细胞（未标记肌动蛋白）；仅标记肌动蛋白的 RAW 264.7 细胞。
- 对于抑制剂研究，重要的是需包含溶解抑制剂所用的溶剂对照。在本实验中，细胞松弛素-D 溶于 100% DMSO 中。因此，我们将细胞在含有 DMSO 的 cDMEM 中孵育，然后评估纳米颗粒或 Salmonella 的内化情况。我们未检测到培养基组与 DMSO 对照组之间存在显著差异（数据未显示）。
- Amnis 网站上提供的样品制备指南（https://www.amnis.com/images/1__Sample_Prep_Guide_3L_-_0418081.pdf）是检查荧光染料与 ImageStreamX 兼容性的良好资源。用户需先在 Amnis 网站免费注册，方可获取该文件。
5. ImageStreamX 上的样本采集
- 启动 ImageStreamX 并运行 INSPIRE 软件。
- 初始化流体系统。此步骤结束后，应确保 SpeedBeads 正在运行。
- 在文件菜单中，选择加载默认模板。
- 在图像库视图菜单中，选择“全部”，然后点击“运行设置”以开始对微珠成像。
- 调整核心追踪，使图像在横向居中（如有必要）。
- 选择明场（BF）通道，然后点击“设置强度”。
- 等待流速变异系数（Flow Speed CV）持续低于 0.2%。
- 每日对仪器进行校准。在 ASSIST 选项卡中，点击“全部开始”以运行校准和测试，并确认所有项目均通过。
- 按下“冲洗、锁定并加载”（FLL）以加载第一个样本。应首先加载实验中使用每种荧光染料标记的最亮样本。至关重要的是，必须首先运行此样本以确定仪器设置，并且在整个实验过程中不得更改这些设置。
- 开启实验中使用的所有激光器，并设置激光功率，使每种荧光染料在散点图中测得的最大像素值介于 100 至 4000 计数之间。
- 设置细胞分类标准，以排除不需要的物体。若仅需采集细胞数据，请将明场（BF）通道的面积下限设为 50 μm。面积小于 50 μm 的物体将被视为碎片，不予采集。选择需要采集的通道。
- 输入文件名、目标文件夹，将序列号设为 1，并设置需采集的事件数量。
- 点击“运行采集”以收集并保存第一个实验数据文件。
- 点击 FLL 并运行下一个实验样本。重复此步骤，直至所有实验样本均完成采集。
- 点击“补偿设置”（该操作将关闭明场和散射激光，并启用所有通道的采集），从实验中每种单染样本中采集 500 个阳性细胞，用于生成补偿矩阵。
总结来说，样本可按以下顺序进行检测：
- 先检测最亮的样本。
- 其余待测样本。
- 包含单一荧光颜色的补偿对照。
提示与注意事项：
- 可保存并重新加载 INSPIRE 模板以设置仪器参数。模板保存后，可使用自动进样器在无人值守的情况下运行实验样本（使用一个模板）以及每种单色补偿对照（各使用一个对应的模板）。
- 本实验所用 ImageStreamX 的配置：488 nm 和 658 nm 激发激光；785 nm 散射激光；40X（0.75 NA）物镜；六通道系统，配备标准 ISX 滤光片组。使用自动进样器实现样本的无人值守采集。
- 实验采用以下设置：纳米颗粒成像时，488 nm 激光功率设为 10 mW，658 nm 激光设为 50 mW，785 nm 激光设为 2 mW，明场（BF）信号采集于通道 1；沙门氏菌（Salmonella）感染细胞成像时，488 nm 激光功率设为 20 mW，658 nm 激光设为 50 mW，785 nm 激光设为 2 mW，明场（BF）信号同样采集于通道 1。补偿对照样本在无明场（BF）和 785 nm 激光的条件下采集。每种测试样本至少采集 5000 个事件（即细胞）。
6. 图像分析
- 启动 IDEAS 软件，双击“Internalization”向导，并加载一个测试样本的 .rif 文件。
- 在步骤 2 中点击“New Matrix”创建补偿矩阵。此时将启动补偿向导。在实验中添加单色对照文件。按照向导提示点击“下一步”，直至补偿矩阵文件被保存并加载到 Internalization 向导的步骤 2 框中。
- 点击“下一步”并按照提示操作，直到生成一个 .daf 文件。
- 通过选择采集过程中使用的图像通道来设置图像显示属性。点击 Ch 2 (FITC) 和 Ch 5 (AF 660)。（BF 和 SSC 默认已选中）。
- 选择用于生成细胞边界的图像通道（CH01），以及用于收集纳米颗粒或细菌信号的通道（CH02）。
- 系统将生成所有细胞的明场面积与明场长宽比的散点图。通过点击单个数据点并在单细胞群体周围设门，定义单细胞群体。单细胞的长宽比约为 1，双细胞团簇约为 0.5（图 1A）。
- 系统将生成明场图像梯度均方根（Gradient RMS）的直方图，并将图像库中的视图模式设置为选定的区间（图 1B）。点击直方图中的区间，确定处于最佳焦平面的细胞位置，并绘制线状区域以圈选聚焦良好的细胞。梯度均方根值越高，表示聚焦越佳。除非存在其他需要设门的染色信号，否则跳过下一步。
- 系统将生成一个新的散点图，横轴为通道 2 的强度（Intensity of Channel 2），纵轴为通道 2 的最大像素值（Max Pixel of Ch2）（图 1C）。点击数据点并查看对应图像，帮助你在纳米颗粒或细菌阳性的细胞周围绘制设门区域。
- 系统将生成“内化特征”（Internalization feature）的直方图，初始区域从 0 开始，需根据图像观察进行调整（图 1D）。该内化特征为细胞内部荧光强度与整个细胞总强度的比值。其标度设定为：当数值为 0 时，约有一半的荧光信号位于细胞内部。向导通过使用步骤 5 输入的细胞图像创建掩膜，识别细胞表面并将其向内腐蚀 4 个像素，从而定义细胞内部区域。注意，此掩膜可根据不同细胞类型手动调整。在本实验中，我们首先在明场图像上创建一个“对象掩膜”（Object mask），并将其腐蚀 4 个像素，然后基于该腐蚀后的对象掩膜计算内化特征。该特征使我们能够区分内化的颗粒和细菌（其大部分荧光信号位于掩膜边界内）与表面结合的颗粒和细菌（其大部分荧光信号位于掩膜边界外）（图 2）。
- 基于腐蚀后的对象掩膜创建新的内化特征直方图。通过在“选定区间”模式下查看图像，绘制区域以圈选内化细胞。在我们的实验中，该设门阈值设为 0.3。得分低于 0.3 的细胞被视为表面结合颗粒阳性细胞。
- 最后，为排除背景标记的干扰并识别特异性内化的纳米颗粒或细菌，使用了 IDEAS 的“Spot Count”功能。Spot count 是一项用于统计图像中连通区域或小掩膜数量的特征参数。使用“Spot”、“Peak”和“Intensity”等掩膜功能来定义斑点。斑点掩膜可识别图像中亮度高于局部背景、且具有用户指定半径和阈值的细节区域；通过 Peak 函数将高强度区域分割为独立斑点；最终仅纳入强度高于 200 计数的斑点。有关更多信息，请参见 Amnis 斑点掩膜指南（图 1E）。通过在“Reports”菜单中添加多个特征参数，生成一份统计报告模板。
- 将该文件保存为模板文件，用于后续对所有实验文件进行批量分析。
- 在 IDEAS 软件中，点击 Tools→ Batch Data Files，并导入所有 .rif 文件。在相应区域添加补偿矩阵文件（.ctm）和模板文件（.ast）。提交批量任务进行处理。处理完成后，所有 .rif 文件均被分析，并为每个原始文件生成对应的 .daf 文件。最终生成一份包含所有样本统计数据的综合报告文件。
提示与注意事项：
- 使用 IDEAS 软件 4.0 版本及内部化向导（Internalization wizard）并稍作修改进行图像分析。该向导具有自指导功能，按照向导提示操作即可生成输出的 .daf 文件。
7. 典型结果
图2中的代表性图像表明，多光谱成像流式细胞术（MIFC）可成功区分内化（左图）与表面结合（右图）的纳米颗粒（NP）（图2A）或Salmonella（图2B）。NP和Salmonella的内化在抑制肌动蛋白聚合或将温度降低至4 °C时均显著减少（图3A）。在37 °C时，表面结合NP的细胞比例约为8%，经细胞松弛素D处理或在4 °C孵育后，该比例上升至35%以上（图3B）。相比之下，经细胞松弛素D处理后，表面结合Salmonella的细胞比例从35%下降至15%。将RAW 264.7细胞在4 °C与Salmonella共孵育可减少其内化，但与37 °C对照组相比，表面结合的细菌数量无明显增加。综上，这些数据表明，Salmonella和NP通过一种相似的细胞过程被内化，该过程依赖于肌动蛋白并具有温度依赖性。此外，数据还表明，Salmonella在巨噬细胞上的持续黏附需要肌动蛋白聚合。
图1. 用于区分内化与表面结合纳米颗粒的门控策略示意图 沙门氏菌. （A）为了将分析限定于单细胞，必须去除碎片和多细胞事件。使用IDEAS特征将单细胞和双联体与多细胞聚集体分离开来 面积 和 长宽比 明场图像（M01）的面积（Area）指图像的大小，单位为平方微米；长宽比（aspect ratio）为短轴与长轴之比，用于衡量细胞的圆形程度（完美圆形的长宽比为1；双联体细胞通常约为0.5，多细胞聚集体通常小于0.5）。通过绘制区域以圈选单细胞事件（步骤6.6）。(B) 为圈选处于焦内的细胞，使用IDEAS特征 梯度均方根 明场图像的像素强度分布绘制为直方图。梯度均方根（Gradient RMS）特征通过检测图像中像素值的变化来衡量图像的清晰度质量，较高的梯度均方根值表示图像聚焦更佳（步骤6.7）。(C) 通过圈选具有高绿色荧光信号的细胞来选取荧光阳性细胞 最大像素 数值和 强度 在绿色荧光通道中（步骤 6.8）。(D) 吞入 NP 或 沙门氏菌 通过选择内化评分大于或等于0.3的细胞群体来确定内化细胞。评分低于0.3的细胞被视为表面结合（步骤6.9）。(E) “内化”门中的细胞进一步根据斑点数量（NP或STM）进行表征，因为部分存在背景染色的细胞虽被归为内化，但其斑点数值为零（步骤6.11）。各门代表性图像均已展示。 单击此处查看大图.
图 2. 内化及表面结合的纳米颗粒（NP）或沙门氏菌的细胞图像。（A）RAW 264.7 细胞内化 NP 的代表性图像（左图）以及 NP 结合于细胞表面但未内化的细胞图像（右图）。（B）RAW 264.7 细胞内化沙门氏菌的代表性图像（左图）以及沙门氏菌结合于细胞表面但未内化的细胞图像（右图）。
图3. 细胞经细胞松弛素D处理后抑制了纳米颗粒的内化 沙门氏菌. (A) 细胞松弛素-D预处理RAW 264.7细胞 或在以下条件下孵育： 4 °C 降低了NP的发生率或 沙门氏菌 与在相同条件下孵育的 RAW 264.7 细胞相比的内化作用 37 °C 在培养基中。在含有DMSO（即溶剂对照）的培养基中孵育的RAW 264.7细胞对NP的内化水平表现出相似的结果 沙门氏菌 与仅使用培养基相比（数据未显示），用细胞松弛素D预处理RAW 264.7细胞可增加表面结合纳米颗粒的细胞百分比，同时降低表面结合 沙门氏菌.
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讨论
研究表明，基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）或聚酸酐的可生物降解纳米颗粒可用于将包封的抗原或药物递送至靶细胞。这些纳米颗粒被吞噬细胞摄取对其有效性至关重要，因此在设计新型纳米颗粒递送系统时，对内化过程进行定量分析尤为关键。通过该方法，可轻松分析不同细胞类型对纳米颗粒的差异性摄取。迄今为止，传统显微镜和流式细胞术已被用于量化颗粒摄取；然而，这两种方法在高通量和分辨率方面各自存在局限性，因而需要替代性技术来研究内化过程。本文中，我们采用成像流式细胞术（MIFC）分析并比较两种靶标——细菌病原体与合成纳米颗粒——在吞噬作用这一生物学过程中的差异。
采用MIFC吞噬作用检测法来阐明沙门氏菌与纳米颗粒在摄取机制上的差异。需要注意的是，抑制剂可能因其孵育时间和浓度不同而具有细胞毒性；因此在使用前必须预先进行细胞毒性分析（即暴露时间和浓度）13,14。根据其化学组成，纳米颗粒可能具有低于室温的玻璃化转变温度（Tg = 13 °C），因此在室温下会形成聚集体15。为克服聚集问题，我们在将颗粒加入细胞培养物之前进行了超声处理并将其置...
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披露
Sherree L. Friend 供职于 Amnis Corporation，该公司生产 ImageStreamX 系统。
致谢
作者感谢ONR-MURI奖（NN00014-06-1-1176）以及美国陆军医学研究与物资司令部（资助编号W81XWH-09-1-0386和W81XWH-10-1-0806）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RAW 264.7 细胞系 | 美国模式培养物集存库 (ATCC) | TIB-71 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM) | Cellgro | 10-013-CV | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S 11150 | 优质级 |
| Glutamax | GIBCO, 由 Life Technologies 生产 | 35050-061 | |
| HEPES | GIBCO, 由 Life Technologies 生产 | 15630-080 | |
| 24 孔板 | Techno Plastic Products | 92024 | |
| 细胞培养瓶 | Techno Plastic Products | 90151 | |
| 细胞刮刀 | Techno Plastic Products | 99002 | 24 cm |
| Salmonella enterica血清型 Typhimurium | ATCC | 14028 | |
| BTX ECM630 电细胞操作仪 | BTX Technologies | ||
| MOPS | 费希尔科技公司 (Fisher Scientific) | BP308 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| 超声波液体处理器 | Misonix | S-4000 | |
| 细胞松弛素-D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| 甲醛 | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| 洗涤缓冲液 | 含 2% 热灭活 FBS 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 溶液 | ||
| 破膜/洗涤缓冲液 | BD Biosciences | 554714 | |
| 带卡扣盖的透明微量离心管 | Sigma-Aldrich | T4816 | |
| Alexa Fluor 660 标记鬼笔环肽 | Invitrogen | A22285 | |
| ImageStreamX | Amnis Corporation | 100200 | 可选配置：658 nm 激光器、自动进样器 |
| 叠氮化钠 | 费希尔科技公司 (Fisher Scientific) | S 227I-500 |
参考文献
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