由多光谱成像流式细胞仪分析细胞内化纳米粒子和细菌

Summary

在这篇文章中，我们描述了一种方法，利用多光谱成像流式细胞仪量化酸酐纳米粒子或RAW 264.7细胞细菌的国际化。

Abstract

纳米粒子系统已经出现在疫苗交付有价值的工具，通过他们的能力，有效地交付货物，包括蛋白质，抗原提呈细胞^1-5。国际化的纳米粒子的抗原提呈细胞（NP），是在封装的抗原产生有效的免疫反应的关键步骤。为了确定在纳米制定影响功能如何变化，我们寻求开发一种高通量，定量实验的协议，该协议是兼容内在的纳米颗粒以及细菌检测。到今天为止，显微镜和流式细胞仪，两个独立的技术，已用于研究纳米粒子的吞噬功能的方法。流式细胞仪的高通量的性质产生了强大的统计数据。然而，由于分辨率低，不能准确地量化与细胞结合纳米粒子内部。显微镜生成高空间分辨率的图像，H贷款本息偿还期中，它是费时，涉及小样本^6-8。多光谱成像流式细胞仪（MIFC）是一种新技术，采用显微镜和流式细胞仪同时执行层的核心，通过多种颜色的光谱荧光和亮场成像方面。此功能提供了一个准确的分析荧光信号强度和高速蜂窝不同的结构和功能之间的空间关系。

在此，我们描述了一个方法，利用MIFC特征的细胞群体的内在酸酐纳米粒子或沙门伤寒。我们还描述了制备纳米粒子悬浮液，细胞标记，ImageStream ^X系统的采集和分析数据的使用理念的应用。我们也证明了一种技术的应用，可以用来区分国际化带够纳米粒子和细菌athways使用的肌动蛋白介导的吞噬作用的抑制剂细胞​​松弛素 - D。

Protocol

1。 RAW 264.7巨细胞培养

1. 收获RAW 264.7细胞从他们的保温瓶，当他们到达汇合，他们用细胞刮刀轻轻刮。计数和板块他们到1 5 x 10 ⁵细胞密度/以及在完成0.5毫升Dulbecco的修改鹰中等（cDMEM 24孔细胞培养盘; 10％热灭活胎牛血清（FBS），，2毫米Glutamax 10毫米的肝素钠）在5％CO ₂培养箱在37℃孵育过夜。

2。致病性沙门氏菌沙门伤寒14028转型与文化

1. 介绍到 S表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒。鼠伤寒由电击。首先，准备在LB肉汤文化和沙门伤寒（ATCC 14028）与曝气，在37℃孵育过夜。
2. 第二天，颗粒1毫升细菌微量的最大速度。洗细胞FO你轻轻地重新悬浮颗粒之间每次洗⁹移液器-冷MOPS /甘油溶液1毫升（（N-吗啉）丙磺酸（MOPS）在20％甘油缓冲1毫米3）倍。最后一次洗涤后，悬浮在50μL拖把/甘油进入哪〜0.5微克质粒DNA pAKgfp1或pAKgfplux1已增加了¹⁰的颗粒。
3. 细胞悬液转移到预冷藏1毫米的差距电试管和electroporate使用的设置:1800 V，200瓦，25 MF。脉冲传递后，立即加入1 mL LB培养基中，细胞悬液转移到一个新的15 mL管。使细胞在3....

Discussion

有研究表明，聚（乳酸 - 乙醇酸共聚物（PLGA）或酸酐为基础的可生物降解的纳米粒子可以被用于运载包裹抗原或药物靶细胞，其成效是非常重要的吞噬细胞，这些纳米粒子吸收，从而使定量国际化，设计新颖的纳米给药系统的关键，通过使用这种方法。分析，由多种细胞类型的纳米粒子吸收差可以轻松地分析至目前为止，已量化粒子吸收传统的显微镜和流式细胞仪。然而，各自的替代的方法来研究国际化的高吞吐量和决议呼叫限制。在这篇文章中，我们执行MIFC分析特点和比较，吞噬的生物过程如何两类目标的细菌病原体和合成纳米之间的不同。

MIFC phagocytos法用来划定的基本机制的的沙门氏菌吸收到纳米粒子相比差异。应当指出，抑制剂可以杀伤他们的孵化时间和浓度而定，因此事先细胞毒性分析（即，暴露时间和浓度）是必要的，之前，他们使用^13,14。根据他们的化学配方，纳米粒子可以有一个玻璃化转变温度（TG = 13℃）以下逆转录，因此，他们形成了聚集在室温^15。要克服的聚集，我们超声颗粒，并保持他们之前除了细胞培养上冰。纳米粒子吸收的动力学研究提供重要信息，这.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
的RAW 264.7细胞株	美国菌种保藏中心（ATCC）	TIB-71
杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基）	cellgro	10-013-CV
胎牛血清	亚特兰大生物	小号11150	优质甲级
glutamax	Gibco公司	35050-061
肝素钠	Gibco公司	15630-080
24孔板	卟啉	92024
细胞培养瓶	卟啉	90151
细胞刮刀	卟啉	99002	24厘米
血清型鼠伤寒沙门氏菌	ATCC	14028
A型肉毒毒素ECM630电的电池机器人	A型肉毒毒素哈佛仪器
公开资讯观测站	Fisher Scientific则	BP308
磷酸盐缓冲液（PBS）	cellgro	21-040-CV
超声波液体处理器	管理信息系统ONIX	的S-4000
细胞松弛素 - D	Sigma-Aldrich公司，	C8273
甲醛	polysciences	04018
洗缓冲区	2％热灭活胎牛血清，0.1％叠氮钠的PBS。
烫发/洗缓冲区	BD公司	554714
清除查看单元帽微管	西格玛	T4816
鬼笔660的Alexa Fluor	Invitrogen公司	A22285
ImageStream X	amnis语料库TION	100200	选项​​:658nm激光，自动进样器
叠氮化钠	Fisher Scientific则	小号227I-500