方法文章

采用18O富集水的蛋白酶及酸催化标记工作流程

11.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/3891

⸱

2013年2月20日

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

本文内容

摘要

利用18O标记水（LeO-工作流程）的稳定同位素标记方法是蛋白质组学定性和定量研究中的多功能工具。在蛋白酶辅助（PALeO）工作流程中，18O原子通过蛋白酶介导的蛋白水解切割和羧基氧交换反应引入。在酸催化（ALeO）工作流程中，18O原子则在低pH条件下通过羧基氧交换反应引入。

摘要

稳定同位素是生物质谱分析中的重要工具。历史上， 18氧稳定同位素已被广泛用于研究蛋白水解酶的催化机制1-3随着基于质谱的蛋白质组学的发展，酶催化介导的掺入 18来自稳定同位素标记水的O-原子已成为定量比较蛋白质表达水平的常用方法 (由 Fenselau 和 Yao 审阅4，宫城和拉奥5 和 Ye 等6). 18O-标记构成了一种简单且低成本的化学（例如 iTRAQ，ICAT）和代谢（例如 SILAC标记技术7根据所使用的蛋白酶， 18O-标记可导致掺入多达两个 18裂解产物C端羧基中的O原子3标记反应可分为两个独立的过程：肽键断裂和羧基氧交换反应。8. 在我们的PALeO（p蛋白酶-a辅助的 l标记 e使用 18O富酶水的酶促适应性 18O-标记，我们使用了50% 18O标记的水以产生独特的同位素特征。结合高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法（MALDI-TOF/TOF MS/MS），这些特征性同位素分布模式可用于高特异性地鉴定切割产物。我们此前已采用PALeO方法来检测和表征内源性蛋白酶9 并监测蛋白水解反应10-11由于PALeO编码了蛋白水解切割反应的核心本质，其实验设置简单，无需对切割产物进行生化富集步骤。PALeO方法可轻松拓展应用于（i）监测蛋白水解反应动态变化的时间进程实验，以及（ii）在代表生理条件的复杂生物样本中进行蛋白水解分析。PALeO-TimeCourse实验有助于识别复杂蛋白水解通路反应中限速的加工步骤及反应中间体。此外，PALeO反应使我们能够鉴定出具有特定功能的蛋白水解酶，例如丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶（trypsin），其能够重新结合自身的切割产物并催化第二个分子的整合。 18氧原子。这类“双标记”酶可用于消化后 18O标记，即通过羧基氧交换反应对肽段进行特异性标记。我们的第三种策略扩展了标记方法的应用 18O-标记水在酶以外的应用并利用酸性pH条件引入 18将氧稳定同位素标记引入肽段。

方案

本文介绍的 LeO 工作流程可用于蛋白质消化物和合成肽的稳定同位素标记。这些时间过程实验（图1）适用于比较和定量蛋白质组学研究以及蛋白酶研究。每种工作流程包括两个实验步骤（图2）：A）对相应的18O稳定同位素编码反应进行时间分辨取样（蛋白酶催化的肽键断裂；蛋白酶催化的羧基氧交换反应；酸催化的羧基氧交换反应）；B）通过质谱分析并以图形方式展示18O掺入动力学。

A. 时间过程实验

一、PALeO-TimeCourse：蛋白酶催化标记蛋白水解切割位点

  1. （可选）在50 °C下孵育30分钟，使用DTT（终浓度2.5 mM）在25 mM NH4HCO3中还原蛋白质（10 μM）和多肽（250 μM）的二硫键（两者均新鲜配制）。
  2. （可选）在避光条件下，于室温孵育30分钟，使用碘乙酰胺（终浓度10 mM）在25 mM NH4HCO3中烷基化游离半胱氨酸。
  3. 根据所研究的蛋白酶类型，需对蛋白质/多肽溶液进行纯化，以去除残留缓冲液和烷基化试剂。使用PepClean C-18离心柱（Thermo）纯化多肽，使用Vivaspin离心浓缩器（Sartorius）更换蛋白质样品的缓冲液。
  4. 将多肽/蛋白质重新溶解或置换至20 μl蛋白酶反应缓冲液中（ECE-1：50 mM MES-KOH，pH 5.5；胰蛋白酶：25 mM NH4HCO3，pH 8.0），其中含有1:1（v/v）终浓度的H218O（95%，Sigma Isotec）。
  5. 在加入蛋白酶之前，取零时间点样品：将0.5 μl反应混合物与0.5 μl α-氰基-4-羟基肉桂酸基质（10 mg/ml溶于50%乙腈、0.1% TFA）混合。将样品点样于Opti-TOF 384 MALDI靶板（AB SCIEX）上，并在室温下静置至溶剂液滴干燥（约5分钟）。
  6. 将反应溶液分为两份。第一份与目标蛋白酶（ECE-1：75 nM；胰蛋白酶：0.04 nM）在室温或该酶推荐温度下孵育。第二份不加蛋白酶作为对照样品。第一份代表蛋白酶催化的18O标记标准样品，可用于多肽和蛋白质鉴定、蛋白水解活性检测以及蛋白水解切割反应的监测。第二份用于证明18O的掺入是由蛋白酶诱导的；因此，该样品中不应出现标记或切割现象。
  7. 通过在适当的时间间隔取样并按步骤5所述点样来监测反应进程。上述反应条件适用于持续监测蛋白水解反应长达四天（约24个点样）。起始时每5分钟取样一次至30分钟，随后每30分钟一次至2小时，之后每小时一次至8小时，最后每8小时一次直至第4天。切割产物应在前12小时内出现，底物通常在24小时后完全水解。延长反应孵育时间有助于区分稳定的终产物与进一步被加工的反应中间体。根据具体研究问题及酶-底物组合，需调整点样时间和孵育温度，以确保获得最佳的反应取样效果。
  8. 在最后一个反应时间点完成点样后，或在较长的点样间隔期间，将MALDI靶板送至MALDI-TOF/TOF MS/MS分析，具体操作如下文（B部分）所述。

II. PALeO-TimeCourse：蛋白水解末端的消化后标记

  1. （可选）在25 mM NH₄HCO₃缓冲液中，使用DTT（终浓度2.5 mM）还原蛋白质（10 μM）和多肽（250 μM）的二硫键。4HCO3 （均新鲜配制）于50 °C孵育30分钟。
  2. （可选）在25 mM NH4HCO3 在室温下避光孵育30分钟。
  3. 根据目标蛋白酶的不同，需要对蛋白质/肽溶液进行纯化，以去除残留的缓冲液和烷基化试剂。使用PepClean C-18离心柱进行肽段纯化，使用Vivaspin离心浓缩管进行蛋白质缓冲液置换。
  4. 将纯化后的肽段产物/蛋白质重新溶解或置换到20 μl蛋白酶反应缓冲液中（例如 胰蛋白酶：25 mM NH4HCO3，pH 8.0）中，并用目标蛋白酶完全消化例如 胰蛋白酶：0.04 nM；37 °C；12 小时。
  5. 使用 PepClean C-18 离心柱纯化酶切产物。此步骤可消除残留的蛋白酶活性。
  6. 将纯化后的肽段产物重新溶解/置换于 20 μl 蛋白酶反应缓冲液中（胰蛋白酶：25 mM NH4HCO3，pH 8.0）中含1:1（v/v）终体积H218O.
  7. 在加入酶之前，取出零时间点样品：取0.5 μl反应混合物与0.5 μl α-氰基-4-羟基肉桂酸基质（10 mg/ml溶于50%乙腈，0.1%三氟乙酸）混合。将样品点样至MALDI靶板上，室温下静置至溶剂液滴完全干燥（约5分钟）。
  8. 将反应溶液分为两份。第一份将与目标蛋白酶共同孵育（例如 胰蛋白酶：0.04 nM）在室温或特定酶推荐温度下孵育。第二份等分试样将不添加蛋白酶进行孵育，作为对照。第一份等分试样代表蛋白酶催化反应的标准样品 18O-后消化标记可用于肽段和蛋白质的定量。第二个等分试样用于证明 18O-掺入由蛋白酶催化；因此，该样品不应出现标记。
  9. 按照步骤7所述方法，在适当的时间间隔内取出反应等分试样并点样，以监测反应进程。例如，我们最初每5分钟取样一次，持续30分钟，之后每15分钟取样一次，以监测胰蛋白酶催化的羧基氧交换反应。
  10. 在最后一次反应时间点取样后，或在延长的取样间隔期间，将MALDI靶板按以下所述（B部分）进行MALDI-TOF/TOF MS/MS分析。

III. ALeO-TimeCourse：羧基的酸催化标记

  1. 将单个肽段（50 nM）与等体积（v/v）的18O富集水在含有或不含（对照）0.1%（v/v）终浓度三氟乙酸的条件下孵育（总体积30 μl）。
  2. 每天取样反应产物，持续48天：取0.5 μl反应混合物与0.5 μl α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液（10 mg/ml溶于50%乙腈、0.1% TFA）共同点样，直接 spotted 至MALDI靶板上。
  3. 在各点样时间间隔之间，以及最后一次反应时间点点样完成后，将MALDI靶板送至进行MALDI-TOF/TOF MS/MS分析，具体步骤如下文B部分所述。

B. 基质辅助激光解吸电离飞行时间/飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF MS/MS）数据采集与分析

  1. 在4800 MALDI TOF/TOF分析仪（AB SCIEX）上采集质谱数据。
  2. 在分析之前，使用肽标准品混合物（AB SCIEX TOF/TOF 仪器校准用质量标准品试剂盒）对仪器进行校准，质量测量误差容限最大为 ± 50 ppm，且至少匹配六个峰。
  3. MS 质谱（质荷比范围 400 - 4,000） m/z采用正离子模式，以可调激光强度（3,400 - 3,800；步长50）进行三次重复检测，基峰强度的可接受范围为2,000 - 45,000。每个子谱图采集单次激光脉冲信号，每谱图共采集400次总脉冲；当获得800个子谱图（通过或失败）或有400个子谱图满足接受标准时，停止采集。对于丰度较低的样品或存在复杂生物背景的情况，应将质谱检测范围的下限提高至800 m/z。此外，必要时可通过前文所述的样品纯化步骤或液相色谱分离去除盐分及其他干扰化合物。
  4. MS 数据文件（.t2d 文件）从 4000 系列 Explorer 数据采集软件导出后，导入至本实验室自建的信息系统。该系统使用 MASCOT Distiller 软件（Matrix Science）进行质谱图处理和峰检测。同位素峰簇经过去卷积处理 18O-结合比率通过一种类似于Mason所述的算法自动确定 等12 并由我们团队进行了改进9. 或者，可使用 ZoomQuant 等软件工具13 和 Viper14，以及商业软件包如 BioWorks Xpress（Thermo Fisher Scientific）和 Mascot Distiller Quantitation Toolbox（Matrix Science）均可进行去卷积分析 18O型数据15,16. 18O-掺入比例表示为各个肽同位素物种的相对贡献即， 含有肽 16O, 18O1 或 18O2）拟合至整个同位素峰簇。
  5. 对于每个时间过程实验，分子质量（[M+H]+从相关的质谱数据文件中提取所有检测到的肽段种类的质荷比值，并以100 ppm的质量宽度对数值进行分组。
  6. 至少三个 [M+H]+ 需设置以填充一个分组。对于已知底物，将过滤后的分组列表与使用 ExPASy FindPept 工具根据底物肽序列预测的蛋白水解切割产物列表进行比较17 (http://au.expasy.org/tools/findpept.html200 ppm 的质荷比误差容限。
  7. MS/MS 谱图针对 FindPept 工具预测的所有裂解产物质量值以及相应的区间值进行采集 18与之相关的O-掺入。在4800 MALDI TOF/TOF分析仪上以1 kV反射正离子模式采集MS/MS数据，激光强度固定为4200，CID气体处于关闭模式。每个子谱以随机模式采集50次，每点最多采集40个子谱（共产生2,000次采集/点）。
  8. 将MS/MS数据文件（.t2d文件）从4000系列Explorer数据采集软件导出，并导入至本实验室内部的信息系统，进行峰检测，并将MS/MS峰列表与相应的分段MS数据关联。
  9. 为进行肽段鉴定，使用 MASCOT 搜索引擎将 MS/MS 质谱峰列表与 SwissProt 数据库进行比对，搜索参数设置如下：无酶切特异性，母离子质量容差为 150 ppm，碎片离子质量容差为 0.2 Da。
  10. 可使用 Data Explorer 软件（AB SCIEX）通过确认特征性肽段质谱峰来进一步验证肽段鉴定结果 18Shevchenko 描述的 y 系列碎片离子中 O-并入模式 等18.

C. 光谱时间与18O掺入图的制备

光谱时间图： 每个反应时间点的质谱数据文件（.t2d 文件）通过宏从 Data Explorer 软件导出为 ASCII 文件，并导入数据处理与绘图软件程序中例如 Origin（由 OriginLab 开发）并以瀑布图形式展示（图3).

18O掺入图： 对于每个分组的肽段裂解产物，提取所有反应时间点下各个肽段同位素物种（16O、18O1 或 18O2）的相对贡献值，并将其随时间变化作图（图4）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们采用 PALeO-TimeCourse 工作流程，动态监测18O稳定同位素掺入由蛋白水解酶生成的肽段裂解产物的过程。该方法是一种多功能工具，可用于比较研究不同底物与蛋白酶组合下的蛋白水解加工途径。通过在反应过程中多次取样，PALeO-TimeCourse 实验可提供底物与产物丰度及加工细节的时间分辨快照。将样品与酸性基质溶液共点样于靶板上，可终止酶促反应，而基质结晶则进一步保持样品组成稳定。因此，在酶促反应结束后，仍可回溯性地通过 MALDI-TOF/TOF MS/MS 分析各个时间点的样品。为应对此类实验流程产生的大量数据，我们开发了一套半自动化的生物信息学系统，用于计算每条肽段的18O掺入比率。图3展示了ECE-1酶解肽段Endokinin C过程的代表性质谱时间进程图。PALeO-TimeCourse 数据具有多维特性：在整个质荷比范围内展开的质谱数据可同时显示肽段底物及其产物的丰度；时间上的排列使得裂解事件的顺序得以解析，并可确定哪些肽段片段是稳定的裂解产物。对质谱数据的局部放大视图可揭示每条肽段的同位素峰簇，而由裂解引发的18

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

通过以时间分辨的方式结合稳定同位素标记与高分辨率质谱技术，PALeO-TimeCourse 方法能够对肽段产物的生成过程进行动态分析。该检测方法可用于生成稳定同位素标记的肽段，以开展蛋白质组学的定性与定量研究，并评估特征性肽段（proteotypic peptides）生成的动力学过程。此外，PALeO-TimeCourse 旨在体外（ex vivo）特定且具有生理相关性的条件下评估蛋白水解通路。该实验流程可使用内源性蛋白质、肽段和蛋白酶，也可使用合成肽段和重组蛋白酶。根据所研究的具体蛋白水解反应，可调整检测条件和取样时间点，以实现对反应过程的最佳采样。根据我们的经验，适当减缓蛋白水解反应速度（例如，通过使用较低的酶浓度、在室温下进行反应）有助于实现方便的手动取样间隔。 与其他稳定同位素标记方法类似，实验中18O掺入率的测量偏差较小——对于离子统计量充足的峰，通常低于5%。整体实验方案可轻松适配于其他检测形式，例如大规模合成底物的筛选，或对复杂生物样品（例如，细胞培养上清液、体液）中内源性肽段的蛋白水解加工过程进行表征。我们此前...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作得到美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所资助项目1R01DE019796的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PepClean C-18 离心柱Thermo89870
Opti-TOF 384 MALDI 目标靶板AB SCIEX1016629
4800 MALDI TOF/TOFAB SCIEX
表 1. 材料
α-氰基-4-羟基肉桂酸Sigma Aldrich70990-1G-F
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA3294-10G
二硫苏糖醇（DTT）Acros16568-0050
碘乙酰胺（IAM）Sigma Aldrich1149-5G
内皮素转化酶-1（ECE-1）R&D Systems1784-ZN
胰蛋白酶 GoldPromegaV5280
水-18O，97 原子% 18OSigma Aldrich329878-1G
三氟乙酸（TFA）Thermo28904
AB SCIEX TOF/TOF 仪器校准用质量标准品试剂盒AB SCIEX4333604
表 2. 试剂

参考文献

  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156(2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

18 PALeO

相关文章