采用18O富集水的蛋白酶及酸催化标记工作流程

摘要

利用¹⁸O标记水（LeO-工作流程）的稳定同位素标记方法是蛋白质组学定性和定量研究中的多功能工具。在蛋白酶辅助（PALeO）工作流程中，¹⁸O原子通过蛋白酶介导的蛋白水解切割和羧基氧交换反应引入。在酸催化（ALeO）工作流程中，¹⁸O原子则在低pH条件下通过羧基氧交换反应引入。

摘要

稳定同位素是生物质谱分析中的重要工具。历史上， ¹⁸氧稳定同位素已被广泛用于研究蛋白水解酶的催化机制^1-3随着基于质谱的蛋白质组学的发展，酶催化介导的掺入 ¹⁸来自稳定同位素标记水的O-原子已成为定量比较蛋白质表达水平的常用方法 (由 Fenselau 和 Yao 审阅⁴，宫城和拉奥⁵ 和 Ye 等⁶). ¹⁸O-标记构成了一种简单且低成本的化学（例如 iTRAQ，ICAT）和代谢（例如 SILAC标记技术⁷根据所使用的蛋白酶， ¹⁸O-标记可导致掺入多达两个 ¹⁸裂解产物C端羧基中的O原子³标记反应可分为两个独立的过程：肽键断裂和羧基氧交换反应。⁸. 在我们的PALeO（p蛋白酶-a辅助的 l标记 e使用 ¹⁸O富酶水的酶促适应性 ¹⁸O-标记，我们使用了50% ¹⁸O标记的水以产生独特的同位素特征。结合高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱法（MALDI-TOF/TOF MS/MS），这些特征性同位素分布模式可用于高特异性地鉴定切割产物。我们此前已采用PALeO方法来检测和表征内源性蛋白酶⁹ 并监测蛋白水解反应^10-11由于PALeO编码了蛋白水解切割反应的核心本质，其实验设置简单，无需对切割产物进行生化富集步骤。PALeO方法可轻松拓展应用于（i）监测蛋白水解反应动态变化的时间进程实验，以及（ii）在代表生理条件的复杂生物样本中进行蛋白水解分析。PALeO-TimeCourse实验有助于识别复杂蛋白水解通路反应中限速的加工步骤及反应中间体。此外，PALeO反应使我们能够鉴定出具有特定功能的蛋白水解酶，例如丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶（trypsin），其能够重新结合自身的切割产物并催化第二个分子的整合。 ¹⁸氧原子。这类“双标记”酶可用于消化后 ¹⁸O标记，即通过羧基氧交换反应对肽段进行特异性标记。我们的第三种策略扩展了标记方法的应用 ¹⁸O-标记水在酶以外的应用并利用酸性pH条件引入 ¹⁸将氧稳定同位素标记引入肽段。

方案

本文介绍的 LeO 工作流程可用于蛋白质消化物和合成肽的稳定同位素标记。这些时间过程实验（图1）适用于比较和定量蛋白质组学研究以及蛋白酶研究。每种工作流程包括两个实验步骤（图2）：A）对相应的¹⁸O稳定同位素编码反应进行时间分辨取样（蛋白酶催化的肽键断裂；蛋白酶催化的羧基氧交换反应；酸催化的羧基氧交换反应）；B）通过质谱分析并以图形方式展示¹⁸O掺入动力学。

A. 时间过程实验

一、PALeO-TimeCourse：蛋白酶催化标记蛋白水解切割位点

1. （可选）在50 °C下孵育30分钟，使用DTT（终浓度2.5 mM）在25 mM NH₄HCO₃中还原蛋白质（10 μM）和多肽（250 μM）的二硫键（两者均新鲜配制）。
2. （可选）在避光条件下，于室温孵育30分钟，使用碘乙酰胺（终浓度10 mM）在25 mM NH₄HCO₃中烷基化游离半胱氨酸。
3. 根据所研究的蛋白酶类型，需对蛋白质/多肽溶液进行纯化，以去除残留缓冲液和烷基化试剂。使用PepClean C-18离心柱（Thermo）纯化多肽，使用Vivaspin离心浓缩器（Sartorius）更换蛋白质样品的缓冲液。

结果

我们采用 PALeO-TimeCourse 工作流程，动态监测¹⁸O稳定同位素掺入由蛋白水解酶生成的肽段裂解产物的过程。该方法是一种多功能工具，可用于比较研究不同底物与蛋白酶组合下的蛋白水解加工途径。通过在反应过程中多次取样，PALeO-TimeCourse 实验可提供底物与产物丰度及加工细节的时间分辨快照。将样品与酸性基质溶液共点样于靶板上，可终止酶促反应，而基质结晶则进一步保持样品组成稳定。因此，在酶促反应结束后，仍可回溯性地通过 MALDI-TOF/TOF MS/MS 分析各个时间点的样品。为应对此类实验流程产生的大量数据，我们开发了一套半自动化的生物信息学系统，用于计算每条肽段的¹⁸O掺入比率。图3展示了ECE-1酶解肽段Endokinin C过程的代表性质谱时间进程图。PALeO-TimeCourse 数据具有多维特性：在整个质荷比范围内展开的质谱数据可同时显示肽段底物及其产物的丰度；时间上的排列使得裂解事件的顺序得以解析，并可确定哪些肽段片段是稳定的裂解产物。对质谱数据的局部放大视图可揭示每条肽段的同位素峰簇，而由裂解引发的¹⁸

讨论

通过以时间分辨的方式结合稳定同位素标记与高分辨率质谱技术，PALeO-TimeCourse 方法能够对肽段产物的生成过程进行动态分析。该检测方法可用于生成稳定同位素标记的肽段，以开展蛋白质组学的定性与定量研究，并评估特征性肽段（proteotypic peptides）生成的动力学过程。此外，PALeO-TimeCourse 旨在体外（ex vivo）特定且具有生理相关性的条件下评估蛋白水解通路。该实验流程可使用内源性蛋白质、肽段和蛋白酶，也可使用合成肽段和重组蛋白酶。根据所研究的具体蛋白水解反应，可调整检测条件和取样时间点，以实现对反应过程的最佳采样。根据我们的经验，适当减缓蛋白水解反应速度（例如，通过使用较低的酶浓度、在室温下进行反应）有助于实现方便的手动取样间隔。 与其他稳定同位素标记方法类似，实验中¹⁸O掺入率的测量偏差较小——对于离子统计量充足的峰，通常低于5%。整体实验方案可轻松适配于其他检测形式，例如大规模合成底物的筛选，或对复杂生物样品（例如，细胞培养上清液、体液）中内源性肽段的蛋白水解加工过程进行表征。我们此前.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PepClean C-18 离心柱	Thermo	89870
Opti-TOF 384 MALDI 目标靶板	AB SCIEX	1016629
4800 MALDI TOF/TOF	AB SCIEX
表 1. 材料
α-氰基-4-羟基肉桂酸	Sigma Aldrich	70990-1G-F
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A3294-10G
二硫苏糖醇（DTT）	Acros	16568-0050
碘乙酰胺（IAM）	Sigma Aldrich	1149-5G
内皮素转化酶-1（ECE-1）	R&D Systems	1784-ZN
胰蛋白酶 Gold	Promega	V5280
水-18O，97 原子% 18O	Sigma Aldrich	329878-1G
三氟乙酸（TFA）	Thermo	28904
AB SCIEX TOF/TOF 仪器校准用质量标准品试剂盒	AB SCIEX	4333604
表 2. 试剂