使用"单个病毒基因组的单病毒颗粒的分离和基因组分析'

摘要

单一的病毒基因组（SVG）是一种方法来隔离和放大的基因组单virons。病毒悬浮液的混合组合，用流式细胞仪检测到载玻片离散井含琼脂糖，从而捕获病毒粒子和减少下游加工过程中的基因组剪切排序。全基因组扩增是通过使用多重置换扩增（MDA）的产生，是适合用于测序的基因组物质中。

摘要

全基因组扩增和测序的单一微生物细胞使基因组特性，而不需要栽培^1-3。病毒，是无处不在的，我们星球上的⁴最众多的实体和重要的在各种环境中^5，通过类似的方法尚未透露。在这里，我们描述了一种方法，用于分离和表征单个病毒颗粒的基因组被称为"单个病毒的基因组学"（SVG）。 SVG利用流式细胞仪分离单个病毒和全基因组扩增，得到高分子量的基因组DNA（基因组DNA），可以用于在随后的测序反应。

方案

1。病毒悬浮液的制备

通过流式细胞仪分离出单个病毒颗粒之前，准备不固定的病毒悬液。

1. 使用先前建立的协议，确保最终的病毒悬浮液中分离病毒颗粒被包含在0.1微米过滤TE液（Tris-EDTA，pH8）中。我们建议您使用其他方法虽然已开发出采用化学絮凝⁷切向流过滤（TFF）接近^6。
2. 枚举使用既定的协议， 例如 ，使用萤光^8-10或流式细胞仪^11,12的病毒颗粒。
3. 病毒悬浮液的等分试样分成两个Eppendorf管中（最终体积是1,000微升）。

2。流式细胞仪

1. 病毒使用BD FACSAria II流式细胞仪配备一个自定义的前向散射的PMT（FSC PMT）排序，稀释病毒颗粒在0.1微米过滤TE，pH值8。0到适当的事件发生率为200赛事秒^-1滴度。
2. 设置阈值，以最大限度地提高信号与噪声的口粮， 例如 。含有T4和λ噬菌体颗粒的混合组合建议:在1000和SSC FSC PMT 200。
3. 运行100微升的"空白"样品只含有1）0.1微米过滤TE和2）0.1微米的过滤TE和SybrGreen1的1E-4的股票稀释（10,000倍）。
4. 运行一个小等分不染病毒悬浮液（100微升），以评估背景，其次是染病毒悬液（SybrGreen1 1E-4的股票稀释），病毒颗粒共5000事件。这是检查浓度和调整分配门，如有必要，在排序前。我们建议紧栅的中心的病毒颗粒。另外，门，我们使用的SYBR Green和FSC PMT情节。
5. 加入5μl的1％低熔点（LMP）琼脂糖（在TBE缓冲液）冷却至37℃到每个以及在一个聚四氟乙烯（PTFE）的显微镜载片上（电子显微学）。
6. 装入PTF​​E显微镜的幻灯片到流式细胞仪捕捉到排序的病毒颗粒。
7. SYBR绿色染病毒颗粒直接到四氟滑板与LMP琼脂糖开始排序。我们建议使用10个或更多的事件（病毒颗粒）在某些井进行排序，以帮助在共聚焦激光扫描显微镜（CSLM）的深度的病毒的检测。
8. 当排序完成流式细胞仪，删除幻灯片，加入5微升LMP琼脂糖冷却到37°C，每孔，从而嵌入病毒颗粒（次）。

3。可视化单的病毒粒子，利用共聚焦显微镜

如果需要一个单一的病毒粒子，然后确定每个包含一个单独的病毒是势在必行，激光共聚焦显微镜是必要的，以可视化的嵌入式病毒颗粒（S）在3D验证，只有一个单一的粒子存在，而且多种病毒不堆叠在彼此的顶部。

1. 置显微镜激光的波长488 nm激发。
2. 图片嵌入式病毒颗粒使用63X长工作距离的目标。

4。全基因组扩增

1. 井与单一病毒一旦确定与激光共聚焦显微镜，琼脂糖（ 原位 ）内使用多重置换扩增（MDA）进行全基因组扩增。
2. 为了减少引入DNA污染的可能性，取出所需的琼脂糖珠从滑动，并放置在无菌的PCR管中。使用无菌镊子和/或刀片用于此步骤中的一对。
3. 裂解病毒粒子中就地采用热（94℃）的热循环仪的加热块中的3分。
4. 执行以下修改MDA反应下列制造商的建议（GenomiPhi HY试剂盒，GE医疗）
   1. 减少体积的样品和反应BUF指11.25微升和孵化，在30°C，最多2小时，以减少非特异性扩增。
5. 纯化扩增的基因组物质的基因组DNA（基因组DNA）转移到1.7毫升的Eppendorf管中，加1/10体积的3M醋酸钠（醋酸钠）在TBE缓冲液（LMP琼脂糖凝胶制剂中使用的相同的缓冲液）。
6. 将样品（次），在55℃10分钟以溶解琼脂糖。
7. 移动管（S）到42℃，以减少温度之前加入酶。
8. 新增2个β-琼胶每个管和孵化2小时。
9. 加入1倍体积的缓冲液饱和的苯酚溶液的试管中，剧烈混合，在3500×g离心15分钟，离心。将上清转移到新的1.7毫升的Eppendorf管中含有DNA。
10. 添加一个体积100％异丙醇和加入1μlGlycoblue。拌匀倒相管。
11. 在4℃以28,000 xg离心60分钟。倒出异丙醇，确保不打扰颗粒。加入150μl70％ETHA酚每个试管中。旋转28,000的XG及RT 10分钟。倒出乙醇，空气干燥DNA沉淀，并在适当体积的TE缓冲液中重悬DNA。
12. 我们建议以下修改重复步骤4.4-4.9。设置3-5复制MDA反应和减少孵化，在30℃至1小时。池样品后，纯化和沉淀物，用95％-100％的乙醇，以取得所需的浓度。

5。代表结果

图1总结了SVG过程。这些方法使用流式细胞仪检测到病毒颗粒PTFE显微镜载玻片含琼脂糖分离单个的病毒颗粒从混合组合，然后由MDA获得数量足够进行测序的基因组DNA进行排序。

作为一个证明的概念，λ噬菌体T4混合SVG过程^11。病毒颗粒一旦被抓获，并嵌入琼脂糖，激光共聚焦显微镜WA用来在不同可视化和确认一个单一的病毒粒子，得到的结果示于图2中，一旦与单个病毒粒子的孔中被确定，他们被选择为丙二醛（MDA）的基因组DNA。然后，我们使用的多重PCR具体T4和lambda来识别这种病毒的分离， 如图3所示。一个孤立的噬菌体基因组测序选择。

进行基因组测序，使用454-乙酸进行引用映射到识别的覆盖水平得到使用SVG的技术和测序读取。 如图4所示，几乎整个的λ基因组回收（与异常的第5个碱基）。

图1。 SVG方法。含有病毒悬液混合组合减少到单个病毒颗粒通过流式细胞仪则sorted到个人琼脂糖"珠"。该病毒嵌入在琼脂糖珠叠加一层额外的琼脂糖后流式细胞仪分选。最后， 在原位进行全基因组扩增。

图2。激光扫描共聚焦显微镜的排序病毒粒子嵌入在琼脂糖珠A）三维重建的SYBR Green I的的染病毒颗粒内的琼脂糖珠。插图:更高的放大倍率孤立的病毒粒子B）剖面图相对荧光染色的单个病毒颗粒内的琼脂糖珠。

图3。噬菌体鉴定采用PCR A）</ STRONG>多重PCR使用T4和lambda特异性引物的基因型，车道:1。则TrackIT 1 kb的加入水口（Invitrogen公司），2。拉姆达整合（750 bp）的，3。 T4的主要衣壳蛋白（1050碱基对），4。混合的lambda整合和T4的主要衣壳蛋白B）后续的lambda与其他位点特异性PCR进一步证实噬菌体基因组隔离，车道:1。拉姆达整合（750 bp）的，2。拉姆达阻遏（356个基点）3。拉姆达SIE（二重感染排除）（456个基点）4。则TrackIT 1 KB加梯（Invitrogen公司）。

图4。拉姆达基因组属性和覆盖范围。）GC情节，B）的基因组图谱的lambda（改编自http://img.jgi.doe.gov ），和C）的SVG读取映射参考λ噬菌体，x轴基因组的位置，雅红双喜％的覆盖率。

讨论

应用SVG方法时，必须考虑一些重要因素。基因分型，在概念证明型实验^13，是不是保守引物的环境或未知的菌株可在所有病毒组的有效选项。此外，背景DNA合成或非特异性扩增常见的扩增过程中使用MDA反应^14。非特异性扩增已被归因于新兴的反应试剂和/或通过一种机制，允许从随机六聚体在反应混合物中的扩增的DNA污染。当使用病毒的组合，有可能是一个更高的可能性由于作为粒子的显着差异（小区）的大小和基因组DNA的含量的结果，而不是单一的细菌细胞的病毒DNA模板量较低优先扩增的非特异性DNA（ 25-100纳米〜1.5 fg的病毒，如反对0.2-1.5微米〜14 fg的细菌）。建议使用下面的方法，以减少非特异性扩增水平:治疗病毒性组合用DNase I，含有琼脂糖珠利用激光共聚焦显微镜检查病毒，减少的MDA孵化时间，增加了深度测序（ 即能与新一代测序技术454-钛和Illumina公司等）。

执行SVG环境样品时，优化的从头组装必须取得完整或近乎完整的基因组序列。我们已经发现，减少了冗余读出在组装之前是必要的，以取得更大的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X TE 缓冲液	Invitrogen	12090-015
缓冲液饱和苯酚	Invitrogen	15513-039
GenomiPhi HY 试剂盒	GE Healthcare	25-6600-22
Glycoblue	Invitrogen	AM9516	15 mg/ml
LMP 琼脂糖	Invitrogen	16520100
PTFE 显微镜载玻片	电子显微镜科学	63430-04	24 孔，直径 4 毫米
SybrGreen	Invitrogen	S7585	10,000X
β-琼脂酶	New England Biolabs	M0392S