NADPH 氧化酶是吞噬细胞中活性氧（ROS）的主要来源。由于 ROS 具有短暂存在的特性，因此在活体动物中测量和监测 ROS 水平十分困难。本文描述了一种在活体小鼠中连续定量检测 ROS 的微创方法。
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本文内容
摘要
摘要
NADPH 氧化酶是一种介导抗细菌和抗真菌宿主防御的关键酶。除了在抗微生物宿主防御中的作用外，NADPH 氧化酶还具有重要的信号传导功能，可调节炎症反应1。因此，开发一种能够“实时”测定 NADPH 氧化酶来源的活性氧（ROS）生成动力学的方法，有望成为研究与宿主防御、炎症及损伤相关机制的宝贵研究工具。
慢性肉芽肿病（CGD）是一种由NADPH氧化酶缺陷引起的遗传性疾病，其特征为严重感染和过度炎症反应。吞噬细胞NADPH氧化酶的活化需要其胞质亚基（p47phox、p67phox和p40phox）以及Rac蛋白转位至膜结合的黄素细胞色素（由gp91phox和p22phox组成的异源二聚体）。这些NADPH氧化酶组分中任何一个发生功能缺失性突变，均可导致CGD。与CGD患者类似，gp91phox缺陷小鼠和p47phox缺陷小鼠也表现出吞噬细胞NADPH氧化酶活性缺陷以及宿主防御功能受损2, 13。除了含有上述NADPH氧化酶组分的吞噬细胞外，多种其他细胞类型也表达不同亚型的NADPH氧化酶。
本文介绍了一种在活体小鼠中定量活性氧（ROS）生成，并明确NADPH氧化酶在炎症与损伤模型中对ROS产生的贡献的方法。该方法基于ROS与L-012（一种鲁米诺类似物）发生反应，产生可被电荷耦合器件（CCD）记录的发光信号。在对L-012探针的最初描述中，L-012依赖的化学发光可被超氧化物歧化酶完全抑制，表明该反应中检测到的主要ROS为超氧阴离子14。后续研究表明，L-012还可检测其他自由基，包括活性氮物种15, 16。Kielland 等16发现，局部应用强效NADPH氧化酶激活剂佛波酯（phorbol）肉豆蔻酸酯乙酸盐后，可在小鼠中通过发光探针L-012检测到NADPH氧化酶依赖的ROS生成。在该模型中，他们证实p47phox缺陷小鼠的L-012依赖性发光信号完全消失。
我们在以下三种模型中比较了野生型小鼠与NADPH氧化酶缺陷型p47phox-/-小鼠的活性氧（ROS）生成情况2：1）气管内给予酵母多糖（zymosan），这是一种来源于真菌细胞壁的促炎性物质，可激活NADPH氧化酶；2）盲肠结扎穿刺（CLP），一种模拟腹腔内脓毒症并继发急性肺部炎症与损伤的模型；3）经口给予四氯化碳（CCl4），一种依赖ROS的肝损伤模型。选择这些模型旨在分别评估在非感染性炎症、多微生物脓毒症以及毒素诱导的器官损伤背景下，NADPH氧化酶依赖性的ROS生成情况。通过比较野生型小鼠与p47phox-/-小鼠的生物发光信号，我们能够明确由含p47phox亚基的NADPH氧化酶所产生的ROS在这些模型中对生物发光信号的特异性贡献。
生物发光成像结果显示，与p47缺陷小鼠相比，野生型小鼠体内的活性氧水平升高phox-/- 小鼠实验表明，NADPH 氧化酶是炎症刺激下活性氧（ROS）生成的主要来源。该方法为炎症过程中活性氧生成的“实时”监测提供了一种微创的途径。 体内
方案
1. 动物模型
- 小鼠：使用 p47phox-/- 小鼠及年龄和性别匹配的C57BL6/DBA小鼠。实验需获得机构动物护理和使用委员会的批准。
- 麻醉：使用持续异氟烷给药系统诱导麻醉。将异氟烷（2-3%）加入麻醉蒸发系统（VetEquip）。通过观察小鼠的呼吸、运动及对体外刺激的角膜反射，确认其是否完全麻醉。
- 外科手术操作：用70%乙醇擦拭手术区域（工作台面）。佩戴无菌手套、清洁的手术服和口罩。通过剪除小鼠手术部位的毛发，并交替使用聚维酮碘和70%乙醇对切口区域进行消毒，以完成术前准备。在无菌台面上进行手术，并使用无菌器械。术后密切监测小鼠，直至其清醒并能自由活动。
- 气管内给予酵母聚糖
- 按照1.2节所述给予麻醉。
- 用聚维酮碘和70%乙醇对手术区域（颈部）进行消毒，并通过外科解剖暴露气管。
- 用27号针头穿刺气管，并以指定剂量注射酵母聚糖（zymosan，St. Louis, MO） 1 μg/g 使用一个 0.5 μg/μl 溶液（总体积 50 μl （以25 g小鼠为例）溶于无菌PBS中。
- 在无菌条件下，使用5-0无菌丝线缝合小鼠颈部伤口。
- 4 小时和 24 小时后的图像。
- 盲肠结扎穿刺
- 按照1.2节所述实施麻醉。
- 在手术区域（腹部）剪除毛发，并用聚维酮碘和70%乙醇消毒。
- 行正中剖腹切口，辨认盲肠。
- 用4-0丝线结扎暴露的盲肠远端50%，并在结扎部位远端用21号针头穿刺盲肠一次。
- 用4-0无菌丝线缝合切口。
- 4 小时和 24 小时后的图像。
- 口服四氯化碳（CCl₄）诱导小鼠肝纤维化模型4给药
- 按照1.2节所述给予麻醉。
- 给予 CCl₄4 (2 μg/g，美国密苏里州圣路易斯）溶于玉米油后经口服灌胃给予。四氯化碳（CCl4）给药操作应根据机构生物安全委员会（IBC）/环境健康与安全部门（EHS）的政策，在指定区域内进行。
- 4 小时和 24 小时后的图像。
2. 获取生物发光图像
- 启动 IVIS 200（Xenogen Corporation, Alameda, CA）成像系统，设置为发光模式，并等待电荷耦合器件（CCD）温度锁定。
- 选择曝光时间、二乘二像素合并（medium）和光圈值（F/Stop，8）设置。
- 将小鼠仰卧置于成像室内的加热载物台上，以维持正常体温。在小鼠处于 IVIS 成像室时，通过鼻罩给予麻醉，方法见 1.2。
- 在选定的每个成像时间点，通过眶后静脉注射给予溶于无菌 PBS（10 μg/μl）的 L-012（20 μg/g）。
- 在注射 L-012 后 2 分钟开始采集图像。我们通常采用 40 秒的曝光时间。
3. 使用感兴趣区域进行数据分析
- 使用 Living Image 软件 v.4.2（Xenogen Corporation, Alameda, CA）分析数据。
- 打开图像并选择感兴趣区域（Region of Interest）测量工具。
- 将伪彩色数字图像（代表光子检测）叠加到小鼠照片上后，在胸部和/或腹部选择感兴趣区域的形状和大小。
- 定量分析感兴趣区域的信号强度（光子通量）。
4. 统计学
- 使用统计分析软件包对各个时间点进行双向方差分析（ANOVA），并采用 Bonferroni 法进行事后检验。
5. 代表性结果
酵母聚糖（Zymosan）是一种促炎性酵母细胞壁产物，也是NADPH氧化酶的强效激活剂3。我们先前的研究表明，在p47phox-/-小鼠中，经气管给予酵母聚糖所诱导的中性粒细胞性肺部炎症及促炎性细胞因子的产生较野生型小鼠更为显著1。本研究旨在比较酵母聚糖刺激后野生型与p47phox-/-小鼠肺部活性氧（ROS）的生成情况。在气管内给予酵母聚糖4小时后，我们观察到野生型小鼠胸部的光子发射量较基线水平显著增加，且在4小时和24小时时，野生型小鼠的光子发射量均高于p47phox-/-小鼠。相比之下，在酵母聚糖处理后4小时，p47phox-/-小鼠的生物发光信号仍维持在基线水平（图1 A-B）。因此，NADPH氧化酶似乎是酵母聚糖给药后肺部ROS生成的主要来源。
接下来，我们评估了CLP诱导的脓毒症模型中的活性氧（ROS）产生。脓毒症是一种与终末器官损伤相关的危及生命的综合征，包括急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）4, 5。由ROS介导的损伤被认为是驱动脓毒症所致多器官功能障碍的重要因素。我们发现，在野生型小鼠中，CLP术后4小时胸部区域和24小时腹部区域的ROS水平均较基线显著升高。然而，在p47phox-/-小鼠中，这两个时间点的ROS水平与基线相比无明显变化（图2 A-C）。这些结果表明，在CLP诱导的脓毒症小鼠模型中，ROS的生成依赖于NADPH氧化酶。
最后，我们采用生物发光成像技术检测四氯化碳（CCl4）诱导的肝损伤模型中的活性氧（ROS）生成。CCl4可引起肝细胞坏死，已被广泛用于构建急性肝损伤和肝纤维化模型6。与前述的炎症和损伤模型不同，我们发现，在给予CCl4后4小时，p47phox-/-小鼠腹部的ROS生成量较基线水平仅轻度升高（约35%）。然而，野生型小鼠中CCl4诱导的ROS生成幅度显著高于p47phox-/-小鼠（图3 A-B）。这些结果表明，在急性CCl4诱导的肝损伤中，既存在依赖于含p47phox的NADPH氧化酶的ROS生成途径，也存在不依赖该酶的ROS生成机制。
图1. 酵母多糖处理后肺部的活性氧（ROS）生成。A) ROS生成的代表性生物发光成像。注意除了胸部外，在野生型和p47phox-/-小鼠的腹部也可检测到发光信号，且腹部发光强度在酵母多糖处理前后无明显变化。B) 野生型和p47phox-/-小鼠经单次气管内（IT）注射酵母多糖后胸部的光子计数。生物发光成像在基线、4小时和24小时进行。使用图示的伪彩色标尺确定胸部感兴趣区域的光发射强度。结果以均值±标准误表示，每组n=6-9，*=p<0.05。 点击此处查看大图。
图 2. CLP 后 ROS 的检测。A) ROS 产生的代表性生物发光成像，B) 胸部区域的光子计数，以及 C) 野生型和 p47phox-/- 小鼠在 CLP 前（基础状态）、CLP 后 4 小时和 24 小时腹部区域的光子计数。结果以均值 ± 标准误表示；每组 n=4–5，*=p<0.05。 点击此处查看大图。
图3. 四氯化碳（CCl4）诱导肝损伤后腹部活性氧（ROS）的生成。A）野生型和p47phox-/-小鼠在口服CCl4处理前（基础状态）、处理后4小时和24小时的代表性生物发光成像图；B）腹部光子计数结果。数据以均值±标准误（SE）表示；每组n=4–5，*=p<0.05。 点击此处查看高清大图。
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讨论
通过使用荧光和化学发光探针，可实现对活体动物中活性氧（ROS）的“实时”检测。尽管荧光探针存在信噪比较低的问题12，但本文所述成像技术在检测ROS与基于鲁米诺的底物L-012发生化学反应后产生的光发射方面更为灵敏。与所有生物发光成像技术一样，该方法受限于器官和组织对光的波长依赖性吸收和散射。本研究旨在建立在野生型和p47phox-/-小鼠中检测ROS的合适实验条件。利用这些基因修饰小鼠，可使我们区分由含p47phox的NADPH氧化酶产生的ROS与其他途径产生的ROS。
尽管含有p47的功能性NADPH氧化酶phox 是活性氧（ROS）的主要来源，但还存在其他NADPH氧化酶亚型，以及包括黄嘌呤氧化酶和线粒体呼吸在内的额外ROS生成系统也可产生ROS。NADPH氧化酶及其他ROS生成通路在抗菌宿主防御以及调控炎症与损伤的下游信号通路中具有重要且相互关联的作用 7-10利用生物发光成像，我们能够测量活性氧（ROS）生成的...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH RO1 AI079253）和美国退伍军人事务部资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| L-012 | Wako Chemicals USA, Inc. | 120-04891 | |
| 酵母聚糖 | Sigma, St. Louis, MO | Z4250 | |
| 四氯化碳 | Sigma, St. Louis, MO | 289116 |
参考文献
- Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631(2010).
- Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
- Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
- Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
- Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
- Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
- Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
- Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
- Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
- Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
- Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
- Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
- Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
- Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
- Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
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