本文将介绍合成疏水改性Nafion酶固定化膜的方法，以及如何在膜内固定蛋白质和/或酶并测定其特异性活性。
本文内容
摘要
摘要
近十年来，固定化和稳定化酶在生物催化、生物传感器和生物燃料电池等领域得到了广泛应用。1-3 在大多数生物电化学应用中，酶或细胞器通过某种聚合物基质被固定在电极表面。这种聚合物支架应能保持酶的稳定性，并允许分子和离子在基质内外自由扩散。用于此类固定化的大多数聚合物基于聚胺或聚醇——这些聚合物可模拟其所包封酶的天然环境，并通过氢键或离子键稳定酶。另一种稳定酶的方法是使用胶束，其含有可包封并稳定酶的疏水区域。4,5 特别地，Minteer 团队开发了一种基于市售 Nafion 的胶束聚合物。6,7 Nafion 本身是一种胶束聚合物，可借助通道促进质子及其他小阳离子的扩散，但其胶束和通道极小，且由于侧链上的磺酸基团而具有强酸性，不利于酶的固定化。然而，当 Nafion 与过量的疏水性烷基铵盐（如四丁基溴化铵（TBAB））混合时，季铵阳离子会取代质子，成为聚合物侧链上磺酸根的反离子（图 1）。这导致聚合物内部形成更大的胶束和通道，允许大分子底物和对酶功能必需的离子（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD））扩散。这种改性 Nafion 聚合物已被用于固定多种不同类型的酶以及线粒体，应用于生物传感器和生物燃料电池中。8-12 本文描述了一种新型的胶束聚合物酶固定化膜制备方法，可实现酶的稳定化。以下详细说明该胶束酶固定化膜的合成方法、酶在膜内固定化的操作步骤，以及测定固定化酶比活性的分析方法。
方案
1. 使用季铵盐对纳滤膜进行改性
- 剧烈振摇一瓶5% w/v的Nafion悬浮液约30秒，以确保Nafion在溶液中均匀悬浮。
- 用移液器吸取2 mL重新悬浮后的Nafion至玻璃小瓶中（小瓶体积可在2.5 mL至10 mL之间）。
- 称取相对于Nafion聚合物上磺酸基团摩尔量三倍过量的烷基溴化铵盐（适当的质量见表1），并将其加入含有2 mL Nafion的小瓶中。
- 将小瓶在1500 rpm条件下涡旋振荡10–15分钟。
- 将粘稠溶液倒入一个尺寸约为3英寸×3英寸的塑料称量盘中，并用移液器将小瓶中残留的溶液转移至称量盘内。
- 让溶剂从称量盘中缓慢蒸发，最终在称量盘底部形成一层黄色至棕色透明薄膜（图2）。溶剂蒸发速率应控制在全部溶剂完全蒸发所需时间超过6小时为宜。若溶剂蒸发过快，会形成白色、结壳状物质，表明聚合物的胶束结构已被破坏，必须重新开始实验；若蒸发过慢，则可能需要使用除湿机，因为蒸发过慢通常会导致形成黏稠的橙色凝胶，此时也必须重新开始实验。典型的溶剂蒸发温度范围为20–37 °C。实际干燥条件取决于环境的相对湿度和温度，但关键在于干燥过程需足够缓慢以维持胶束结构，又不能过慢而引发凝胶形成。
- 向称量盘中加入18 MΩ·cm的去离子水（10–20 mL），盖上盖子，浸泡12–24小时，以去除多余的烷基溴化铵盐和HBr。
- 倒出（或用移液器吸出）水溶液，并每次用足量去离子水充满称量盘，重复清洗3次。此步骤中需小心避免损失任何聚合物薄膜。
- 将称量盘敞口放置，直至聚合物完全干燥。此时聚合物应为透明且略脆的塑料薄膜。若环境湿度较高，可能需要使用除湿机，以便及时完成蒸发过程。
- 用刮刀小心地将干燥的薄膜从称量盘上剥离，并转移至一个洁净的玻璃小瓶中。
- 加入2 mL乙醇和3颗陶瓷混合珠，涡旋振荡4小时，或直至聚合物薄膜完全重新悬浮。
2. 将酶固定于TBAB修饰的Nafion中以进行活性测定
- 对于干燥的酶，称取1-10 mg酶于1.5 mL微量离心管中，加入1 mL 100 mM pH 7磷酸盐缓冲液，配制成1-10 mg/mL的酶溶液。对于已处于溶液状态的酶，使用二辛可宁酸（BCA）法13测定蛋白含量，并加入适量的100 mM磷酸盐缓冲液，使蛋白浓度达到1-10 mg/mL。1-10 mg/mL通常相当于1-50 nmol/mL。
- 向120 μL的1 mg/mL酶溶液中加入60 μL烷基铵修饰的Nafion溶液，涡旋振荡10秒。（该体系可按比例放大以满足大量重复实验的需求，但需保持酶溶液与聚合物溶液的比例为2:1。）
- 取60 μL酶/聚合物混合溶液分别加入3个独立的1 cm2比色皿底部，室温下静置过夜使其自然干燥。
3. 固定化NAD依赖性脱氢酶酶活性测定
- 向比色皿中加入 1.3 mL 的 50 mM 焦磷酸钠（pH 8.8）、1.5 mL 的 15 mM NAD（新鲜配制）以及 0.1 mL 水。
- 将比色皿放入紫外/可见光分光光度计（例如 ThermoScientific Evolution 260 Bio 和 Thermo Spectronic Genesys 20）中，并设置波长为 340 nm。
- 将分光光度计调零，然后加入 0.1 mL 乙醇。通过轻轻吹吸溶液 5 次混匀试剂。作为空白对照，用 0.1 mL 额外的水代替 0.1 mL 乙醇。
- 在试剂加入比色皿后 5 分钟和 20 分钟时，分别记录 340 nm 处的吸光度。绘制这两个数据点以获得斜率，用于酶活性计算。
4. 固定化PQQ依赖性脱氢酶的测定
- 向比色皿中加入 1.5 mL 磷酸钠缓冲液（pH 7.3）和 200 μL 的 600 μM PMS。
- 将比色皿放入紫外-可见分光光度计中，设定波长为 600 nm，然后将仪器调零。
- 加入 100 μL 的 700 μM DCIP 和 200 μL 待测底物（乙醇、乙醛、甘油、葡萄糖或甘油醛），通过轻轻吹吸溶液 5 次混匀试剂。作为空白对照时，使用 200 μL 水代替待测底物。
- 在试剂加入比色皿后 5 分钟和 20 分钟时，分别记录 600 nm 处的吸光度。
5. 固定化葡萄糖氧化酶的测定
- 向比色皿中加入 2.0 mL 溶液，该溶液含有 0.2 M p-羟基苯甲酸、0.02 % (w/v) 叠氮化钠、128 U 辣根过氧化物酶、0.3 mM 4-氨基安替比林、1 M 磷酸钾和 50 mM 葡萄糖。用移液器上下吹打混合溶液 5 次。
- 将比色皿放入紫外/可见光分光光度计中，并将波长设置为 510 nm。
- 在试剂加入比色皿后 5 分钟和 20 分钟时，分别记录 510 nm 处的吸光度。
6. 代表性结果
若将原始的盐/聚合物共铸膜干燥过快，则会破坏改性Nafion聚合物的胶束结构。图2展示的是正确干燥后的盐/聚合物混合物，形成透明的浅棕色薄膜。若干燥过快，可能导致聚合物形成不透明的白色碎片，因为干燥过程会破坏胶束结构。
将改性Nafion聚合物与酶混合并共铸在比色皿底部后，可利用酶活性测定实验评估酶在聚合物膜内的稳定性。表2-4分别展示了两种脱氢酶和葡萄糖氧化酶固定于不同改性Nafion薄膜中的测定结果。可见，与缓冲溶液中的酶相比，固定化酶表现出更高的活性，表明改性Nafion聚合物实际上可增强某些酶的活性（称为超活性）。而其他酶则因存在传质限制，在固定于聚合物中时其比活性下降（例如纤维素酶和淀粉酶，其底物为较大的大分子）。
| 使用的季铵盐 | 三倍过量 |
| T3A (四丙基溴化铵) | 32.37 mg/ml |
| TBAB (四丁基溴化铵) | 39.19 mg/ml |
| TPAB (四戊基溴化铵) | 46.01 mg/ml |
| TEHA (三乙基己基溴化铵) | 32.37 mg/ml |
| TMHA (三甲基己基溴化铵) | 27.25 mg/ml |
| TMOA (三甲基辛基溴化铵) | 30.66 mg/ml |
| TMDA (三甲基癸基溴化铵) | 34.07 mg/ml |
| TMDDA (三甲基十二烷基溴化铵) | 37.48 mg/ml |
| TMTDA (三甲基十四烷基溴化铵) | 40.89 mg/ml |
| TMHDA (三甲基十六烷基溴化铵) | 44.31 mg/ml |
| TMODA (三甲基十八烷基溴化铵) | 47.71 mg/ml |
表1. 用于Nafion聚合物改性的四烷基铵盐的使用量。
| Nafion 类型 | 酶活性 (U/g) |
| 缓冲液（无聚合物） | 16.63 ± 8.11 |
| Nafion (未修饰) | 9.25 ± 2.21 |
| TMTDA | 3.23 ± 2.92 |
| TBAB | 3.93 ± 3.33 |
| TMDDA | 4.19 ± 1.04 |
| TMOA | 3.51 ± 1.11 |
| TMDA | 8.00 ± 4.53 |
| TMHA | 1.68 ± 1.39 |
| TMHDA | 4.83 ± 0.99 |
| TMODA | 10.45 ± 3.20 |
表2. 固定于选定改性Nafion聚合物中的NAD依赖型葡萄糖脱氢酶活性（注：固定化活性取决于酶的初始比活性）。
| Nafion 类型 | 酶活性 (mU/g) |
| 缓冲液（无聚合物） | 7.18 ± 0.51 |
| Nafion（未修饰） | 70.1± 0.5 |
| TMTDA | 133 ± 6 |
| TBAB | 244 ± 4 |
| TMDDA | 221 ± 6 |
| TMOA | 1.78 ± 0.63 |
| TMDA | 206 ± 5 |
| TEHA | 40.1 ± 50.6 |
| TMHDA | 0 |
| TMODA | 1.45 ± 0.06 |
表3. 固定在选定改性Nafion聚合物中的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶活性（注：固定化活性取决于酶的初始比活性）。
| Nafion 类型 | 酶活性 (U/g) |
| 缓冲液（无聚合物） | 103.61 ± 3.15 |
| Nafion (未修饰) | 19.93 ± 10.10 |
| TMTDA | 247.25 ± 12.49 |
| TBAB | 152.27 ± 5.29 |
| TMDDA | 262.05 ± 6.26 |
| TMOA | 129.18 ± 2.31 |
| TMDA | 141.23 ± 1.97 |
| TMHA | 131.75 ± 2.89 |
| TMHDA | 132.50 ± 1.18 |
| TMODA | 136.50 ± 0.96 |
表4. 固定于选定改性Nafion聚合物中的葡萄糖氧化酶比活性的代表性数据（注：固定化酶活性取决于酶的初始比活性）。
图1. TBAB掺入Nafion聚合物及其在酶固定化中的后续应用示意图。
图 2. Nafion 与 TBAB 初始共铸薄膜的光学照片。缓慢干燥后得到一层透明的浅棕色薄膜，覆盖在称量盘底部。
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讨论
在所述实验步骤中，使用四烷基铵盐对商用纳菲昂（Nafion）进行改性，以制备可形成胶束结构的聚合物，该聚合物可用于酶的固定化与稳定化。本方法中描述的检测表明，该聚合物能够固定多种不同类型的酶，并保持较高的酶活性保留率。如果目标酶的活性非常低或纯度不高，可能需要使用更高浓度的酶溶液，但只要酶的固定化浓度不超过10 mg/mL，通常不会影响固定化过程。该方法的简便性使其区别于其他酶固定化技术，无需任何合成步骤（如聚合物合成或交联反应）。此外，这些合成步骤常常会导致蛋白质变性或显著降低其活性。1 mg/mL的蛋白浓度仅为实现高载酶量所建议的浓度；也可采用较低的酶浓度，但会导致单位体积催化活性降低。理论上，只要酶能够溶解，即可使用更高的酶浓度。
由于这些聚合物可溶于低级脂肪醇（如甲醇、乙醇和丙醇），因此在将聚合物悬浮液与酶混合时，必须存在较高比例的醇。在许多情况下，只要在包埋酶的薄膜成膜后及时蒸发乙醇，这并不会造成问题。然而，如果某种酶完全不耐受醇，在加入改性Nafion悬浮液后会发生变性或沉淀，则这种固定化方法可能存在局限性。在极少数情况下，酶在与改性Nafion悬浮液混合时会发生沉淀...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢美国海军研究办公室、美国大豆委员会和国家科学基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| 季铵盐溴化物 | Sigma-Aldrich | n/a | |
| 乙醇脱氢酶 | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD） | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| 焦磷酸钠 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| 吩嗪硫酸甲酯（PMS） | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-二氯靛酚（DCIP） | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| 对羟基苯甲酸 | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| 过氧化物酶 | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-氨基安替比林 | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| 紫外/可见分光光度计 | Thermo | Evolution 260 Bio 或 Spectronic Genesys 20 | |
| 旋涡混合器（Vortex Genie） | |||
| 分析天平 |
参考文献
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