本文将介绍合成疏水改性Nafion酶固定化膜的方法，以及如何在膜内固定蛋白质和/或酶并测定其特异性活性。
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本文内容
摘要
摘要
近十年来，固定化和稳定化酶在生物催化、生物传感器和生物燃料电池等领域得到了广泛应用。1-3 在大多数生物电化学应用中，酶或细胞器通过某种聚合物基质被固定在电极表面。这种聚合物支架应能保持酶的稳定性，并允许分子和离子在基质内外自由扩散。用于此类固定化的大多数聚合物基于聚胺或聚醇——这些聚合物可模拟其所包封酶的天然环境，并通过氢键或离子键稳定酶。另一种稳定酶的方法是使用胶束，其含有可包封并稳定酶的疏水区域。4,5 特别地，Minteer 团队开发了一种基于市售 Nafion 的胶束聚合物。6,7 Nafion 本身是一种胶束聚合物，可借助通道促进质子及其他小阳离子的扩散，但其胶束和通道极小，且由于侧链上的磺酸基团而具有强酸性，不利于酶的固定化。然而，当 Nafion 与过量的疏水性烷基铵盐（如四丁基溴化铵（TBAB））混合时，季铵阳离子会取代质子，成为聚合物侧链上磺酸根的反离子（图 1）。这导致聚合物内部形成更大的胶束和通道，允许大分子底物和对酶功能必需的离子（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD））扩散。这种改性 Nafion 聚合物已被用于固定多种不同类型的酶以及线粒体，应用于生物传感器和生物燃料电池中。8-12 本文描述了一种新型的胶束聚合物酶固定化膜制备方法，可实现酶的稳定化。以下详细说明该胶束酶固定化膜的合成方法、酶在膜内固定化的操作步骤，以及测定固定化酶比活性的分析方法。
方案
1. 使用季铵盐对纳滤膜进行改性
- 剧烈振摇一瓶5% w/v的Nafion悬浮液约30秒，以确保Nafion在溶液中均匀悬浮。
- 用移液器吸取2 mL重新悬浮后的Nafion至玻璃小瓶中（小瓶体积可在2.5 mL至10 mL之间）。
- 称取相对于Nafion聚合物上磺酸基团摩尔量三倍过量的烷基溴化铵盐（适当的质量见表1），并将其加入含有2 mL Nafion的小瓶中。
- 将小瓶在1500 rpm条件下涡旋振荡10–15分钟。
- 将粘稠溶液倒入一个尺寸约为3英寸×3英寸的塑料称量盘中，并用移液器将小瓶中残留的溶液转移至称量盘内。
- 让溶剂从称量盘中缓慢蒸发，最终在称量盘底部形成一层黄色至棕色透明薄膜（图2）。溶剂蒸发速率应控制在全部溶剂完全蒸发所需时间超过6小时为宜。若溶剂蒸发过快，会形成白色、结壳状物质，表明聚合物的胶束结构已被破坏，必须重新开始实验；若蒸发过慢，则可能需要使用除湿机，因为蒸发过慢通常会导致形成黏稠的橙色凝胶，此时也必须重新开始实验。典型的溶剂蒸发温度范围为20–37 °C。实际干燥条件取决于环境的相对湿度和温度，但关键在于干燥过程需足够缓慢以维持胶束结构，又不能过慢而引发凝胶形成。
- 向称量盘中加入18 MΩ·cm的去离子水（10–20 mL），盖上盖子，浸泡12–24小时，以去除多余的烷基溴化铵盐和HBr。 ....
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讨论
在所述实验步骤中，使用四烷基铵盐对商用纳菲昂（Nafion）进行改性，以制备可形成胶束结构的聚合物，该聚合物可用于酶的固定化与稳定化。本方法中描述的检测表明，该聚合物能够固定多种不同类型的酶，并保持较高的酶活性保留率。如果目标酶的活性非常低或纯度不高，可能需要使用更高浓度的酶溶液，但只要酶的固定化浓度不超过10 mg/mL，通常不会影响固定化过程。该方法的简便性使其区别于其他酶固定化技术，无需任何合成步骤（如聚合物合成或交联反应）。此外，这些合成步骤常常会导致蛋白质变性或显著降低其活性。1 mg/mL的蛋白浓度仅为实现高载酶量所建议的浓度；也可采用较低的酶浓度，但会导致单位体积催化活性降低。理论上，只要酶能够溶解，即可使用更高的酶浓度。
由于这些聚合物可溶于低级脂肪醇（如甲醇、乙醇和丙醇），因此在将聚合物悬浮液与酶混合时，必须存在较高比例的醇。在许多情况下，只要在包埋酶的薄膜成膜后及时蒸发乙醇，这并不会造成问题。然而，如果某种酶完全不耐受醇，在加入改性Nafion悬浮液后会发生变性或沉淀，则这种固定化方法可能存在局限性。在极少数情况下，酶在与改性Nafion悬浮液混合时会发生沉淀.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢美国海军研究办公室、美国大豆委员会和国家科学基金会的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nafion | Sigma-Aldrich | 70160 | |
| 季铵盐溴化物 | Sigma-Aldrich | n/a | |
| 乙醇脱氢酶 | Sigma-Aldrich | A3263 | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD） | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| 焦磷酸钠 | Sigma-Aldrich | P8010 | |
| 吩嗪硫酸甲酯（PMS） | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| 2,6-二氯靛酚（DCIP） | Sigma-Aldrich | D1878 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | G7141 | |
| 对羟基苯甲酸 | Sigma-Aldrich | 240141 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| 过氧化物酶 | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| 4-氨基安替比林 | Sigma-Aldrich | 06800 | |
| 紫外/可见分光光度计 | Thermo | Evolution 260 Bio 或 Spectronic Genesys 20 | |
| 旋涡混合器（Vortex Genie） | |||
| 分析天平 |
参考文献
- Calabrese-Barton, S., Gallaway, J., Atanassov, P. Enzymatic biofuel cells for implantable and microscale devices Chem. Rev. 104, 4867-4886 (2004).
- Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Armstrong, F. A. Enzymes as Working or Inspirational Electrocatalysts for Fuel Cells and Electrol....
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