实时数字成像技术观察大鼠提睾肌缺血-再灌注损伤（IRI）中白细胞与内皮细胞的相互作用

摘要

利用数字活体表层荧光显微镜观察腹股沟肌微循环中毛细血管后微静脉，是研究白细胞-内皮细胞相互作用的便捷方法 体内 在横纹肌组织缺血-再灌注损伤（IRI）中的应用。本文提供了一套详细的操作流程，以安全实施该技术，并讨论其应用范围与局限性。

摘要

缺血再灌注损伤（IRI）与多种病理状态相关，例如脑卒中、心肌梗死、肠缺血，以及器官移植和心血管手术后的并发症。¹ 尽管先前缺血组织的再灌注对于防止不可逆的组织损伤至关重要，但它会引发受累组织的过度炎症反应。除活性氧物质的产生、补体系统的激活和微血管通透性增加外，白细胞的活化也是再灌注过程中炎症性组织损伤病理级联反应中的主要因素之一。^{2, 3} 白细胞活化是一个多步骤过程，包括滚动、牢固黏附和跨内皮迁移，该过程由趋化因子（如补体成分、趋化因子或血小板活化因子）诱导的黏附分子之间复杂的相互作用所介导。⁴

虽然白细胞在毛细血管后微静脉中的滚动主要由选择素与其相应配体的相互作用介导⁵，但白细胞与血管内皮的牢固黏附则是在选择素的调控下，通过与细胞间黏附分子（ICAM）和血管细胞黏附分子（VCAM）结合而实现的^{6, 7}。

金标准用于 体内 观察白细胞-内皮细胞相互作用的技术是活体显微镜技术，该技术于1968年首次被描述。⁸

尽管已有多种器官的缺血-再灌注损伤（IRI）模型被报道^9-12，但仅有少数模型适用于在高质量成像条件下直接观察微血管床中白细胞的募集过程。⁸

本文介绍一种便捷的方法——利用大鼠提睾肌微循环中后微静脉的数字活体表层荧光显微技术¹³，用于对横纹肌组织中缺血-再灌注损伤（IRI）研究中的白细胞募集进行定性和定量分析，并提供了实施该技术的详细操作手册。此外，我们还列举了常见误区并提供了实用建议，以帮助读者充分理解并安全、准确地开展该技术操作。

本文逐步介绍如何在充分监测下启动呼吸控制麻醉，以确保动物在较长时间内维持稳定的麻醉状态。随后，我们描述了如何将提睾肌制备成一层薄而平整的组织，以获得优异的光学分辨率，并提供了在缺血-再灌注损伤（IRI）中进行白细胞成像的实验方案，该方案已在我们的实验室中得到充分验证和建立。

方案

1. 麻醉与监测

1. 在进行动物实验之前，应确保具备相应的国家和机构伦理审批。在获得伦理委员会批准后，使用异氟烷蒸发器将2-3 vol%的异氟烷输送至有机玻璃箱中，然后将体重为120-180 g的雄性Sprague Dawley大鼠放入箱内进行麻醉。
2. 一旦达到适当的麻醉深度（对足趾或尾部夹捏无反应），立即称量大鼠体重，并剃除其腹侧颈部区域的毛发。
3. 将大鼠仰卧位放置于加热垫上，以维持体温在37 °C，并通过硅胶面罩以2 vol%的异氟烷维持麻醉。

以下制备步骤最好在手术显微镜下进行。

4. 进行气管、颈总动脉和颈静脉的准备时，在胸骨上窝区域做一条长约2 cm的横向皮肤切口，并将唾液腺向侧方游离。
5. 此时可见颈部腹侧肌肉。沿中线小心将其分开，找到气管。暴露1 - 2 cm的气管段，并在其下方放置显微镊子以将其抬起。
6. 随后在气管腹侧壁纵向切开约一半深度。注意不要完全切断，否则气管断端会滑入胸腔，难以操作。
7. 将已连接动物呼吸机的Abbocath导管（14G）作为气管插管插入气管下段。提示：必须使用磁性夹具牢固固定，并在导管周围缝合气管以确保气管插管位置稳定。通常使用5/0聚酯（Terylene）缝线，但也可使用类似的缝合材料。
8. 随后可进行容量控制通气（频率：35 - 45次/分钟；潮气量：4.5 - 5 ml；吸入氧浓度FiO₂：0.35 - 0.50；异氟烷浓度：1.5 - 2 vol%）¹⁴。通过维持5至10 mm H₂O的呼气末正压可预防肺不张¹⁵。
9. 进行颈动脉插管时，通过钝性分离右侧胸骨舌骨肌以暴露颈总动脉。
10. 小心将迷走神经与颈总动脉分离，并用斜角显微镊夹住动脉以阻断来自心脏方向的血流。
11. 在颈总动脉下方穿过两根等长的缝线。以心脏为参考方向，远端（靠近头部一侧）的缝线应扎紧以阻断头部方向的血流，近端（靠近心脏一侧）的缝线则松松地环绕动脉。
12. 使用显微剪刀在两条结扎线之间的颈总动脉壁上做一个小切口。
13. 插入一根充满生理盐水、连接压力传感器的聚乙烯导管（内径0.28 mm）。
14. 移除显微镊子，继续将导管向动脉内推进，然后收紧近端结扎线固定导管和动脉。提示：在近端加用第二根缝线可在移除显微镊子后防止出血。
15. 将远端结扎线围绕颈总动脉和导管打结，以提供额外固定。
16. 通过持续监测心率和动脉压来评估麻醉深度。使用血气分析仪进行间歇性动脉血气分析¹⁶。若心率持续低于300次/分钟或超过360次/分钟，或平均动脉压持续低于80 mmHg超过5分钟，应作为实验排除标准^{17, 18}。维持血液pH在生理范围（7.35 - 7.45）内。若因监测指标异常需终止实验，应通过颈椎脱位或放血法处死动物。

对于荧光染料或其他感兴趣药物的静脉应用，请执行以下操作：

17. 使用手术显微镜聚焦左侧颈静脉区域。
18. 双手持镊子，撕开覆盖颈静脉的薄层筋膜以暴露静脉。将静脉置于成角度的显微镊上，此时血流将停止。
19. 用镊子将两段等长的缝合线从颈静脉下方穿过，方向与颈动脉插管一致。将远端缝线在颈静脉周围结扎紧，近端缝线则 loosely 结扎。
20. 在颈静脉上做一个小切口，插入已用生理盐水冲洗过的聚乙烯导管（内径 0.28 mm）。请注意，该处切开和插管操作可能比颈动脉更为困难且耗时。
21. 将导管沿静脉向心脏方向送入，并收紧靠近心脏一侧的结扎线，固定导管和静脉。
22. 确认导管通畅后，结扎远端结扎线并固定导管。提示：使用胶带额外固定两根导管可防止其移位。
23. 频繁冲洗导管，防止管内血栓形成。

2. 提睾肌的制备

1. 我们使用厚度为 1.5 - 2 cm 的铝制载物台进行提睾肌成像。该载物台可迅速达到加热板设定的温度，从而便于对提睾肌组织进行温度控制。这对于炎症研究至关重要。也可使用聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）平台，但对提睾肌温度的调控更为困难。将阴囊置于载物台中央。
2. 在阴囊上方远端末端的皮肤及精索外筋膜上做初始切口，随后使用精细剪刀小心地扩张皮下间隙。操作过程中应避免器械接触下方组织。
3. 一旦组织暴露，即用预热至 37 °C 的含钙镁磷酸盐缓冲液润湿组织。应定期向所有暴露的组织施加该溶液。
4. 仔细去除精索外筋膜与提睾肌之间的结缔组织，使提睾肌从周围组织中游离出来。
5. 随后小心清除提睾肌外表面的结缔组织。在解剖过程中持续进行表面灌流可使结缔组织保持湿润，有利于提高可视性和便于清除。
6. 将提睾鞘的远端缝合固定，以压平并轻微拉伸鞘的末端。
7. 在提睾鞘腹侧远端做切口，并使用显微剪刀将切口向近端延伸。沿切口线小心地使用热电凝止血。应避免不必要的电凝，以减少额外的炎症刺激。提示：此组织损伤会改变制备区域周边的血流动力学¹⁹。因此，为最大限度减少对数据采集的影响，成像时应选择制备区域中心附近的血管。
8. 打开后的提睾肌平铺在铝制基座上，但仍通过一条细韧带与睾丸下方的附睾相连。将睾丸轻轻推向一侧，即可暴露该韧带以及连接附睾的一条小动脉和静脉。使用电凝封闭血管，并用显微剪刀切断睾丸与提睾肌组织之间的结缔韧带。
9. 将分离出的睾丸轻柔地推回腹股沟管内。其他研究者在近端结扎后切除睾丸（睾丸切除术）以及相关的腹股沟脂肪垫²⁰。在如缺血-再灌注损伤（IRI）诱导白细胞活化的敏感模型中，我们力求避免所有额外的手术刺激，因此不进行睾丸切除，通常这并不影响充分暴露提睾肌。
10. 除最初的固定缝线外，再在组织四边（每侧两个）缝线，并将缝线固定于胶带上，以谨慎地将提睾肌组织在铝制载物台上呈放射状展开。在铝制载物台与腹股沟管外口之间留出一定间隙，便于后续进行提睾肌夹闭以诱导缺血。
11. 将两根聚乙烯导管（内径 0.28 mm）的末端置于提睾肌组织附近，用于建立表面灌流系统。确保导管腔内无空气，以避免在液体腔室中产生气泡。
12. 使用注射器在提睾肌周围涂布一圈凡士林（Vaseline）。该圈的范围应略大于用于覆盖的盖玻片。
13. 为形成液体腔室，将一块方形盖玻片（32×32 mm）覆盖在提睾肌组织上，并将边缘牢固地贴附于凡士林圈上。
14. 若未通过特定药物对提睾肌组织进行表面灌流，则无需持续更换周围液体。此时，向所形成的腔室内一次性加入含钙镁的磷酸盐缓冲液即可满足需求。然而，若需局部施加药物，则应通过微灌注泵以每小时 3 ml 的速率持续灌流给药。
15. 提睾肌组织现已准备就绪，可用于显微成像。

3. 活体实验装置

基本的活体成像装置可能有所不同。进行落射荧光成像时，实验应在暗室中进行。

1. 将动物转移至配备470 nm LED透射光源的活体落射荧光显微镜载物台上。使用水浸物镜（20×/1.0）实现约800倍的放大倍数。通过高分辨率数字相机记录观察结果，并将数据存储于个人计算机中以供离线分析。
2. 通过颈静脉导管以每公斤体重0.4 mg的剂量静脉注射罗丹明6G，用于白细胞标记。
3. 选择一个可供观察的终末小静脉。血管直径应在20-60 μm 且血流应充足。为尽量减少组织预激活的影响，仅选择白细胞滚动未发生的血管 <20个细胞/30秒及贴壁细胞数量 <10 个细胞/200μm 小静脉内皮可用于进一步分析。
4. 如果可能，最多可选择三条后微静脉进行观察；但应确保它们位于阴囊肌组织的相应区域，以避免在不同时间点混淆不同血管。

4. 缺血-再灌注损伤（IIR）

1. 让组织稳定 30 分钟。
2. 进行 30 秒的录像，以建立白细胞滚动和黏附的基础值。理想情况下，总共生成三次基础录像，以验证细胞数量并获得标准差。
3. 使用施用镊子，将 Biemer 血管夹轻轻放置在暴露的提睾肌组织最近端。血流停滞应立即发生，并可通过落射荧光显微镜在观察的血管段中可视化。
4. 可根据所需的损伤程度采用不同的时间进程。我们采用其他作者所述的 30 分钟缺血时间^21-23。之后移除血管夹。再让血流稳定 15 分钟。
5. 在再灌注期间可进行多次持续 30 秒的录像（例如每 15 分钟 30 秒）。将录像以数字方式保存，用于离线分析。
6. 实验结束时，在充分麻醉下通过颈椎脱位处死大鼠：用钝器（如剪刀钝缘）压住颅底，另一只手快速牵拉尾根部，导致颈椎与颅骨分离。

5. 离线视频回放分析

1. 对于离线视频回放分析，建议使用能够选择特定画面并以慢速观察视频序列的软件。适当调整对比度和亮度。我们使用显微镜制造商提供的软件，该软件支持长度测量和数字放大功能。
2. 在定量分析白细胞滚动时，需定义一条垂直于血管的虚拟线，并确保在所有记录中保持一致。在30秒内手动计数通过该线的滚动白细胞数量。
3. 在定量分析黏附白细胞时，需定义一段长度为200 μm的血管区域，并在所有记录中保持一致²³。计数在30秒内保持静止、清晰可见的白细胞数量，此类细胞即定义为黏附白细胞²⁴。

6. 代表性结果

提睾肌的缺血再灌注损伤对平均动脉压（MAP）、心率和血液pH值无影响

利用上述装置（图1），我们对缺血再灌注损伤（IRI）中的微循环进行了为期两小时的观察；然而，也可实现长达6小时的更长时间观察。如图2所示，提睾肌的缺血再灌注损伤对大鼠循环系统无显著宏观血流动力学影响，因为平均动脉压和心率在整个观察期间保持稳定。此外，我们通过频繁检测动脉血pH值来监测内环境稳态，其值均处于生理范围内，且组间无显著差异。

缺血再灌注损伤（IRI）诱导腹股沟部微循环中白细胞滚动

白细胞与内皮细胞的相互作用是急性炎症中的关键事件。通过活体显微镜观察，我们发现提睾肌缺血再灌注损伤（IRI）中滚动白细胞数量随时间呈依赖性增加（图3A），与既往研究结果一致^{21, 25}。在再灌注2小时的观察期内，滚动白细胞数量逐渐上升，在再灌注120分钟时达到基础值的137.63 ± 22.55%，与假手术动物相比差异具有统计学意义（137.63 ± 22.55% vs 99.43 ± 14.04%基础值）。

缺血-再灌注损伤（IRI）可诱导腹股沟部微循环中的白细胞黏附

为了进一步评估白细胞与内皮细胞的相互作用，我们在一段200 μm的血管区域中分析了白细胞的黏附情况。缺血-再灌注损伤（IRI）导致黏附白细胞数量增加，在再灌注60分钟后显著高于假手术动物的数值（分别为基线值的118.33 ± 6.83% 与 96.27 ± 5.78%），并在再灌注120分钟时进一步上升（图3B）。

综上所述，所述方法 体内 该模型在确保动物存活和循环稳定的同时，提供了缺血再灌注损伤（IRI）中急性白细胞活化的一致数据。

图1. A. 大鼠提睾肌缺血-再灌注损伤中活体落射荧光显微镜操作流程图。 在完成麻醉和监测所需的准备后，暴露大鼠提睾肌以进行成像。在组织缺血前后记录白细胞活化情况。后续视频分析最好离线进行。B. 拟议的活体成像装置示意图。 点击此处查看大图。

图 2. 提睾肌缺血-再灌注损伤对平均动脉压（MAP）、心率和血液 pH 值无影响。 平均动脉压（A）和心率（B）通过右侧颈动脉插管连接压力传感器，在整个实验过程中每 30 分钟监测一次。动脉血 pH 值（C）在 0、60 和 120 分钟时进行测量。数据为 6 只不同大鼠的均值 ± 标准误（SEM），各项指标均处于生理水平范围内，组间无显著差异。 点击此处查看高清大图。

图3. 缺血-再灌注损伤（IRI）增加提睾肌循环中白细胞与内皮细胞的相互作用。 通过罗丹明6G（0.4 mg/kg体重）标记白细胞后，采用活体落射荧光显微镜检测在30分钟组织缺血后的120分钟再灌注过程中白细胞与内皮细胞的相互作用。图像采集时放大倍数约为×800。A. 在再灌注120分钟时，IRI显著增加了提睾肌后微静脉中滚动白细胞的数量，而在未经历缺血的提睾肌组织中，白细胞滚动在整个实验过程中保持稳定。数据为6只观察大鼠的均值±标准误（SEM）。# p<0.05，采用非配对t检验。B. 在随机选择的一段200μm长的后微静脉中，经过30分钟提睾肌缺血及随后60分钟组织再灌注后，黏附白细胞数量显著增加；再灌注两小时后结果更为显著。数据为6只观察大鼠的均值±SEM。# p<0.05，采用非配对t检验。C. 缺血前（左）和IRI后120分钟（右）后微静脉的代表性图像。 点击此处查看高清大图。

讨论

白细胞-内皮细胞相互作用、活性氧物质的产生以及补体系统的激活是缺血-再灌注损伤（IRI）所致组织功能障碍的关键特征。²⁶ 受影响组织的微循环被认为是炎症启动的关键整合位点。除了 离体 例如流室实验^{27, 28} 必须提供成熟的活体成像模型，以进一步评估 体内 相关性。尽管缺血再灌注损伤（IRI）已知涉及多个器官系统，但本文介绍了一种系统性检测骨骼肌组织再灌注损伤中白细胞-内皮细胞相互作用的方法，该方法最初由 Baez 等人描述。 ¹³，因此在皮瓣手术中尤为重要（图1).²⁹ 由于推测其他器官的缺血后组织损伤涉及相同的炎症机制，该描述的模型可用于获得关于缺血-再灌注损伤（IRI）病理生理机制的基本认识，这些机制在心肌梗死、脑卒中或肠缺血等疾病中具有相关性。

使用的动物

本文介绍的模型适用于大多数啮齿类动物，包括大鼠和小鼠。由于该模型需要长时间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器名称：	公司：	目录编号：	备注：
Forene 100% (V/V)	Abbot	B506	活性成分为异氟烷（isoflurane）
聚对苯二甲酸乙二醇酯缝合线（Terylene Suture）	Serag Weissner	OC108000
Portex 细内径聚乙烯导管	Smiths Medical	800/100/100	内径 0.28 mm
0.9% 生理盐水溶液	Fresenius Kabi	808771
Change-A-tip 高级电凝套装	Bovie Medical	DEL1
Abbocath-T 14G	Venisystems	G713 - A01	用作透镜管
Servo 呼吸机 900C	Maquet		用作动物呼吸机
Logical 压力传感器	Smiths Medical	MX1960
Sirecust 404 监护仪	Siemens
ABL 700 台式分析仪	Radiometer		用于血气分析
加热垫	Effenberger	8319
铝制载物台	Alfun	AW7022
手术显微镜 OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
显微外科器械实验套装	S&T	767
Biemer 血管夹	Diener	64.562
施夹钳	Diener	64.568	用于夹持 Biemer 血管夹
罗丹明 6G（Rhodamine 6G）	Sigma-Aldrich	R4127
白色凡士林 DAB	Winthrop	2726853
盖玻片			32×32 mm
活体显微成像系统
Zeiss Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeiss	490036	落射荧光显微镜
470 nm LED	Carl Zeiss	423052	荧光光源
Colibri 2 系统	Carl Zeiss	423052
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC	Carl Zeiss	421452	水浸物镜
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire	Carl Zeiss	426509	高分辨率数字相机
Axio Vision LE 软件	Carl Zeiss	410130	用于离线分析