实时数字成像技术观察大鼠提睾肌缺血-再灌注损伤（IRI）中白细胞与内皮细胞的相互作用

摘要

利用数字活体表层荧光显微镜观察腹股沟肌微循环中毛细血管后微静脉，是研究白细胞-内皮细胞相互作用的便捷方法 体内 在横纹肌组织缺血-再灌注损伤（IRI）中的应用。本文提供了一套详细的操作流程，以安全实施该技术，并讨论其应用范围与局限性。

摘要

缺血再灌注损伤（IRI）与多种病理状态相关，例如脑卒中、心肌梗死、肠缺血，以及器官移植和心血管手术后的并发症。¹ 尽管先前缺血组织的再灌注对于防止不可逆的组织损伤至关重要，但它会引发受累组织的过度炎症反应。除活性氧物质的产生、补体系统的激活和微血管通透性增加外，白细胞的活化也是再灌注过程中炎症性组织损伤病理级联反应中的主要因素之一。^{2, 3} 白细胞活化是一个多步骤过程，包括滚动、牢固黏附和跨内皮迁移，该过程由趋化因子（如补体成分、趋化因子或血小板活化因子）诱导的黏附分子之间复杂的相互作用所介导。⁴

虽然白细胞在毛细血管后微静脉中的滚动主要由选择素与其相应配体的相互作用介导⁵，但白细胞与血管内皮的牢固黏附则是在选择素的调控下，通过与细胞间黏附分子（ICAM）和血管细胞黏附分子（VCAM）结合而实现的^{6, 7}。

金标准用于 体内 观察白细胞-内皮细胞相互作用的技术是活体显微镜技术，该技术于1968年首次被描述。⁸

尽管已有多种器官的缺血-再灌注损伤（IRI）模型被报道^9-12，但仅有少数模型适用于在高质量成像条件下直接观察微血管床中白细胞的募集过程。⁸

本文介绍一种便捷的方法——利用大鼠提睾肌微循环中后微静脉的数字活体表层荧光显微技术¹³，用于对横纹肌组织中缺血-再灌注损伤（IRI）研究中的白细胞募集进行定性和定量分析，并提供了实施该技术的详细操作手册。此外，我们还列举了常见误区并提供了实用建议，以帮助读者充分理解并安全、准确地开展该技术操作。

本文逐步介绍如何在充分监测下启动呼吸控制麻醉，以确保动物在较长时间内维持稳定的麻醉状态。随后，我们描述了如何将提睾肌制备成一层薄而平整的组织，以获得优异的光学分辨率，并提供了在缺血-再灌注损伤（IRI）中进行白细胞成像的实验方案，该方案已在我们的实验室中得到充分验证和建立。

方案

1. 麻醉与监测

1. 在进行动物实验之前，应确保具备相应的国家和机构伦理审批。在获得伦理委员会批准后，使用异氟烷蒸发器将2-3 vol%的异氟烷输送至有机玻璃箱中，然后将体重为120-180 g的雄性Sprague Dawley大鼠放入箱内进行麻醉。
2. 一旦达到适当的麻醉深度（对足趾或尾部夹捏无反应），立即称量大鼠体重，并剃除其腹侧颈部区域的毛发。
3. 将大鼠仰卧位放置于加热垫上，以维持体温在37 °C，并通过硅胶面罩以2 vol%的异氟烷维持麻醉。

以下制备步骤最好在手术显微镜下进行。

4. 进行气管、颈总动脉和颈静脉的准备时，在胸骨上窝区域做一条长约2 cm的横向皮肤切口，并将唾液腺向侧方游离。
5. 此时可见颈部腹侧肌肉。沿中线小心将其分开，找到气管。暴露1 - 2 cm的气管段，并在其下方放置显微镊子以将其抬起。
6. 随后在气管腹侧壁纵向切开约一半深度。注意不要完全切断，否则气管断端会滑入胸腔，难以操作。
7. 将已连接动物呼吸机的Abbocath导管（14G）作为气管插管插入气管下段。提示：必须使用磁性夹具牢固固定，并在导管周围缝合气管以确保气管插管位置稳定。通常使用5/0聚酯（Terylene）缝线，但也可使用类似的缝合材料。
8. 随后可进行容量控制通气（频率：35 - 45次....

讨论

白细胞-内皮细胞相互作用、活性氧物质的产生以及补体系统的激活是缺血-再灌注损伤（IRI）所致组织功能障碍的关键特征。²⁶ 受影响组织的微循环被认为是炎症启动的关键整合位点。除了 离体 例如流室实验^{27, 28} 必须提供成熟的活体成像模型，以进一步评估 体内 相关性。尽管缺血再灌注损伤（IRI）已知涉及多个器官系统，但本文介绍了一种系统性检测骨骼肌组织再灌注损伤中白细胞-内皮细胞相互作用的方法，该方法最初由 Baez 等人描述。 ¹³，因此在皮瓣手术中尤为重要（图1).²⁹ 由于推测其他器官的缺血后组织损伤涉及相同的炎症机制，该描述的模型可用于获得关于缺血-再灌注损伤（IRI）病理生理机制的基本认识，这些机制在心肌梗死、脑卒中或肠缺血等疾病中具有相关性。

使用的动物

本文介绍的模型适用于大多数啮齿类动物，包括大鼠和小鼠。由于该模型需要长时间.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器名称：	公司：	目录编号：	备注：
Forene 100% (V/V)	Abbot	B506	活性成分为异氟烷（isoflurane）
聚对苯二甲酸乙二醇酯缝合线（Terylene Suture）	Serag Weissner	OC108000
Portex 细内径聚乙烯导管	Smiths Medical	800/100/100	内径 0.28 mm
0.9% 生理盐水溶液	Fresenius Kabi	808771
Change-A-tip 高级电凝套装	Bovie Medical	DEL1
Abbocath-T 14G	Venisystems	G713 - A01	用作透镜管
Servo 呼吸机 900C	Maquet		用作动物呼吸机
Logical 压力传感器	Smiths Medical	MX1960
Sirecust 404 监护仪	Siemens
ABL 700 台式分析仪	Radiometer		用于血气分析
加热垫	Effenberger	8319
铝制载物台	Alfun	AW7022
手术显微镜 OPMI 6-SDFC	Carl Zeiss
显微外科器械实验套装	S&T	767
Biemer 血管夹	Diener	64.562
施夹钳	Diener	64.568	用于夹持 Biemer 血管夹
罗丹明 6G（Rhodamine 6G）	Sigma-Aldrich	R4127
白色凡士林 DAB	Winthrop	2726853
盖玻片			32×32 mm
活体显微成像系统
Zeiss Axio Scope A-1 MAT	Carl Zeiss	490036	落射荧光显微镜
470 nm LED	Carl Zeiss	423052	荧光光源
Colibri 2 系统	Carl Zeiss	423052
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC	Carl Zeiss	421452	水浸物镜
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire	Carl Zeiss	426509	高分辨率数字相机
Axio Vision LE 软件	Carl Zeiss	410130	用于离线分析