本文介绍了一种通过乳头将脂多糖注射到哺乳期小鼠乳腺中以模拟乳腺炎的技术，乳腺炎通常由细菌感染引起。通过NF-κB荧光素酶报告小鼠的生物发光成像可观察到，脂多糖注射导致核因子κB（NF-κB）信号通路增强。
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摘要
摘要
为了严格研究疾病进展的各个阶段及其相关机制，并最终作为临床前模型来测试干预措施，人类疾病的动物模型是必不可少的。在这些方法中，我们描述了一种技术：通过乳头将脂多糖（LPS）注射到哺乳期小鼠的乳腺中，从而有效模拟乳腺炎，即乳腺的炎症。这种模拟感染会导致核因子κB（NF-κB）信号通路的增强，可通过NF-κB荧光素酶报告小鼠的生物发光成像进行观察1。
开发这些方法的最终目标是研究哺乳期乳腺中与乳腺炎相关的炎症反应，这种炎症通常包括红肿和免疫细胞浸润2,3。因此，我们充分认识到，不能在实验方法中采用任何对皮肤、乳头或腺体进行切口或造成损伤的方式来导入LPS，因为此类操作很可能干扰对炎症反应的准确读取。同时，我们希望采用一种简便直接的方法，无需使用手工拉制的移液管或显微操作仪来固定特殊工具。因此，我们决定采用市售的胰岛素注射器，将试剂注入完整乳头的乳腺导管内。该方法取得了成功，使我们能够在排除注射过程本身带来的额外影响的前提下，研究LPS注射所引发的炎症反应。此外，该方法还结合了NF-κB荧光素酶报告基因转基因小鼠及生物发光成像技术，从而以可视化和定量的方式展示LPS注射乳腺中NF-κB信号通路的增强4。
这些方法对希望在哺乳期乳腺中建立疾病模型的多学科研究人员具有重要意义，因为本文所述技术可用于注射多种物质，而不仅限于脂多糖（LPS）。
方案
所有动物实验均经范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 转基因小鼠的制备
- 使用携带 NGL（NF-κB-GFP-L荧光素酶）报告转基因（此前已有描述1）的雌性小鼠进行本实验。当雌鼠至少达到6周龄时，将其与FVB野生型雄鼠交配。可采用后宫式繁殖（每笼最多4只雌鼠与1只雄鼠共同饲养）。（请注意：本研究使用的是FVB品系小鼠。其他毛色较深的品系小鼠如C57Bl6也可使用，但成像前必须剃毛）。
- 从交配后第15天开始，定期检查雌鼠是否出现妊娠迹象（腹部明显膨大）。一旦发现雌鼠怀孕，应立即将其单独饲养，并在最后一只雌鼠确认怀孕后，将雄鼠从繁殖笼中移除。
- 密切观察单独饲养的雌鼠，并记录产仔日期。每窝至少需要6只仔鼠才能保证充分泌乳。在产仔后第8天，开始执行本实验方案（实验时间线示意图见图1）。
2. 注射前准备
- 将大肠杆菌（E. coli）脂多糖（LPS）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为 0.1 μg/μl 的溶液。每只乳腺将注射 50 μl 该溶液，即总共 5 μg。另准备一管仅含 PBS 的溶液，用于对照注射。
- 设置体视显微镜和异氟烷麻醉设备。应将鼻罩装置固定在体视显微镜的载物台上，用于放置小鼠。同时应准备好良好的光源，可来自显微镜本身或额外的聚光灯。
- 设备准备就绪后，启动异氟烷麻醉机并开启气流。
3. 脂多糖导管内注射
- 用短针注射器吸取 50 μl LPS 溶液，置于一旁备用。
- 通过将雌鼠放入充满异氟烷的麻醉箱中开始麻醉；待其呼吸变慢后，将其转移至操作台，并将鼻部置于鼻罩内。使用脚趾夹捏法确认小鼠已完全麻醉。在整个操作过程中持续监测小鼠呼吸，并根据需要调整异氟烷浓度。将该雌鼠原本所在的、带有整窝幼崽的鼠笼小心放置一旁，待操作结束后再将母鼠放回。
- 使用一滴 70% 乙醇使小鼠腹部毛发贴服，以便观察位于下腹部右侧第4对腹股沟乳腺的乳头。
- 调节解剖显微镜以获得乳头的最佳视野。用精细镊子轻轻将乳头从皮肤拉出，但切勿刺破或损伤乳头。操作组织时，镊子切勿用力夹紧，应轻握操作，使乳头所受应力最小化。
- 用左手持镊子轻轻固定乳头位置，右手缓慢将预装注射器移入视野。持注射器时应确保无需重新调整位置即可完成注射。
- 当注射器进入视野后，仔细对准乳头中央的小导管开口，插入针头。
- 保持手部位置不变，注射注射器内全部内容物，随后将针头从乳头中退出。
- 另取一支注射器，吸取 50 μl PBS 用于对照注射。重新调整小鼠在操作台上的位置，以获得小鼠下腹部另一侧左侧第4对腹股沟乳腺乳头的最佳视野。使用装载 PBS 的注射器重复步骤 3.4 至 3.7。
- 完成两次注射后，停止麻醉，将小鼠转移至恢复笼中。监测母鼠，确保其在 5 分钟内恢复活动能力。让小鼠在恢复笼中静置 1 小时。恢复 1 小时后，将母鼠放回其幼崽所在的鼠笼。注射后应定期监测小鼠 6 小时，之后再进行成像操作。根据我们的经验，在注射至成像期间，母鼠及其幼崽均未出现不良反应。然而，若观察到母鼠出现痛苦迹象（e.g. 弓背姿势、咬伤或保护注射部位、普遍性嗜睡）或幼崽出现异常（无活动、皮肤呈青紫色），应立即终止实验。
4. 利用生物发光成像技术可视化 NF-κB 活性
- 将小鼠转运至成像实验室后，打开软件并启动仪器，开始成像操作。打开异氟烷麻醉机和气流，确保麻醉气体同时通入麻醉箱和成像室。
- 将小鼠放入透明的麻醉箱中进行异氟烷麻醉。待其呼吸减慢后，通过脚趾夹捏测试确认小鼠已完全麻醉。随后，使用无菌注射器经眶后静脉注射 100 μl 荧光素酶底物5。
- 立即将小鼠转移至成像室，并将其鼻部置于成像室内的异氟烷鼻罩下，保持仰卧姿势。用胶带将每只脚固定在成像台上。
- 在 IVIS 软件中设置适当的参数，采集白光照片图像以及生物发光图像。曝光时间应设为 10 秒。获取图像。
- 图像采集完成后，让小鼠苏醒，然后将其放回笼中与仔鼠一同饲养，并定期进行观察。
- 照片图像与发光图像将自动叠加并显示在屏幕上，如图2所示。通过在小鼠下腹部两侧（一侧为 PBS 注射的乳腺组织，另一侧为 LPS 注射的乳腺组织）放置大小相同的感兴趣区域（“ROI”）圆形区域，对采集的图像进行分析。将读数单位设为光子数。每个 ROI 内检测到的发光值将以数字形式显示（见图2B）。将该数值用于统计分析。
- 为获得最佳图像显示效果，可进一步调整信号显示的阈值。此操作不会改变总发光读数，但可去除背景信号，从而更清晰地显示对照组与 LPS 处理组乳腺组织之间的差异。逐步降低显示的发光强度，直至 PBS 注射侧的乳腺组织无背景信号。此时，LPS 处理侧乳腺组织中增强的信号仍应在图像中清晰可见，如图2所示。
- 可在雌鼠处死后采集乳腺组织，进一步完成包括蛋白质和 RNA 检测在内的其他分析6。
5. 代表性结果
为了从这些方法中获得可解释的结果，必须仅将LPS（或PBS）注入乳腺导管内，而保持周围相邻组织不受干扰。若将液体注射到乳头周围的皮下组织，将因机械损伤引发炎症，而非模拟感染。在学习该技术时，使用PBS稀释的台盼蓝染料进行注射有助于操作掌握。图3A显示了一个成功注射的腺体，其中注入了100 μl PBS配制的台盼蓝溶液。如图所示，只有导管树应被注入的溶液充盈，注射部位不应出现液团。“液团”在此指液体在乳头或乳头周围组织积聚，而未进入导管树内。这种情况如图3B所示。请注意，图3中所示的练习注射是在哺乳第21天的雌性小鼠上完成的。在泌乳高峰期（第8-10天，即本方案中注射LPS的阶段），乳汁丰富，难以观察导管结构，也无法准确判断注射是否成功。因此，在泌乳后期进行练习注射更为合适。
成功将LPS注入乳腺导管后，腺体内NF-κB活性会升高。在IVIS成像中，报告基因小鼠应可清晰观察到这一变化，且LPS注射侧腺体的荧光素酶活性（以光子数计量）应显著高于PBS注射侧腺体，如图2所示（平均而言，LPS处理侧信号为PBS对照侧的200%）。通过对4只小鼠的实验，LPS处理侧腺体的发光强度相较于对侧对照组达到了统计学意义上的显著升高4。另一项研究也采用了向NF-κB报告基因转基因小鼠乳腺导管内注射E. coli或LPS的方法。与我们自身的工作类似，这些作者观察到在注射E. coli后6小时，报告基因活性显著升高2。
请注意，由于脑部和其他腹腔器官中存在组成型NF-κB活性，即使在未进行任何处理的基线状态下，对报告基因小鼠成像时，其头部和腹部始终会显示信号。因此，在本实验中应忽略该信号。在调整图像读数以最小化PBS注射乳腺中的背景发光后，LPS注射的乳腺组织中应仍可见明显的信号。图2展示了背景信号降低后的图像。
注射未成功进入腺体很可能导致乳头损伤。这将引起尖锐的、表皮水平的炎症，影像检查中可明显观察到。此类损伤信号会非常强烈，且局限于发生损伤的乳头区域，不会像成功将LPS注入导管后那样扩散至整个腺体。
图1. 实验流程示意图。
图2. IVIS生物发光成像的代表性结果。 （A）经背景扣除后获得的图像，显示LPS注射腺体中荧光素酶活性增强。（B）图A添加了感兴趣区域定量分析的结果。 点击此处查看大图。
图3. 示踪注射：通过乳管内注射将染料注入乳腺。 为检测经乳头给药的准确性，对一只哺乳第21天的小鼠通过乳头注入100 μl用PBS稀释的台盼蓝染料。处死后暴露乳腺以进行观察。（A）成功注射；（B）染料在乳头处积聚成团。
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讨论
本研究利用一种转基因NF-κB报告小鼠及优化的注射技术，建立乳腺组织炎症（即乳腺炎）模型，该疾病最常见于细菌感染。该实验操作中最关键的步骤是导管内注射本身。
在实际操作中，通常可以明显判断导管内注射是否成功。注入试剂（LPS 或 PBS）时应感觉顺畅，注射器排空过程中应几乎无阻力。最常见的问题是乳头受损，导致试剂无法顺利进入腺体。可通过解剖显微镜观察乳头来识别此类损伤。通过充分练习、操作乳头时保持轻柔，以及确保仅使用最细的针头（31G 或更细）进行操作，可避免此类损伤。此外，若针头位置不正确或在注射过程中发生滑脱，则 LPS 或 PBS 可能在注射部位积聚，导致液体无法扩散至导管内。若发生此情况，可能在乳头周围皮肤下肉眼可见液体积聚，或注射时感觉不顺畅。尽管此类问题无法完全避免，但通过练习并使用合适的工具，可在很大程度上减少其发生。
本实验中所采用的注射技术至关重要。一些已发表的乳腺导管内注射方法需要切除乳头和/或切开皮肤7,8。而在本研究中，由于主要终点是确定乳腺内与NF-κB相关的炎症反应，因此任何...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为CA113734，授予F Yull，以及退伍军人事务部（TS Blackwell）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脂多糖来自 大肠杆菌 （LPS） | Sigma | L 2880 | 血清型055:B5 |
| PBS | 美迪特公司 | 46-013-CM | |
| 31 号针头胰岛素注射器 | Becton Dickinson | 328438 | 短针头 |
| 镊子 | 世界精密仪器公司 | 15908 | |
| 解剖范围 | Leica | M3Z | |
| 特雷尔异氟烷，USP | MINRAD 公司用于 Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 成像系统 | Caliper（原 Xenogen） | N/A | |
| 用于荧光素注射的注射器 | 贝克顿·迪金森 | 309597 | 1毫升；26G5/8 |
| D-荧光素萤火虫钠盐一水合物 （荧光素底物） | Biosynth 化学与生物学 | L-8240 | 稀释至 10 mg/ml |
参考文献
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