本文介绍了一种通过乳头将脂多糖注射到哺乳期小鼠乳腺中以模拟乳腺炎的技术，乳腺炎通常由细菌感染引起。通过NF-κB荧光素酶报告小鼠的生物发光成像可观察到，脂多糖注射导致核因子κB（NF-κB）信号通路增强。
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摘要
摘要
为了严格研究疾病进展的各个阶段及其相关机制，并最终作为临床前模型来测试干预措施，人类疾病的动物模型是必不可少的。在这些方法中，我们描述了一种技术：通过乳头将脂多糖（LPS）注射到哺乳期小鼠的乳腺中，从而有效模拟乳腺炎，即乳腺的炎症。这种模拟感染会导致核因子κB（NF-κB）信号通路的增强，可通过NF-κB荧光素酶报告小鼠的生物发光成像进行观察1。
开发这些方法的最终目标是研究哺乳期乳腺中与乳腺炎相关的炎症反应，这种炎症通常包括红肿和免疫细胞浸润2,3。因此，我们充分认识到，不能在实验方法中采用任何对皮肤、乳头或腺体进行切口或造成损伤的方式来导入LPS，因为此类操作很可能干扰对炎症反应的准确读取。同时，我们希望采用一种简便直接的方法，无需使用手工拉制的移液管或显微操作仪来固定特殊工具。因此，我们决定采用市售的胰岛素注射器，将试剂注入完整乳头的乳腺导管内。该方法取得了成功，使我们能够在排除注射过程本身带来的额外影响的前提下，研究LPS注射所引发的炎症反应。此外，该方法还结合了NF-κB荧光素酶报告基因转基因小鼠及生物发光成像技术，从而以可视化和定量的方式展示LPS注射乳腺中NF-κB信号通路的增强4。
这些方法对希望在哺乳期乳腺中建立疾病模型的多学科研究人员具有重要意义，因为本文所述技术可用于注射多种物质，而不仅限于脂多糖（LPS）。
方案
所有动物实验均经范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 转基因小鼠的制备
- 使用携带 NGL（NF-κB-GFP-L荧光素酶）报告转基因（此前已有描述1）的雌性小鼠进行本实验。当雌鼠至少达到6周龄时，将其与FVB野生型雄鼠交配。可采用后宫式繁殖（每笼最多4只雌鼠与1只雄鼠共同饲养）。（请注意：本研究使用的是FVB品系小鼠。其他毛色较深的品系小鼠如C57Bl6也可使用，但成像前必须剃毛）。
- 从交配后第15天开始，定期检查雌鼠是否出现妊娠迹象（腹部明显膨大）。一旦发现雌鼠怀孕，应立即将其单独饲养，并在最后一只雌鼠确认怀孕后，将雄鼠从繁殖笼中移除。
- 密切观察单独饲养的雌鼠，并记录产仔日期。每窝至少需要6只仔鼠才能保证充分泌乳。在产仔后第8天，开始执行本实验方案（实验时间线示意图见图1）。
2. 注射前准备
- 将大肠杆菌（E. coli）脂多糖（LPS）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成终浓度为 0.1 μg/μl 的溶液。每只乳腺将注射 50 μl 该溶液，即总共 5 μg。另准备一管仅含 PBS 的溶液，用于对照注射。
- ....
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讨论
本研究利用一种转基因NF-κB报告小鼠及优化的注射技术，建立乳腺组织炎症（即乳腺炎）模型，该疾病最常见于细菌感染。该实验操作中最关键的步骤是导管内注射本身。
在实际操作中，通常可以明显判断导管内注射是否成功。注入试剂（LPS 或 PBS）时应感觉顺畅，注射器排空过程中应几乎无阻力。最常见的问题是乳头受损，导致试剂无法顺利进入腺体。可通过解剖显微镜观察乳头来识别此类损伤。通过充分练习、操作乳头时保持轻柔，以及确保仅使用最细的针头（31G 或更细）进行操作，可避免此类损伤。此外，若针头位置不正确或在注射过程中发生滑脱，则 LPS 或 PBS 可能在注射部位积聚，导致液体无法扩散至导管内。若发生此情况，可能在乳头周围皮肤下肉眼可见液体积聚，或注射时感觉不顺畅。尽管此类问题无法完全避免，但通过练习并使用合适的工具，可在很大程度上减少其发生。
本实验中所采用的注射技术至关重要。一些已发表的乳腺导管内注射方法需要切除乳头和/或切开皮肤7,8。而在本研究中，由于主要终点是确定乳腺内与NF-κB相关的炎症反应，因此任何.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助号为CA113734，授予F Yull，以及退伍军人事务部（TS Blackwell）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 脂多糖来自 大肠杆菌 （LPS） | Sigma | L 2880 | 血清型055:B5 |
| PBS | 美迪特公司 | 46-013-CM | |
| 31 号针头胰岛素注射器 | Becton Dickinson | 328438 | 短针头 |
| 镊子 | 世界精密仪器公司 | 15908 | |
| 解剖范围 | Leica | M3Z | |
| 特雷尔异氟烷，USP | MINRAD 公司用于 Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 成像系统 | Caliper（原 Xenogen） | N/A | |
| 用于荧光素注射的注射器 | 贝克顿·迪金森 | 309597 | 1毫升；26G5/8 |
| D-荧光素萤火虫钠盐一水合物 （荧光素底物） | Biosynth 化学与生物学 | L-8240 | 稀释至 10 mg/ml |
参考文献
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E.
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