从小鼠肠道中分离与鉴定树突状细胞和巨噬细胞

摘要

本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。通过多色流式细胞术对肠道树突状细胞和巨噬细胞进行表型鉴定，同时采用磁珠富集联合细胞分选技术，获得高纯度的细胞群体用于功能研究。

摘要

肠道内存在独特的天然免疫细胞和适应性免疫细胞群体，它们在促进对共生菌群和食物抗原耐受的同时，又能随时对侵入性病原体启动炎症反应^1,2。抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，在维持肠道免疫稳态中发挥关键作用，其机制在于能够感知微生物群并作出适当的响应^3-14。高效分离肠道DCs和巨噬细胞是表征这些细胞表型与功能的关键步骤。尽管已有多种有效的肠道免疫细胞（包括DCs和巨噬细胞）分离方法被报道^6,10,15-24，但许多方法依赖较长的消化时间，可能对细胞表面抗原表达、细胞活力和/或得率产生不利影响。本文详细介绍了一种快速分离大量活的肠道DCs和巨噬细胞的方法。通过使用特异性荧光标记的单克隆抗体直接染色分离得到的肠道细胞，进而进行多色流式细胞术分析，以完成对肠道DCs和巨噬细胞的表型鉴定。此外，利用CD11c和CD11b磁珠激活细胞分选技术结合后续的细胞分选，可获得高纯度的DC和巨噬细胞群体，用于功能研究。

方案

1. 肠道上皮细胞的分离与解离

试剂与仪器的准备：

• 将无 Ca²⁺/Mg²⁺ 的 PBS（CMF PBS） warmed 至室温。
• 将含 5% FBS 的无 Ca²⁺/Mg²⁺ HBSS（CMF HBSS/FBS）和 2 mM EDTA warmed 至室温。
• 将轨道摇床预热至 37 °C。

注意： 步骤 1.1 至 1.7 必须尽快完成，以尽量减少细胞死亡并获得最大细胞得率。

1. 将小鼠置于 CO₂ 安乐死舱中处死，并用 70% 乙醇喷洒腹部和胸部。
2. 用剪刀在腹部中央做一个小的横向切口，剥离皮肤以暴露腹膜。
3. 在幽门括约处剪断，分离胃与上段小肠；用镊子轻轻分离肠系膜，并在回盲瓣处再次剪断，使整个小肠与大肠分离；在肛缘处剪断，并再次分离肠系膜，直至大肠完全游离。
4. 用剪刀纵向剪开结肠，并在室温下用无钙镁 PBS（CMF PBS）冲洗肠腔内的粪便内容物和黏液。
5. 用剪刀和镊子在肉眼可见的水平下沿小肠对系膜缘分离并取出派伊尔结，然后纵向剪开小肠。
6. 在室温下用无钙镁 PBS（CMF PBS）冲洗小肠肠腔内的粪便内容物和黏液。
7. 将小肠和大肠分别切成约 1.5 cm 的片段，并分别放入含有 30 ml 预热的含 2 mM EDTA 的无钙镁 HBSS/FBS（CMF HBSS/FBS）的 50 ml 锥形管中。每根 50 ml 锥形管中不得放入超过一段肠道。
8. 将每个 50 ml 锥形管水平放置于摇床上，在 37 °C 下以 250 rpm 振荡 20 分钟。
9. 将单层金属网筛置于废液桶上方，将每个 50 ml 锥形管中的内容物倒入筛中，回收 1.5 cm 的肠段，并将其转移至分别含有 30 ml 预热的含 2 mM EDTA 的 CHBSS/FBS 的 50 ml 锥形管中。
10. 重复步骤 1.8。

2. 组织消化与肠道细胞的分离

试剂与仪器的准备：

• 胶原酶溶液： 将1.5 mg/ml VIII型胶原酶溶解于预热的含40 μg/ml DNase I的CMF HBSS/FBS中。
• 预热的CMF HBSS/FBS和2 mM EDTA。
• 预热至37 °C的轨道摇床。
• 冰冷的CMF HBSS/FBS。

1. 第二次振荡后，将每个50 ml锥形管中的内容物通过滤网过滤，并用纸巾吸去多余培养基，将1.5 cm长的肠段转移至小型塑料称量舟中。
2. 在称量舟中直接用剪刀迅速剪碎1.5 cm的肠段，并将剪碎的肠组织加入20 ml胶原酶溶液中。将每个50 ml锥形管水平放置于摇床上，于37 °C以200 rpm振荡消化10–20分钟。有关优化细节，请参见下文讨论部分。
3. 短暂涡旋以确保残留肠组织充分解离，并通过100 μm细胞滤网直接滤入50 ml锥形管中。
4. 用CMF HBSS/FBS补满每个50 ml锥形管，于4 °C以1500 rpm离心5分钟。若结肠样本离心后未见明显沉淀，应再离心3.5分钟。重复此洗涤步骤一次。
5. 弃去上清液，将细胞沉淀用预冷的CMF HBSS/FBS重悬，并将样本置于冰上。
6. 继续进行第3节的流式细胞术采集/分析，或进入第4节进行磁珠富集以实现高速细胞分选。

3. 树突状细胞和巨噬细胞多色流式细胞术分析的抗体染色

试剂与仪器的准备：

• 预冷的 CMF PBS。
• 预冷的染色缓冲液（CMF PBS + 5% FBS）。
• 使用 LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒，在预冷的 CMF PBS 中按 1:1000 稀释比例配制死细胞染色液。
• 将以下荧光标记的单克隆抗体（mAbs）加入预冷的染色缓冲液中，配制抗体染色混合液：CD45-PerCP、CD103-PE、CD11c-APC、MHC-II（I-A^b）-Alexa Fluor 700、CD11b-eFluor 450、F4/80-PE-Cy7。

1. 将细胞转移至一个5 ml的聚苯乙烯圆底（FACS）管中。
2. 用预冷的无钙镁PBS缓冲液洗涤细胞两次。
3. 在冰上避光孵育死细胞染料15分钟。
4. 用预冷的无钙镁PBS缓冲液再次洗涤细胞两次。
5. 用冰上预冷的染色缓冲液中的2.4G2抗FcγRIII/II抗体封闭细胞，冰上孵育10分钟。
6. 用冰上预冷的染色缓冲液洗涤细胞一次。
7. 在冰上避光条件下，加入抗体染色混合液，孵育20分钟。
8. 用冰上预冷的染色缓冲液洗涤细胞两次，将细胞重悬于400 μl冰上预冷的染色缓冲液中，并通过FACS管上的40 μm滤膜帽过滤。
9. 按照第5节和图1中定义的设门策略，在LSR II流式细胞仪（BD）上获取样本数据。

4. 从肠道中富集树突状细胞和巨噬细胞

试剂与仪器的准备：

• 预冷染色缓冲液（无钙镁 PBS + 5% 胎牛血清）。

1. 按照制造商说明书，将步骤 2.5 获得的单细胞悬液与 CD11b 和 CD11c MACS 磁珠共同孵育。
2. 用预冷的染色缓冲液洗涤细胞，随后进行离心。
3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1 mL 预冷的染色缓冲液中，依次通过 100 μm 和 40 μm 细胞滤网。
4. 使用 MACS LS 磁性分离柱通过正向选择法富集结合磁珠的细胞。
5. 重复步骤 4.2，弃去上清液。
6. 按照步骤 3.7 所述，用表面标志物单克隆抗体孵育细胞。
7. 用预冷的不含叠氮化钠的染色缓冲液洗涤磁珠富集后的细胞两次。将细胞沉淀重悬于 500 μL 预冷的不含叠氮化钠的染色缓冲液中，并通过 40 μm 细胞滤网收集至流式管中。
8. 将细胞转移至 BD ARIA II 细胞分选仪进行 FACS 分选，以分离目标肠道树突状细胞和/或巨噬细胞亚群。

5. 肠道固有层APC的设门策略

注意：请注意，未染色的肠道细胞可作为阴性对照，以帮助正确设置门控，区分阳性与阴性细胞群。

1. 如图1所示，创建点图并排除死细胞染料阳性的细胞（图1A），随后排除双联体事件（图1B和C）。然后根据前向散射和侧向散射对目标细胞设门，注意排除碎片（图1D）。
2. 创建另一个点图，进一步对CD45⁺和I-A^b+细胞设门，这些细胞在表型上表征为抗原呈递细胞（APCs）（图1E）。
3. 在另一个独立的点图中，分析CD11b和CD11c的表达，以区分特定的树突状细胞（DC）和巨噬细胞亚群（R1、R2和R3；图1F）。R1区域的细胞为CD11c⁺ CD11b^dull/-细胞。R2区域的划定依据是这些细胞在CD11c表面表达水平上与R1细胞相似，但R2细胞同时表达CD11b。随后，R3区域定义为CD11b⁺且CD11c^dull/-的细胞。
4. 进一步分析R1、R2和R3区域中F4/80和CD103的表达，以分别区分巨噬细胞和DC群体。R1中CD11c⁺ CD11b^dull/-细胞高表达αE整合素CD103，而F4/80表达水平较低（图1G）。R2中CD11b⁺CD11c⁺细胞根据其对CD103和F4/80的双相表达特征，包含DC和巨噬细胞两种成分（图1H）。最后，R3中CD11b⁺CD11c^dull/-细胞基于F4/80⁺和CD103^-的表型特征，被认定为巨噬细胞（图1I）¹⁶。

6. 代表性结果

图1. 肠道树突状细胞和巨噬细胞的设门策略。 首先在分析中排除死细胞（A）和双联体（B和C），然后根据前向散射和侧向散射对小肠细胞进行设门（D），抗原呈递细胞定义为CD45⁺I-A^b+（E）。通过CD11b和CD11c的表达鉴定巨噬细胞和树突状细胞（F）。对预设门R1（G）、R2（H）和R3（I）群体的细胞分析其CD103和F4/80的表达情况。

图 2. 细胞得率和抗体染色质量依赖于消化时间。 不同消化程度下肠道组织的 CD11b 和 CD11c 染色模式及总细胞得率：消化不足（A，D）、消化适度（B，E）和消化过度（C，F）。

从小鼠C57BL/6的小肠中分离出肠上皮细胞，使用BD LSR II流式细胞仪对树突状细胞（DCs）和巨噬细胞进行FACS分析。通过未染色及单荧光染色的脾细胞设定电压和补偿参数。首先在分析中排除死细胞（图1A）和双联体细胞（图1B和C）。随后根据前向散射光和侧向散射光对目标细胞进行分析（图1D），接着圈选CD45⁺和I-A^b+细胞（图1E）。之后，在CD45⁺I-A^b+细胞中评估CD11b和CD11c的表达，以界定三个区域（R1、R2和R3；图1F）。通过分析这三个区域中CD103和F4/80的表达情况，分别区分树突状细胞与巨噬细胞。R1区域的CD11c⁺ CD11b^微弱/-细胞高表达αE整合素CD103，而F4/80表达水平较低（图1G）。R2区域的CD11b⁺CD11c⁺细胞根据其对CD103和F4/80的双相表达特征，包含树突状细胞和巨噬细胞两类（图1H）；而R3区域的CD11b⁺CD11c^微弱/-细胞则基于F4/80⁺和CD103^-的表型特征被认定为巨噬细胞（图1I）¹⁶。R2门控内的巨噬细胞与R3门控中的巨噬细胞具有相似的前向和侧向散射特性，可通过CD11c的表达水平加以区分。这些细胞亚群的功能差异目前尚未完全阐明。

组织消化时间对总细胞得率以及CD11b和CD11c表达水平的影响如图2所示。消化3分钟（消化不足）的肠道组织获得的总细胞数量较低（图2D），因此可用于表征的树突状细胞（DCs）和巨噬细胞数量较少（图2A）。消化11分钟时，活细胞得率显著提高（图2E），且DCs和巨噬细胞群体中CD11b和CD11c的表达水平较高，表型特征清晰可辨（图2C）。相比之下，消化50分钟（过度消化）时，细胞得率与优化消化条件相比相似（图2E和F），但随着CD11c表达减弱（图2C）以及死细胞数量增加（数据未显示），利用CD11b和CD11c区分不同细胞群体的界限变得模糊。

讨论

图 3. 影响细胞得率和表面抗原表达优化的关键因素。 细胞得率和表面抗原表达直接受组织消化时间、胶原酶的特异性特征、组织剪切程度以及是否存在炎症的影响，后者可能影响组织完整性和细胞含量。组织消化时间过长可能导致细胞活力和表面抗原表达下降，而消化不足则可能导致可用于分析的细胞数量不足。

本文详细描述了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法，可用于多色流式细胞术进行表型鉴定，也可通过磁珠分选（MACS）和细胞分选技术富集细胞，从而对纯化后的细胞开展功能研究。优化胶原酶浓度及组织消化时间对于在不损害细胞活力和表面抗原表达的前提下获得较高的细胞得率至关重要。消化不足会导致总细胞数偏低，可用于鉴定的树突状细胞和巨噬细胞数量稀少（图2A和D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1× PBS，不含 Ca2+ 和 Mg2+
含酚红的 Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	费舍尔科技公司	SH3001603
碳酸氢钠	西格玛-奥德里奇公司	S6014
0.85% NaCl 中的 1 M HEPES	龙沙公司	17-737E
胎牛血清 (FBS)	亚特兰大生物公司	S11150H	热灭活
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Cellgro	46-034-CI
VIII 型胶原酶	西格玛-奥德里奇公司	C2139
DNase I	罗氏集团	14785000	储存液：100 mg/mL
适用于 405 nm 激发的 LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒	英坦科技	L34957	使用比例：1:1000
CD45-PerCP 单克隆抗体 (30F11)	BD 生物科学公司	557235	使用比例：1:100
CD103-PE 单克隆抗体 (M290)	BD 生物科学公司	557495	使用比例：1:100
FcγRIII/II 单克隆抗体 (2.4G2)	BD 生物科学公司	553141	使用比例：1:200
CD11c-APC 单克隆抗体 (N418)	eBioscience 公司	17-0114-82	使用比例：1:100
MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 单克隆抗体	eBioscience 公司	56-5321-82	使用比例：1:100
CD11b-eFluor 450 单克隆抗体 (M1/70)	eBioscience 公司	48-0112-82	使用比例：1:200
F4/80-PE-Cy7 单克隆抗体 (BM8)	eBioscience 公司	25-4801-82
CD11b 磁珠	美天旎生物技术公司	130-049-601
CD11c 磁珠	美天旎生物技术公司	130-052-001
50 mL 锥形管	BD 生物科学公司	352098
单层金属网筛	Chefmate
小型称量舟	费舍尔科技公司	08-732-116
100 μm 细胞滤网	BD 生物科学公司	352360
40 μm 细胞滤网	BD 生物科学公司	352340
5 mL 聚苯乙烯圆底试管	BD 生物科学公司	352235	使用比例：1:100
MaxQ 4450 台式轨道摇床	赛默飞世尔科技公司
LS MACS 柱	美天旎生物技术公司	130-042-401
LSR II	BD 生物科学公司
FACSAria II	BD 生物科学公司