本文详细介绍了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法。通过多色流式细胞术对肠道树突状细胞和巨噬细胞进行表型鉴定，同时采用磁珠富集联合细胞分选技术，获得高纯度的细胞群体用于功能研究。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肠道内存在独特的天然免疫细胞和适应性免疫细胞群体，它们在促进对共生菌群和食物抗原耐受的同时，又能随时对侵入性病原体启动炎症反应1,2。抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，在维持肠道免疫稳态中发挥关键作用，其机制在于能够感知微生物群并作出适当的响应3-14。高效分离肠道DCs和巨噬细胞是表征这些细胞表型与功能的关键步骤。尽管已有多种有效的肠道免疫细胞（包括DCs和巨噬细胞）分离方法被报道6,10,15-24，但许多方法依赖较长的消化时间，可能对细胞表面抗原表达、细胞活力和/或得率产生不利影响。本文详细介绍了一种快速分离大量活的肠道DCs和巨噬细胞的方法。通过使用特异性荧光标记的单克隆抗体直接染色分离得到的肠道细胞，进而进行多色流式细胞术分析，以完成对肠道DCs和巨噬细胞的表型鉴定。此外，利用CD11c和CD11b磁珠激活细胞分选技术结合后续的细胞分选，可获得高纯度的DC和巨噬细胞群体，用于功能研究。
方案
1. 肠道上皮细胞的分离与解离
试剂与仪器的准备：
- 将无 Ca2+/Mg2+ 的 PBS（CMF PBS） warmed 至室温。
- 将含 5% FBS 的无 Ca2+/Mg2+ HBSS（CMF HBSS/FBS）和 2 mM EDTA warmed 至室温。
- 将轨道摇床预热至 37 °C。
注意： 步骤 1.1 至 1.7 必须尽快完成，以尽量减少细胞死亡并获得最大细胞得率。
- 将小鼠置于 CO2 安乐死舱中处死，并用 70% 乙醇喷洒腹部和胸部。
- 用剪刀在腹部中央做一个小的横向切口，剥离皮肤以暴露腹膜。
- 在幽门括约处剪断，分离胃与上段小肠；用镊子轻轻分离肠系膜，并在回盲瓣处再次剪断，使整个小肠与大肠分离；在肛缘处剪断，并再次分离肠系膜，直至大肠完全游离。
- 用剪刀纵向剪开结肠，并在室温下用无钙镁 PBS（CMF PBS）冲洗肠腔内的粪便内容物和黏液。
- 用剪刀和镊子在肉眼可见的水平下沿小肠对系膜缘分离并取出派伊尔结，然后纵向剪开小肠。
- 在室温下用无钙镁 PBS（CMF PBS）....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
图 3. 影响细胞得率和表面抗原表达优化的关键因素。 细胞得率和表面抗原表达直接受组织消化时间、胶原酶的特异性特征、组织剪切程度以及是否存在炎症的影响，后者可能影响组织完整性和细胞含量。组织消化时间过长可能导致细胞活力和表面抗原表达下降，而消化不足则可能导致可用于分析的细胞数量不足。
本文详细描述了一种快速分离小鼠肠道树突状细胞（DCs）和巨噬细胞的方法，可用于多色流式细胞术进行表型鉴定，也可通过磁珠分选（MACS）和细胞分选技术富集细胞，从而对纯化后的细胞开展功能研究。优化胶原酶浓度及组织消化时间对于在不损害细胞活力和表面抗原表达的前提下获得较高的细胞得率至关重要。消化不足会导致总细胞数偏低，可用于鉴定的树突状细胞和巨噬细胞数量稀少（图2A和D
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
感谢亚伦·雷（埃默里大学儿科系和亚特兰大儿童保健中心流式细胞分选核心实验室）提供的细胞分选技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AA01787001、克罗恩病与结肠炎基金会职业发展奖以及埃默里-埃格尔斯顿儿童研究中心种子基金（资助号：T.L.D.）资助支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1× PBS，不含 Ca2+ 和 Mg2+ | |||
| 含酚红的 Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) | 费舍尔科技公司 | SH3001603 | |
| 碳酸氢钠 | 西格玛-奥德里奇公司 | S6014 | |
| 0.85% NaCl 中的 1 M HEPES | 龙沙公司 | 17-737E | |
| 胎牛血清 (FBS) | 亚特兰大生物公司 | S11150H | 热灭活 |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Cellgro | 46-034-CI | |
| VIII 型胶原酶 | 西格玛-奥德里奇公司 | C2139 | |
| DNase I | 罗氏集团 | 14785000 | 储存液：100 mg/mL |
| 适用于 405 nm 激发的 LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒 | 英坦科技 | L34957 | 使用比例：1:1000 |
| CD45-PerCP 单克隆抗体 (30F11) | BD 生物科学公司 | 557235 | 使用比例：1:100 |
| CD103-PE 单克隆抗体 (M290) | BD 生物科学公司 | 557495 | 使用比例：1:100 |
| FcγRIII/II 单克隆抗体 (2.4G2) | BD 生物科学公司 | 553141 | 使用比例：1:200 |
| CD11c-APC 单克隆抗体 (N418) | eBioscience 公司 | 17-0114-82 | 使用比例：1:100 |
| MHC-II (I-Ab)-Alexa Fluor 700 单克隆抗体 | eBioscience 公司 | 56-5321-82 | 使用比例：1:100 |
| CD11b-eFluor 450 单克隆抗体 (M1/70) | eBioscience 公司 | 48-0112-82 | 使用比例：1:200 |
| F4/80-PE-Cy7 单克隆抗体 (BM8) | eBioscience 公司 | 25-4801-82 | |
| CD11b 磁珠 | 美天旎生物技术公司 | 130-049-601 | |
| CD11c 磁珠 | 美天旎生物技术公司 | 130-052-001 | |
| 50 mL 锥形管 | BD 生物科学公司 | 352098 | |
| 单层金属网筛 | Chefmate | ||
| 小型称量舟 | 费舍尔科技公司 | 08-732-116 | |
| 100 μm 细胞滤网 | BD 生物科学公司 | 352360 | |
| 40 μm 细胞滤网 | BD 生物科学公司 | 352340 | |
| 5 mL 聚苯乙烯圆底试管 | BD 生物科学公司 | 352235 | 使用比例：1:100 |
| MaxQ 4450 台式轨道摇床 | 赛默飞世尔科技公司 | ||
| LS MACS 柱 | 美天旎生物技术公司 | 130-042-401 | |
| LSR II | BD 生物科学公司 | ||
| FACSAria II | BD 生物科学公司 |
参考文献
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Nagler-Anderson, C., Terhoust, C., Bhan, A. K., Podolsky, D. K. Mucosal antigen presentation and the control of tolerance and immunity. Trends Immu....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
