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一种针对THP1人急性单核细胞白血病细胞系内Leishmania donovani无鞭毛体的抗利什曼原虫药物筛选的寄生虫拯救与转化实验

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DOI：

10.3791/4054

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2012年12月30日

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1National Center for Natural Products Research, School of Pharmacy, University of Mississippi, 2Department of Pharmacology, University of Mississippi

本文内容

摘要

感染THP1细胞的寄生虫拯救与转化实验 体外 与 Leishmania donovani 已针对抗利什曼原虫药物筛选优化了该检测方法。该实验包括THP1细胞的分化、用前鞭毛体感染、待测药物处理、受感染巨噬细胞的可控裂解、无鞭毛体的回收、向鞭毛体的转化，以及通过荧光测定法监测鞭毛体的生长与增殖。

摘要

利什曼病是全球最被忽视的疾病之一，主要影响发展中国家最贫困的人群。全球约有3.5亿人面临感染利什曼病的风险，每年约出现200万例新病例1。杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）是内脏利什曼病（VL）的致病因子，而内脏利什曼病是该疾病最致命的形式。目前可用于治疗利什曼病的药物选择有限2；现有疗法疗效有限，且许多药物在治疗剂量下具有毒性。此外，由于多重耐药性日益增加，大多数一线治疗药物已失去效用3。当前抗利什曼病药物的研发管线也严重枯竭。迫切需要持续努力以充实新的抗利什曼病药物发现管线，而这一工作依赖于合适的体外筛选模型的可及性。

体外前鞭毛体4和无细胞培养的无鞭毛体检测方法5主要用于抗利什曼原虫药物筛选，但由于与细胞内无鞭毛体在细胞、生理、生化及分子水平上存在显著差异，其适用性可能受限。使用巨噬细胞-无鞭毛体模型的检测方法被认为最接近利什曼病的病理生理条件，因此是体外药物筛选最适宜的方法。经诱导分化的非增殖性人急性单核细胞白血病细胞（THP1）是分离原代巨噬细胞的一种理想替代方案，可用于检测不同化合物对细胞内无鞭毛体的抗利什曼活性。

此处，我们介绍一种利用已分化的 THP1 细胞感染进行的寄生虫拯救与转化实验 体外 与 利什曼原虫（Leishmania donovani） 用于筛选纯化合物和天然产物提取物，并测定其对细胞内病原体的抑制效果 利什曼原虫 无鞭毛体。该实验包括以下步骤：（1）将THP1细胞分化为非增殖性巨噬细胞，（2）用无鞭毛体感染巨噬细胞， L. donovani 无鞭毛体，（3）用测试药物处理感染细胞，（4）受感染巨噬细胞的可控裂解，（5）无鞭毛体的释放/回收，以及（6）活无鞭毛体向前鞭毛体的转化。该检测方法通过使用去污剂处理实现巨噬细胞的可控裂解，从而完成优化 利什曼原虫感染的 THP1 细胞，以几乎完全恢复可存活的细胞内无鞭毛体，同时对其转化为前鞭毛体的能力影响最小。通过测试不同的巨噬细胞：前鞭毛体比例以实现最大程度的感染。感染程度的定量通过活体、被成功挽救的无鞭毛体的转化来进行 利什曼原虫 无鞭毛体向前鞭毛体转化，并通过96孔微孔板中的AlamarBlue荧光测定法评估其生长情况。该检测方法与目前常用的显微镜检查、转基因报告基因和数字图像分析检测方法相当。该检测方法具有良好的稳健性，仅测量活的胞内无鞭毛体，而报告基因和图像分析检测可能无法区分活与死的无鞭毛体。此外，该方法已使用现有的一组抗利什曼药物进行了验证，并已成功应用于纯化合物的大规模筛选以及天然产物组分文库的筛选（Tekwani 等 未发表

方案

1. THP1 细胞培养的维持与传代

  1. 在37 °C、5% CO2培养箱中，使用RPMI-1640培养基（含10% FBS，pH 7.4）培养THP1细胞。
  2. 每周传代两次，防止细胞密度超过1×106个细胞/mL。这对于维持其转化能力至关重要。

2. 维持和传代培养Leishmania donovani前鞭毛体

  1. 在26 °C条件下，将L. donovani前鞭毛体（S1，苏丹株）培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基（不含碳酸氢钠和丙酮酸钠）中。
  2. 每周传代培养L. donovani前鞭毛体两次，细胞浓度最高应维持在20–25×106 个前鞭毛体/mL。注意：所有培养基和溶液使用前应恢复至室温。

3. 在96孔微孔板和16孔玻璃培养板中接种并诱导THP1细胞分化。

  1. 从培养四天的细胞培养物（细胞密度不应超过 106 个细胞/ml）中制备细胞密度为 2.5×105 个细胞/ml 的稀释型 THP1 细胞悬液，使用含 10% 灭活胎牛血清的 RPMI-1640 培养基。每块 96 孔板准备 20 ml 培养液，每张 16 孔腔室载玻片准备 4 ml 培养液。
  2. 向稀释后的细胞悬液中加入佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）（用于 THP1 细胞的分化），每 20 ml 培养液加入 10 μl（PMA 储存液浓度为 50 μg/ml，溶于 DMSO）（稀释后细胞培养液中 PMA 的终浓度应为 25 ng/ml）。
  3. 为比较数字图像分析直接计数法与寄生虫回收转化实验，需在同一时间于透明平底 96 孔板和 16 孔玻璃显微培养腔室载玻片上同时开展两种实验。
  4. 向每个孔或腔室中加入 200 μl 经 PMA 处理的 THP1 细胞悬液。
  5. 将 96 孔板和 16 孔腔室载玻片置于 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养，以实现细胞几乎完全的分化。

注意：通常在悬浮状态下生长的 THP1 细胞被分化为贴壁巨噬细胞。

4. 转染THP1细胞的感染 利什曼原虫杜氏利什曼原虫 前鞭毛体

  1. 使用Leishmania donovani前鞭毛体感染分化的THP1细胞时，大多数寄生虫应处于具有感染性的前循环阶段（长圆柱形，约培养5-6天）。
  2. 在数字图像分析直接计数法和前鞭毛体拯救转化法中，THP1细胞与寄生虫以1:10的比例进行感染最为理想。
  3. 从培养5至6天的L. donovani前鞭毛体中，用含2% FBS的RPMI-1640培养基制备稀释后的寄生虫悬液，调整浓度至2.5×106个寄生虫/ml（THP1细胞:寄生虫 = 1:10）。
  4. 从步骤3.5（THP1细胞培养过夜分化后）取出培养板和腔室载玻片，移除培养基，并用无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞培养物一次。
  5. 用无血清、预热的RPMI-1640培养基（约37 °C）小心洗涤经PMA处理的THP1细胞后，弃去无血清培养基，每孔加入200 μl步骤4.3中制备的L. donovani前鞭毛体稀释液（2.5×106个寄生虫/ml）。在每块培养板和16孔腔室载玻片中设置不含寄生虫的THP1细胞对照孔以及不含THP1细胞的寄生虫对照孔。
  6. 将寄生虫加入THP1细胞培养物后，将培养板和载玻片置于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，使寄生虫感染已分化的THP1细胞。

5. 使用测试药物/化合物处理感染的巨噬细胞

  1. 选用两性霉素B、喷他脒和米替福司作为标准抗利什曼原虫药物进行筛选。根据试剂表中的说明，将药物或待测化合物的储备液溶于水或DMSO中。每种药物或化合物需测试6个不同浓度。
  2. 在新的96孔板或2 ml试管（用于腔室载玻片）中，用含2% FBS的RPMI-1640培养基将标准药物和待测化合物进行1:5倍比稀释。该板中药物或待测化合物的浓度为最终浓度的2倍。
  3. 用无血清RPMI-1640培养基将感染了L. donovani前鞭毛体（来自步骤4.5）的培养板和腔室载玻片至少洗涤5次。向每个孔或腔室中加入100 μl培养基（含2% FBS的RPMI-1640）。多次洗涤是确保彻底去除未被吞噬的前鞭毛体所必需的。
  4. 向每个孔或腔室中加入100 μl经倍比稀释的标准抗利什曼原虫药物或待测化合物溶液。同时在每块板或腔室载玻片中设置不加药物的感染THP1细胞对照组。
  5. 将培养板和腔室载玻片置于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。

6. 腔室载玻片染色、荧光显微镜成像及图像分析用于感染程度与药物处理效应的定量

  1. 孵育 48 小时后，用无血清 RPMI-1640 培养基洗涤腔室载玻片 3 次。将塑料腔室从载玻片上剥离，将载玻片浸入甲醇中 30 秒以固定细胞。将载玻片置于生物安全柜的气流下晾干。
  2. 通过将原液（10,000X）用水稀释 1:2,000 的比例，配制 SYBR Green I 染色液（5X）。
  3. 在避光条件下，用稀释后的 SYBR Green I 染色液室温染色 15 分钟，随后用清水洗涤一次，并将载玻片置于气流下晾干。
  4. 借助封片剂将整片玻璃盖玻片覆盖在染色后的载玻片上。
  5. 使用尼康 Eclipse 90i 荧光显微镜及配套的 NIS element AR 3.2 软件，采集 THP1 细胞的数字图像：包括未感染组（空白）、感染组（对照）以及用不同标准药物或待测化合物在不同稀释度下处理的感染细胞（图 3、5 和 6）。
  6. 使用 ImageJ（图 7）计数巨噬细胞核（较大）和寄生虫核（较小且带有动基体），ImageJ 是由美国国立卫生研究院开发的一种公开可用的基于 Java 的图像处理程序（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）。数据以每 100 个转化的 THP1 细胞中的无鞭毛体数量表示。

7. 寄生虫拯救转化实验：受L. donovani无鞭毛体感染的巨噬细胞的可控裂解

  1. 用无血清 RPMI-1640 培养基洗涤第 5.5 步中的 96 孔微孔板三次。
  2. 在不同浓度下测试的多种去污剂中，0.05% SDS 处理 30 秒是实现可控裂解的最佳条件（在最大限度裂解细胞的同时，使挽救的寄生虫活力损失最小）。
  3. 最后一次洗涤后，吸去每孔中的无血清培养基，向每孔加入 20 μl RPMI-1640（含 0.05% SDS），振荡 30 秒，然后向每孔加入 180 μl 完全 RPMI-1640 培养基（含 10% FBS）。
  4. 将微孔板在 26 °C 下孵育 48 小时，使挽救的无鞭毛体转化为前鞭毛体。

8. 转化前鞭毛体的定量分析（alamarBlue 检测）

  1. 在 26 °C 下孵育 48 小时后，所有复苏的活无鞭毛体均转化为前鞭毛体（图 1D）。向 96 孔板的每孔中加入 10 μl 的 alamarBlue 溶液。
  2. 将培养板在 26 °C 下孵育过夜。
  3. 过夜孵育后，使用 Fluostar Galaxy 荧光仪（BMG Lab Technologies）在激发波长 544 nm、发射波长 590 nm 条件下检测标准荧光值。
  4. 使用 ExcelFit 软件绘制剂量-反应曲线（生长百分比相对于药物或待测化合物浓度）（图 7-9），并根据这些曲线计算 IC50/IC90 值（表 1）。

9. THP1 细胞与寄生虫比例的标准化

  1. 标准化THP1细胞与寄生虫的比例，以确定检测的敏感性。注意：寄生虫数量过低或过高/感染程度不当可能影响筛选的敏感性和选择性。
  2. 按照上述THP1细胞接种和Leishmania前鞭毛体感染（第3和第4节）的方案进行操作，但采用不同的THP1细胞与寄生虫比例，分别为1:1.25、1:2.5、1:5和1:10，以标准化细胞与寄生虫的比例。
  3. 同时在16孔载玻片（用于图像分析）和96孔板（用于寄生虫回收检测）中设置实验，以比较寄生虫回收检测与图像分析检测的结果。

10. 不同去垢剂用于可控细胞裂解的标准化

  1. 本实验的主要目的是优化 THP1 细胞的可控裂解方案，以实现 THP1 细胞最大程度/完全裂解，同时不显著影响 rescued amastigote 寄生虫的活力。
  2. 在不同浓度和不同处理时间下测试多种去垢剂，如 Tween 20、Tween 80、Triton X-100、NP-40 和 SDS（图 2）。
  3. THP1 细胞与寄生虫的比例为 1:10，其他条件与上述第 1–8 节相同。
  4. 进一步测试 0.05% SDS 在不同处理时间下的效果，以进一步优化可控细胞裂解条件。

结果

在药物处理后24、48、72和96小时，对数字图像分析直接计数法和寄生虫复苏转化法进行了定量分析

在直接计数法中，利什曼原虫（L. donovani）感染的巨噬细胞（THP1 细胞）的感染率通过以下公式计算：

用于细胞计数分析的无鞭毛体定量公式；THP1细胞中细胞核的比例。

无鞭毛体（通过计数无鞭毛体核）/100 个转化的 THP1 细胞（通过计数 THP1 细胞核确定）（图 7）是一种比感染 THP1 细胞百分比更准确的指标，用于分析不同标准或测试化合物的作用，如一些先前报道的文献所述，因为该数值直接反映了化合物的总体效应，无论是通过减少巨噬细胞内的寄生虫数量，还是彻底清除巨噬细胞中的寄生虫。感染率是通过分析在不同稀释度下用不同标准药物处理不同时间间隔后的感染 THP1 细胞的数字图像计算得出（图 10 和 表 1）。数字图像分析直接计数法的读数为每 100 个转化 THP1 细胞中的无鞭毛体感染数，而寄生虫拯救转化法的读数为相对荧光单位（RFU），其与从感染巨噬细胞中拯救出并转化为前鞭毛体的活 Leishmania 无鞭毛体数量成正比。alamarBlue 法常规用于 Leishmania 前鞭毛体的抗利什曼药物筛选。

该检测方法最初针对Leishmania感染的THP1细胞的可控裂解进行了标准化和优化。目的是优化去垢剂处理条件，以实现THP1细胞几乎完全裂解，同时对回收的无鞭毛体活力影响最小。图1展示了整个检测流程的显微镜图像。图1A显示了感染Leishmania无鞭毛体的完整THP1细胞。图1B显示去垢剂处理后THP1细胞发生裂解。图1C显示回收的Leishmania无鞭毛体，部分已转化为前鞭毛体；图1D显示无鞭毛体几乎完全转化为前鞭毛体，并出现后续增殖。通过加入alamarBlue并在酶标仪上测定荧光，可对这些转化后的前鞭毛体的生长情况进行定量监测。NP-40处理（图2A）和Triton X-100处理（图2B）均可裂解感染的THP1细胞，但同时也影响了回收无鞭毛体的活力和转化能力。Tween 20（图2C）和Tween 80（图2D）处理未能有效裂解THP1细胞，导致无鞭毛体回收不完全，表现为转化的前鞭毛体数量较低。使用0.05% SDS处理30秒（图2E）可实现Leishmania感染THP1细胞的几乎完全裂解，且不影响回收无鞭毛体的活力和转化能力。进一步优化表明，用0.05% SDS处理20–30秒可获得最高数量的活性Leishmania无鞭毛体（图2F）。在后续实验中，采用0.05% SDS处理30秒的条件。该SDS处理程序适用于单个或多个培养板。对于多个培养板，使用多通道移液器逐列进行SDS处理。从培养板一列的全部8个孔中移除无血清培养基，向同一列的8个孔中各加入20 μl 0.05% SDS，30秒后用含10% FBS的RPMI-1640培养基稀释。在检测方法的初始标准化过程中，需在显微镜下检查是否存在未被内化的前鞭毛体。在第5步对感染巨噬细胞施加标准化合物前，至少需要洗涤五次以去除寄生虫；在第7步SDS处理前，至少需要洗涤三次。因此，在对感染THP1细胞进行对照裂解前，细胞共被洗涤8次，且未见任何明显的未内化前鞭毛体。

数字图像分析与直接计数

使用SYBR Green I染色后，在Nikon Eclipse 90i荧光显微镜下拍摄了感染Leishmania的THP1细胞的数字图像。在荧光滤光片下可同时观察到巨噬细胞核以及含有特征性动基体DNA的胞内Leishmania核（图3）。此外，还通过微分干涉差（DIC）显微镜拍摄了感染THP1细胞的图像。当将两张图像合并时，含有胞内无鞭毛体的THP1细胞轮廓更加清晰可见（图4）。使用ImageJ软件对这些图像进行分析。ImageJ是由美国国立卫生研究院开发的一款基于Java的开源图像处理程序（http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html）。ImageJ采用开放式架构设计，可通过Java插件和可记录宏实现功能扩展。用户可利用ImageJ内置编辑器和Java编译器开发自定义的图像采集、分析和处理插件。为利用ImageJ对THP1细胞核与寄生虫核进行分类计数，首先在ImageJ中打开图像，在软件插件的“Analyze”选项中找到“Cell counter”功能。初始化图像后，选择细胞计数器类型1用于THP1细胞核，类型2用于寄生虫核（图3）。对至少200个THP1细胞核及其所含的胞内无鞭毛体进行分类计数。通过比较寄生虫拯救实验与图像分析方法，评估了不同巨噬细胞：前鞭毛体比例下THP1细胞的感染效率（图4）。图5展示了在不同巨噬细胞：前鞭毛体比例下THP1细胞感染性的差异。两种方法结果具有可比性，其中1:10的巨噬细胞：前鞭毛体比例可获得最佳且可重复的感染效率。

在优化了寄生虫拯救/转化实验的条件以及数字图像分析方法后，评估了这些实验在抗利什曼原虫药物筛选中的应用价值。 利什曼原虫感染的THP1细胞用不同浓度的标准抗利什曼药物（即两性霉素B、戊烷脒和米替福司）处理，处理时间间隔为24至96小时。寄生虫复苏/转化实验重复三次，直接细胞计数实验重复两次。 图6 显示对照未感染、对照感染未治疗的显微图像 利什曼原虫-感染并经药物处理的THP1细胞。剂量反应曲线基于寄生虫拯救与转化实验（药物浓度 vs. 转化后的寄生虫）和图像分析实验（每100个THP1细胞中的无鞭毛体数量）绘制（图7-9）。IC50 药物的剂量反应曲线通过 ExcelFit 计算，并呈现于 表1数字图像分析直接计数法与寄生虫复苏转化法结果显示具有可比性。在药物处理后的早期时间点（24和48小时），数字图像分析直接计数法的结果较不理想，而寄生虫复苏转化法在药物处理后24至96小时各时间点的结果均与文献报道值更为一致。上述两种方法结果的差异可能源于药物处理早期阶段，数字图像分析直接计数法中仍存在非活性无鞭毛体。

细胞过程阶段；显微镜图像 A-D：裂解前、裂解后、转化、增殖。
图 1. 杜氏利什曼原虫无鞭毛体从宿主细胞中释放并转化为前鞭毛体的显微观察。A - 被利什曼原虫无鞭毛体感染的贴壁THP1细胞；B - 受感染的贴壁THP1细胞经可控裂解后；C - 从感染的THP1巨噬细胞中回收的无鞭毛体转化为杜氏利什曼原虫前鞭毛体；D - 转化后的杜氏利什曼原虫前鞭毛体的生长与增殖。

不同去垢剂处理对RFU的影响；NP40、Triton X100、Tween 80、SDS在THP1细胞上的柱状图。
图 2. 优化感染的THP1细胞的可控裂解，以最大程度地回收活的Leishmania donovani无鞭毛体并促使其转化为前鞭毛体。 使用不同去垢剂裂解THP1细胞并从Leishmania-感染的THP1细胞中回收无鞭毛体的分析。测试了两种浓度（0.05% 和 0.1%）的去垢剂以及两种处理时间（30 秒和 60 秒）。RFU = 相对荧光单位。每根柱代表两个重复观察值的平均值。[A] NP-40处理导致THP1细胞裂解，同时也影响了回收的无鞭毛体寄生虫的活力。[B] Triton X-100处理导致THP1细胞裂解，同时也影响了回收的无鞭毛体寄生虫的活力。[C] Tween 80引起THP1细胞的部分裂解，从而回收无鞭毛体。[D] Tween 80引起THP1细胞的部分裂解，从而回收无鞭毛体。[E] SDS处理在0.05%/30秒条件下几乎完全裂解THP1细胞，且未影响回收的无鞭毛体的活力。[F] 使用0.05% SDS处理20-30秒可几乎完全裂解THP1细胞，并成功回收具有活力的无鞭毛体寄生虫，使其转化为前鞭毛体。 点击此处查看高清大图.

Fluorescence microscopy of kDNA and pN distribution in cells; highlights nuclear components.
图3. 分化的THP1细胞感染后的荧光数字图像 体外 与 Leishmania donovani 无鞭毛体。其特征 kDNA 每个寄生虫细胞核中也可观察到。巨噬细胞细胞核 (mN) (1) 和寄生虫的细胞核 (pN) (2) 可通过 ImageJ 分析软件进行差异标记和差异计数，以对感染情况进行定量评估。定量结果以每 100 个 THP1 细胞中的无鞭毛体数量表示。

显示巨噬细胞与前鞭毛体比例对RFU值及每100个巨噬细胞内无鞭毛体数量影响的柱状图。
图4. 数字图像分析直接计数法（下图）与寄生虫拯救转化法（上图）的比较。巨噬细胞与前鞭毛体比例为1:10时，感染效果最佳。两种方法结果具有可比性，但寄生虫拯救法存在一定背景值。每根柱代表两个重复值的平均值。

THP1细胞感染实验图A-E，荧光显微镜结果，显示寄生虫与细胞的比例。
图5. 不同THP1:前鞭毛体比例感染THP1细胞的结果。利什曼原虫前鞭毛体感染THP1细胞后，每100个THP1细胞中无鞭毛体数量的定量结果见图4。

THP1 cell viability assay, drug effects over time, fluorescent microscopy images, 24-96hrs comparison.
图6. 感染THP1细胞的数字图像（荧光 + 差示干涉相衬） 利什曼原虫 donovani 不同时间使用标准抗利什曼药物处理后的无鞭毛体。 结果以每100个THP1细胞中的无鞭毛体数量表示，并用于计算与未处理对照组相比的生长百分比，以确定IC50 值。

两性霉素B浓度与生长抑制率检测图；剂量-反应曲线及IC50计算。
图7. 数字图像分析直接计数法与寄生虫复苏转化法在抗利什曼原虫药物筛选中的比较（两性霉素B）。感染的巨噬细胞用不同浓度的标准抗利什曼原虫药物处理不同时间。IC50（μg/ml）值通过Excelfit软件根据剂量-反应曲线计算得出。 点击此处查看高清大图。

喷他脒剂量-反应曲线；图像计数/寄生虫拯救实验；生长率百分比 vs. 浓度
图 8. 数字图像分析直接计数法与寄生虫拯救转化法在抗利什曼原虫药物筛选中的比较（喷他脒）。感染的巨噬细胞用不同浓度的标准抗利什曼药物处理不同时间。IC50（μg/ml）值通过Excelfit软件拟合剂量-反应曲线计算得出。 点击此处查看高清大图。

米尔特福司治疗效果图表；浓度与生长百分比关系；寄生虫拯救实验；科学数据。
图9. 数字图像分析直接计数法与寄生虫拯救转化法在抗利什曼药物筛选中的比较（米尔特福司）。感染的巨噬细胞用不同浓度的标准抗利什曼药物处理不同时间。IC50（μg/ml）值通过Excelfit软件拟合剂量-反应曲线计算得出。 点击此处查看高清大图。

测试药物24 小时a48 小时a72 小时a96 小时a
IACAbPRTAcIACAbPRTAcIACAbPRTAcIACAbPRTAc
两性霉素 B0.24± 0.030.17± 0.01*0.12± 0.040.20± 0.070.06± 0.010.06± 0.010.11± 0.030.10± 0.03
喷他脒>102.55± 1.16*2.88± 0.581.43± 0.911.24± 0.351.52± 0.160.71± 0.630.98± 0.33
米替福司0.38± 0.020.19± 0.08*0.24± 0.060.30± 0.080.36±0.020.16± 0.060.21± 0.150.17± 0.10

表1. 数字图像分析直接计数法与寄生虫拯救转化法在抗利什曼原虫药物筛选中的比较。感染的巨噬细胞用不同浓度的标准抗利什曼原虫药物处理不同时间。IC50（μg/ml）值通过Excelfit软件从剂量-反应曲线计算得出（图7-9）。a药物处理后小时数；bIACA = 图像分析与直接计数法；cPRTA = 寄生虫拯救与转化法。所列数值为IC50（抑制50%寄生虫生长的药物浓度），单位为μg/ml，至少三次独立实验的均值±标准差。* 与IACA测得的IC50值相比具有统计学差异（<0.05）。

讨论

目前已有多种基于巨噬细胞-无鞭毛体模型的抗利什曼原虫药物筛选方法。这些检测可采用从宿主动物获取的巨噬细胞进行，例如腹腔渗出细胞（PEC）、外周血单核细胞（PBMC）6 或骨髓来源巨噬细胞（BMM），也可使用单核细胞系，如小鼠（J774 和 RAW264.7）7 及人源（THP1、U937、HL-60）8 单核细胞。对于使用可增殖宿主细胞的检测，必须考虑药物对寄生虫和宿主细胞数量双重作用所带来的干扰效应。从小鼠和大鼠等不同来源分离得到的已分化原代巨噬细胞本身不增殖，但这些细胞制备物可能并非均一的细胞群体。而由单核细胞衍生的细胞系具有天然的均一性，是基于巨噬细胞-无鞭毛体药物筛选的更优模型。在多种单核细胞系中，经诱导分化的 THP1 细胞（人急性单核细胞白血病细胞系）可形成非增殖性的单层细胞，是原代分离巨噬细胞的一种理想替代方案。

基于巨噬细胞-无鞭毛体的筛选可通过多种方式进行。经典的显微镜评估方法基于直接的细胞和寄生虫计数9 费时费力。缺乏自动化限制了该检测方法的应用。细胞计数耗时较长，且可能导致IC的测定结果不准确50 由于通过染色程序确定寄生虫活力较为困难，因此存在此类局限性。许多荧光染料和单克隆抗体可用于流式细胞术检测10, 11，但这些检测方法也存在局限性，表现为灵敏度较低，且药物处理的时间间隔仅限于一天。目前已有多种报告基因检测法可用于定量测定细胞内无鞭毛体的生长情况12,13,14使用报告基因可能实现自动化筛选，但这类检测方法也存在某些局限性。首先，大多数此类检测需要使用药物筛选以维持报告基因的附加体质粒表达，而这在药物筛选实验中可能并不理想。报告基因的导入方式也可能影响寄生虫的生理特性，进而影响筛选结果。若报告基因位于附加体质粒上，其表达水平可能取决于转染质粒的拷贝数（细胞间存在差异），而非药物活性本身。 14一些经过转化的报告寄生虫无需选择压力即可维持报告基因；然而，这些寄生虫的基因组结构可能因报告基因的插入而受到破坏，或仅仅由于外源性报告蛋白的存在而产生生物学影响。 15在某些基于报告基因的检测中，存在灵敏度和背景活性的问题 16最重要的是，许多报告基因表达检测方法，特别是使用GFP报告基因的检测方法15，可能无法区分活的和死的细胞内无鞭毛体。基于荧光素酶报告基因的检测方法或许能够区分活的和死的细胞内无鞭毛体，但这些检测所需的底物和细胞裂解缓冲液在大规模筛选中成本较高。17为克服以往基于巨噬细胞-无鞭毛体的筛选实验存在的缺点和局限性，我们开发并优化了这种寄生虫拯救与转化实验。该实验以THP1细胞作为宿主细胞，因其具有良好的均一性且本身为非分裂状态。

寄生虫拯救转化检测法在此描述的检测方法与基于数字图像分析直接计数细胞内无鞭毛体的检测方法相当。通过荧光和微分干涉差（DIC）显微镜结合ImageJ软件进行数字图像分析，可区分巨噬细胞核与寄生虫核，从而进一步优化了显微镜计数检测。在荧光滤光片和微分干涉差（DIC）滤光片下采集图像，提高了数字图像质量，使细胞内寄生虫的计数更为准确。荧光图像与DIC图像可合并生成数字图像，清晰显示巨噬细胞轮廓及荧光标记的细胞内细胞核。利用ImageJ可区分识别巨噬细胞核与寄生虫核。因此，数字图像分析直接计数法和寄生虫拯救转化检测法均具备自动化潜力，适用于大规模筛选。寄生虫拯救转化检测法的关键步骤包括：（a）利什曼原虫前鞭毛体感染THP1细胞后，反复洗涤细胞培养物，以确保几乎完全去除未被内化的前鞭毛体；（b）使用SDS对感染的THP1细胞进行可控裂解。这两个步骤均可通过自动化控制，且不应影响检测的通量。在利什曼原虫感染的THP1细胞与待测药物或化合物作用后，第二次洗涤步骤可进一步清除可能残留的未内化寄生虫。相较于现有的显微镜检测、报告基因检测及图像分析检测方法，寄生虫拯救转化检测法具有显著优势。该方法操作简便、稳健且可重复，可实现自动化大规模筛选，因此在针对新型抗利什曼原虫药物发现的大化合物库筛选中具有重要应用价值。此外，该检测法还可用于评估临床分离株及实验室分离株的利什曼原虫感染能力。 体外.

致谢

NCNPR-USDA-ARS 科学协议编号 58-6408-2-0009；美国陆军医学研究与物资司令部 CDMRP 赠款编号 W81XWH-09-2-0093。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯（PMA）Sigma-Aldrich USAP1585用于THP1细胞的分化。
RPMI-1640培养基Invitrogen23400021
Lab-TeK载片培养系统（16孔）Thermo Scientific Nunc178599
透明平底96孔板BD Falcon353075用于进行96孔板实验
两性霉素BSigma-Aldrich USAA4888标准抗利什曼药物，溶于DMSO（2 mg/ml）
喷他脒异烟酸盐Sigma-Aldrich USAP 0547标准抗利什曼药物，溶于DMSO（2 mg/ml）
米替福斯EMD Biosciences USA475841标准抗利什曼药物，溶于无血清RPMI-1640培养基（现配）（2 mg/ml）
葡萄糖酸锑钠EMD Biosciences USA567565标准抗利什曼药物，用含4% FBS的RPMI-1640配制（1 mg/ml）
十二烷基硫酸钠Sigma-Aldrich USAL 5750
荧光显微镜NIKONECLIPSE 90i
荧光酶标仪BMGPolar Star Galaxy
封片剂Sigma-Aldrich USAM 1289
alamarBlueAbD SerotecBUF012 B
SYBR Green ISigma-Aldrich USAS 9430
碳酸氢钠Fisher Sci.523500
丙酮酸钠Sigma-Aldrich USAP2256
2-巯基–乙醇Sigma-Aldrich USAM6250
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11050H
吐温20Sigma-Aldrich USAP9416
吐温80Sigma-Aldrich USAP6474
Triton X-100Sigma-Aldrich USAT8787
NP-40Calbiochem492016

参考文献

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寄生虫拯救实验THP1 巨噬细胞胞内无鞭毛体可控裂解AlamarBlue 检测药物筛选无鞭毛体转化显微图像分析天然产物筛选
一种针对THP1人急性单核细胞白血病细胞系内Leishmania donovani无鞭毛体的抗利什曼原虫药物筛选的寄生虫拯救与转化实验
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