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方法文章

胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片中B7-H1（PD-L1）的免疫组织化学染色

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DOI：

10.3791/4059

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2013年1月3日

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1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

B7-H1（PD-L1）与其受体PD-1的结合在肿瘤微环境中提供了主要的肿瘤诱导性免疫抑制信号。本文介绍了一种免疫组织化学染色技术，用于表征B7-H1在胰腺导管腺癌中的表达水平与定位情况。

摘要

B7-H1/PD-L1 是 B7 家族免疫调节性细胞表面蛋白的成员之一，通过与其受体程序性死亡受体-1（PD-1）相互作用，在细胞介导的免疫应答的负向调控中发挥重要作用1,2。在多种人类癌症中已观察到肿瘤细胞高表达 B7-H1，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤以及肺、乳腺、结肠、卵巢和肾细胞的癌变，且已被证实可损害抗肿瘤 T 细胞免疫3-8。

近期研究发现，胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达可作为潜在的预后标志物9,10。此外，在胰腺癌小鼠模型中阻断B7-H1已被证实可引发抗肿瘤反应11。这些数据表明，B7-H1可能是重要的潜在治疗靶点。因此，抗B7-H1阻断抗体目前正在针对多种人类实体瘤的临床试验中进行测试，包括黑色素瘤以及肺、结肠、肾、胃和胰腺的癌症12。

为了最终能够识别出可从靶向B7-H1治疗中获益的患者，至关重要的是研究B7-H1的表达与定位同患者对B7-H1阻断抗体治疗反应之间的相关性。通过免疫组织化学方法检测人胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达，将有助于深入理解这种共抑制信号分子如何在肿瘤微环境中抑制抗肿瘤免疫应答。Chen及其同事开发的抗B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）已被证明可在多种人类肿瘤组织的冷冻切片中产生可靠的染色结果4,8，但此前在石蜡包埋切片上的染色一直存在挑战13-18。我们已成功建立了适用于胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片的B7-H1染色方案。本文所述的B7-H1染色方案可实现B7-H1稳定一致的膜性和胞质性染色，且背景染色较弱。

方案

B7-H1/PD-L1 是 B7 家族免疫调节性细胞表面蛋白的一员，通过与其受体程序性死亡受体-1（PD-1）相互作用，在细胞介导的免疫应答的负向调控中发挥重要作用1,2。在多种人类癌症中已观察到肿瘤细胞过度表达 B7-H1，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤以及肺、乳腺、结肠、卵巢和肾细胞的癌变，且已被证实可损害抗肿瘤 T 细胞免疫3-8。

近期研究发现，胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达可作为潜在的预后标志物9,10。此外，在胰腺癌小鼠模型中阻断B7-H1已被证实可引发抗肿瘤反应11。这些数据表明B7-H1作为潜在治疗靶点的重要性。因此，抗B7-H1阻断抗体目前正在针对多种人类实体瘤的临床试验中进行测试，包括黑色素瘤以及肺、结肠、肾、胃和胰腺的癌症12。

为了最终能够识别出可从靶向B7-H1治疗中获益的患者，至关重要的是研究B7-H1的表达与定位同患者对B7-H1阻断抗体治疗反应之间的相关性。通过免疫组织化学方法检测人胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达，将有助于深入理解这种共抑制信号分子如何在肿瘤微环境中抑制抗肿瘤免疫应答。Chen及其同事开发的抗B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）已被证明可在多种人类肿瘤组织的冷冻切片中产生可靠的染色结果4,8，但此前在石蜡包埋切片上的染色一直存在挑战13-18。我们已成功建立适用于胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片的B7-H1染色方案。本文所述的B7-H1染色方案可在背景染色极低的情况下，稳定地显示B7-H1的膜性和胞质性表达。

1. 脱蜡

  1. 将载玻片在 55 °C 下烘烤 20 分钟。
  2. 在通风橱中，将载玻片浸入二甲苯中 10 分钟。
  3. 将载玻片浸入新鲜二甲苯中 10 分钟。
  4. 将载玻片浸入 100% 乙醇中 5 分钟。
  5. 将载玻片浸入新鲜 100% 乙醇中 5 分钟。
  6. 将载玻片浸入 95% 乙醇中 5 分钟。
  7. 将载玻片浸入 80% 乙醇中 5 分钟。
  8. 将载玻片浸入去离子水中 5 分钟。

2. 抗原修复

  1. 将切片浸入Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0）中，置于压力锅内加热至125 °C，持续30秒，然后降至90 °C，持续10秒。
  2. 让切片冷却60分钟。
  3. 将切片浸入TBST中5分钟；重复两次。

3. 染色

  1. 用擦去载玻片上组织周围的溶液，用疏水笔在组织周围画一个圆圈。
  2. 将载玻片放入湿盒中，确保在整个染色过程中组织不会干燥。在载玻片的疏水圈内加入一滴过氧化物酶阻断剂（约200 μl 或更多，以完全覆盖组织区域），将载玻片在过氧化物酶阻断剂中孵育5分钟。
  3. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。
  4. 在每张载玻片上加一滴BLOCK ACE封闭缓冲液，孵育15分钟。
  5. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。
  6. 在每张载玻片上加一滴亲和素（Avidin）溶液，孵育15分钟。
  7. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。
  8. 在每张载玻片上加一滴生物素（Biotin）溶液，孵育15分钟。
  9. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟。
  10. 将载玻片与鼠抗人B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）或鼠IgG1 κ同型对照抗体以1:1,000稀释度（溶于200 μl TBST中）在4 °C孵育过夜，时间为22小时±1小时。TBST中最终抗体浓度为2.57 μg/ml。
  11. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。
  12. 将载玻片与生物素标记的辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG1二抗以1:500浓度（溶于200 μl 2%山羊血清溶液中）孵育30分钟。
  13. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。
  14. 在每张载玻片上加一滴链霉亲和素-生物素复合物（必须在使用前至少30分钟配制），孵育15分钟。
  15. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。
  16. 在每张载玻片上加一滴扩增试剂（用TBST按2:1稀释），孵育4分钟。
  17. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。
  18. 在每张载玻片上加一滴链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP），孵育15分钟。
  19. 用TBST冲洗载玻片，然后将其置于TBST中5分钟，重复两次。
  20. 在每张载玻片上加一滴3,3-二氨基联苯胺（DAB）底物和显色剂，显色2分钟。
  21. 显色完成后立即用ddH2O冲洗载玻片1-2分钟。
  22. 在每张载玻片上加一滴苏木精染液，孵育90秒。
  23. 用ddH2O冲洗1-2分钟。
  24. 用含洗涤剂的自来水冲洗1-2分钟。
  25. 用ddH2O冲洗1-2分钟。

4. 脱水与封片

  1. 将载玻片浸入80%乙醇中3分钟。
  2. 将载玻片浸入95%乙醇中3分钟。
  3. 将载玻片浸入100%乙醇中5分钟，重复一次。
  4. 将载玻片浸入二甲苯中5分钟，重复一次。
  5. 在载玻片上滴加一滴Cytoseal 60，盖上盖玻片。

表1列出了上述实验步骤中所使用的试剂。

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结果

成功的B7-H1免疫组化染色将显示胰腺导管腺癌中B7-H1的异质性表达（棕黄色信号为DAB显色）。部分胰腺导管腺癌细胞主要表现为B7-H1的膜表达（图1A），而其他细胞则主要表现为B7-H1的胞质表达或B7-H1表达甚少（图2和图3）。正常的胰腺导管上皮几乎不表达B7-H1（图4）。以小鼠IgG1 κ同型对照抗体替代抗B7-H1抗体进行染色，结果显示背景染色极少（图1B）。

组织病理学比较、免疫组织化学染色结果、组织分析。
图1. A. 使用抗B7-H1（克隆5H1抗体）进行免疫组织化学染色，显示部分胰腺导管腺癌细胞膜呈阳性表达。B. 使用同型对照IgG1进行免疫组织化...

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讨论

既往研究已报道在多种癌症的冷冻切片上进行B7-H1的免疫组织化学染色3,4。然而，临床肿瘤样本通常仅以石蜡包埋组织块的形式保存。近年来，5H1单克隆抗体已成功应用于包括肾细胞癌、宫颈癌、膀胱癌和黑色素瘤在内的石蜡包埋肿瘤组织的染色13-18。也有研究报道使用其他单克隆抗体对胰腺导管腺癌组织的石蜡切片9,19或冰冻切片20进行B7-H1染色。本文中，我们展示了使用抗B7-H1的5H1单克隆抗体对石蜡包埋的胰腺导管腺癌组织进行成功染色的结果。B7-H1在胰腺导管腺癌中的表达具有异质性，这与多种其他恶性肿瘤（如黑色素瘤）中的表达模式相似4,21。在腺癌细胞中可同时观察到B7-H1的膜表达和胞质表达（图1和图2）。B7-H1的膜表达与其生物学功能一致。而B7-H1在肿瘤组织中的胞质表达作用仍有待进一步研究。正常的胰腺导管上皮细胞或腺泡细胞不表达B7-H1（图4）。

本实验方案中的所有步骤均在室温下进行，仅过夜孵育在...

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致谢

E.B.、K.M.B. 和 H.X. 贡献相同。本研究由美国国家癌症研究所胃肠道癌症SPORE项目（P50 CA062924）、NIH K23 CA148964、Lustgarten基金会、Viragh基金会、ASCO青年研究者奖、NIH 5T32 CA0090701-28培训基金、Sol Goldman胰腺癌中心以及国家胰腺基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CSA 系统DakoK1500包含本方案中提及的以下试剂：过氧化物酶阻断剂、链霉亲和素-生物素复合物、扩增试剂、链霉亲和素-HRP 以及 DAB 底物和发色剂
亲和素/生物素阻断试剂盒VectorSP-2001
Block ACESerotecBUF029
生物素标记抗小鼠 IgG1 抗体BD553441
小鼠 IgG1 K 同型对照eBioscience14-4714-85
TBS（Tris 缓冲盐水），10XCellgro46-012-CM10xTBS 含有 80 g/L NaCl 和 24.2 g/L Tris；
使用 ddH₂O 稀释至 1X 用于洗涤；
Tween 20Sigma-AldrichP1379将 1 ml 加入 1 L 的 1X TBS 中以配制 TBST
靶点修复液，20xCelerus Wave014-3000-000使用 ddH2O 稀释至 1x
190 证明乙醇Pharmco-Aaper111000190
200 证明乙醇Pharmo-Aaper111000200
二甲苯VWR95057-827
苏木精Richard-Allan Scientific72804
Cytoseal 60Richard-Allan Scientific8310-4
盖玻片Corning2940-245
湿盒SigmaH6644
表 1. 试剂与设备。

参考文献

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