B7-H1（PD-L1）与其受体PD-1的结合在肿瘤微环境中提供了主要的肿瘤诱导性免疫抑制信号。本文介绍了一种免疫组织化学染色技术，用于表征B7-H1在胰腺导管腺癌中的表达水平与定位情况。
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摘要
摘要
B7-H1/PD-L1 是 B7 家族免疫调节性细胞表面蛋白的成员之一，通过与其受体程序性死亡受体-1（PD-1）相互作用，在细胞介导的免疫应答的负向调控中发挥重要作用1,2。在多种人类癌症中已观察到肿瘤细胞高表达 B7-H1，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤以及肺、乳腺、结肠、卵巢和肾细胞的癌变，且已被证实可损害抗肿瘤 T 细胞免疫3-8。
近期研究发现，胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达可作为潜在的预后标志物9,10。此外，在胰腺癌小鼠模型中阻断B7-H1已被证实可引发抗肿瘤反应11。这些数据表明，B7-H1可能是重要的潜在治疗靶点。因此，抗B7-H1阻断抗体目前正在针对多种人类实体瘤的临床试验中进行测试，包括黑色素瘤以及肺、结肠、肾、胃和胰腺的癌症12。
为了最终能够识别出可从靶向B7-H1治疗中获益的患者，至关重要的是研究B7-H1的表达与定位同患者对B7-H1阻断抗体治疗反应之间的相关性。通过免疫组织化学方法检测人胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达，将有助于深入理解这种共抑制信号分子如何在肿瘤微环境中抑制抗肿瘤免疫应答。Chen及其同事开发的抗B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）已被证明可在多种人类肿瘤组织的冷冻切片中产生可靠的染色结果4,8，但此前在石蜡包埋切片上的染色一直存在挑战13-18。我们已成功建立了适用于胰腺导管腺癌组织石蜡包埋切片的B7-H1染色方案。本文所述的B7-H1染色方案可实现B7-H1稳定一致的膜性和胞质性染色，且背景染色较弱。
方案
B7-H1/PD-L1 是 B7 家族免疫调节性细胞表面蛋白的一员，通过与其受体程序性死亡受体-1（PD-1）相互作用，在细胞介导的免疫应答的负向调控中发挥重要作用1,2。在多种人类癌症中已观察到肿瘤细胞过度表达 B7-H1，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤以及肺、乳腺、结肠、卵巢和肾细胞的癌变，且已被证实可损害抗肿瘤 T 细胞免疫3-8。
近期研究发现，胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达可作为潜在的预后标志物9,10。此外，在胰腺癌小鼠模型中阻断B7-H1已被证实可引发抗肿瘤反应11。这些数据表明B7-H1作为潜在治疗靶点的重要性。因此，抗B7-H1阻断抗体目前正在针对多种人类实体瘤的临床试验中进行测试，包括黑色素瘤以及肺、结肠、肾、胃和胰腺的癌症12。
为了最终能够识别出可从靶向B7-H1治疗中获益的患者，至关重要的是研究B7-H1的表达与定位同患者对B7-H1阻断抗体治疗反应之间的相关性。通过免疫组织化学方法检测人胰腺导管腺癌组织中B7-H1的表达，将有助于深入理解这种共抑制信号分子如何在肿瘤微环境中抑制抗肿瘤免疫应答。Chen及其同事开发的抗B7-H1单克隆抗体（克隆号5H1）已被证明可在多种人类肿瘤组织的冷冻切片中产生可靠的染色结果4,8，但此前在石蜡包埋切片上的染色一直存在挑战
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结果
成功的B7-H1免疫组化染色将显示胰腺导管腺癌中B7-H1的异质性表达（棕黄色信号为DAB显色）。部分胰腺导管腺癌细胞主要表现为B7-H1的膜表达（图1A），而其他细胞则主要表现为B7-H1的胞质表达或B7-H1表达甚少（图2和图3）。正常的胰腺导管上皮几乎不表达B7-H1（图4）。以小鼠IgG1 κ同型对照抗体替代抗B7-H1抗体进行染色，结果显示背景染色极少（图1B）。
图1. A. 使用抗B7-H1（克隆5H1抗体）进行免疫组织化学染色，显示部分胰腺导管腺癌细胞膜呈阳性表达。B. 使用同型对照IgG1进行免疫组织化.......
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讨论
既往研究已报道在多种癌症的冷冻切片上进行B7-H1的免疫组织化学染色3,4。然而，临床肿瘤样本通常仅以石蜡包埋组织块的形式保存。近年来，5H1单克隆抗体已成功应用于包括肾细胞癌、宫颈癌、膀胱癌和黑色素瘤在内的石蜡包埋肿瘤组织的染色13-18。也有研究报道使用其他单克隆抗体对胰腺导管腺癌组织的石蜡切片9,19或冰冻切片20进行B7-H1染色。本文中，我们展示了使用抗B7-H1的5H1单克隆抗体对石蜡包埋的胰腺导管腺癌组织进行成功染色的结果。B7-H1在胰腺导管腺癌中的表达具有异质性，这与多种其他恶性肿瘤（如黑色素瘤）中的表达模式相似4,21。在腺癌细胞中可同时观察到B7-H1的膜表达和胞质表达（图1和图2）。B7-H1的膜表达与其生物学功能一致。而B7-H1在肿瘤组织中的胞质表达作用仍有待进一步研究。正常的胰腺导管上皮细胞或腺泡细胞不表达B7-H1（图4）。
本实验方案中的所有步骤均在室温下进行，仅过夜孵育在.......
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致谢
E.B.、K.M.B. 和 H.X. 贡献相同。本研究由美国国家癌症研究所胃肠道癌症SPORE项目（P50 CA062924）、NIH K23 CA148964、Lustgarten基金会、Viragh基金会、ASCO青年研究者奖、NIH 5T32 CA0090701-28培训基金、Sol Goldman胰腺癌中心以及国家胰腺基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CSA 系统 | Dako | K1500 | 包含本方案中提及的以下试剂：过氧化物酶阻断剂、链霉亲和素-生物素复合物、扩增试剂、链霉亲和素-HRP 以及 DAB 底物和发色剂 |
| 亲和素/生物素阻断试剂盒 | Vector | SP-2001 | |
| Block ACE | Serotec | BUF029 | |
| 生物素标记抗小鼠 IgG1 抗体 | BD | 553441 | |
| 小鼠 IgG1 K 同型对照 | eBioscience | 14-4714-85 | |
| TBS（Tris 缓冲盐水），10X | Cellgro | 46-012-CM | 10xTBS 含有 80 g/L NaCl 和 24.2 g/L Tris； 使用 ddH₂O 稀释至 1X 用于洗涤； |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 将 1 ml 加入 1 L 的 1X TBS 中以配制 TBST |
| 靶点修复液，20x | Celerus Wave | 014-3000-000 | 使用 ddH2O 稀释至 1x |
| 190 证明乙醇 | Pharmco-Aaper | 111000190 | |
| 200 证明乙醇 | Pharmo-Aaper | 111000200 | |
| 二甲苯 | VWR | 95057-827 | |
| 苏木精 | Richard-Allan Scientific | 72804 | |
| Cytoseal 60 | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| 盖玻片 | Corning | 2940-245 | |
| 湿盒 | Sigma | H6644 | |
| 表 1. 试剂与设备。 |
参考文献
- Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
- Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion.<....
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