用于构建携带多个基因敲除的酵母菌株的Green Monster流程

摘要

Green Monster 方法能够快速组装多个缺失片段，并利用编码绿色荧光蛋白的报告基因进行标记。该方法基于使酵母菌株经历多次有性重组循环，并通过基于荧光的富集方式筛选携带更多缺失的细胞。

摘要

基因缺失的表型通常只有在特定的遗传背景或环境条件下进行检测时才会显现^1,2存在一些实例，需要删除多个基因才能揭示隐藏的基因功能^3,4尽管存在重要发现的潜力，涉及三个或更多基因的遗传相互作用在很大程度上仍未被探索。由于基因缺失组合的数量极为庞大，对多突变体相互作用进行穷尽式搜索将不切实际。然而，针对特定基因集合的研究，例如具有更高冗余性的旁系同源基因集合， 先验的 具有共享共同功能的可能性，将具有参考价值。

在酵母Saccharomyces cerevisiae中，基因敲除是通过同源重组将基因替换为可筛选标记来实现的。由于可筛选标记的数量有限，已开发出用于移除并重复使用同一标记的方法^5,6,7,8,9,10。然而，使用这些方法依次构建多个突变耗时较长，因为所需时间与待构建的缺失突变数量呈线性关系。

本文介绍了用于在酵母中常规构建多个基因缺失的Green Monster方法¹¹。该方法将绿色荧光蛋白（GFP）报告基因整合至缺失位点，从而根据每个菌株所含缺失的数量对菌株进行定量标记（图1）。通过反复进行酵母交配与减数分裂，对携带GFP标记缺失的菌株进行分离，并结合流式细胞术富集含有更多缺失的菌株，从而实现缺失在菌株中的逐步累积（图2）。通过并行开展多个流程，每个流程每轮引入一个或多个缺失，可显著缩短菌株构建所需的时间。

第一步是制备称为“ProMonsters”的单倍体单突变株，每个菌株在其缺失位点携带一个GFP报告基因，并在can1Δ位点携带“工具包”位点之一——即Green Monster GMToolkit-a或GMToolkit-α（图3）。利用酵母基因敲除文库中的菌株¹²，可通过将这些菌株中已有的通用KanMX4盒替换为通用的GFP-URA3片段，便捷地构建带有GFP标记的缺失菌株。每种GMToolkit包含：特异于a或α交配型的单倍体筛选标记¹，以及两个筛选标记中的一个；当两种GMToolkit同时存在时，这两个标记共同作用，可用于筛选二倍体。

第二步是进行有性循环，通过每次交配和产孢循环中伴随的随机分配和/或减数分裂重组，将缺失位点组合到单个细胞内。

方案

1. ProMonsters 的构建

1. 通过使用引物扩增质粒 pYOGM012（氨苄青霉素抗性）中的 tetO₂-GFP 标记和 URA3 标记，制备通用的 GFP 替换盒，引物序列为：
   GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCCCAAGCTCCTCGAGTAATTCG 和 GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCACGTACCGGGTAATAACTGATATAAT（加粗区域提供与 KanMX4 盒侧翼区域的同源性，以实现靶向替换）。PCR 反应应使用 Phusion 聚合酶、HF 缓冲液和 3% 二甲基亚砜（New England BioLabs）进行，模板 DNA 浓度起始为 0.5 ng/μl。PCR 程序为 98 °C 预变性 30 秒，随后进行 35 个循环：98 °C 变性 10 秒，49 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1.5 分钟。反应体积应 > 50 μl，以确保每次转化实验有足够的 DNA。我们使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒（Qiagen）纯化产物，每根柱子处理约 50 μl PCR 反应液，但跳过纯化步骤可能提高转化子的产量。
   或者，可通过使用限制性内切酶 EcoRI（New England BioLabs）....

结果

当携带四个GFP标记缺失（ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ）的a型单倍体菌株与携带四个缺失（ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ）的α型单倍体菌株杂交时，两个菌株共享两个缺失（ycl033cΔ yer042wΔ），获得了一个代表性结果。将杂交混合物在含有G418和Nat的YPDA培养基中培养，以筛选双倍体。将获得的双倍体在孢子形成培养基中培养。通过溶壁酶处理和超声处理分散孢子，并在单倍体筛选培养基中使其萌发。随后诱导细胞表达GFP。利用流式细胞仪设置门控，选择出不太可能含有碎片或细胞聚集体的细胞群体（图5）。在此群体中，筛选出荧光最强的1%细胞。筛选后的细胞与未筛选细胞在形成菌落后进行基因分型。当随机挑选的菌落划线接种于含G418和Nat的YPDA平板时，未筛选样本中16个菌落中有2个菌落的细胞能够生长，而筛选样本中26个菌落中有18个菌落的细胞能够生长，表明部分双倍体在此实验的单倍体筛选和GFP诱导阶段获得了表达单倍体筛选标记的能力并得以增殖。.......

讨论

在开发Green Monster方法的过程中，我们关注到不同GFP替换盒之间可能发生重组，从而导致基因组重排。为了降低这种可能性，我们选择了成功经历多轮交配和减数分裂的细胞。携带重排基因组的细胞在与没有相同重排的细胞交配后，预期其适应性会降低。事实上，我们并未观察到由GFP盒之间重组引起的任何基因组不稳定性¹¹。然而，我们不能完全排除这种可能性，因此建议用户对所获得的菌株进行重排检测。可采用脉冲场凝胶电泳来检测明显的异常，也可使用引物结合于缺失区域内序列的PCR方法来确认野生型序列的缺失。

根据已建立菌株的荧光水平，GFP 强度与缺失数目之间呈近乎线性的关系，表明在测试的一至十六个缺失范围内，饱和并非问题¹¹。然而，即使在后续几轮实验中，针对具有大量非重叠缺失的菌株，每一轮中群体的平均缺失数目仅能增加约两个，而理论上，若能实现完美的GFP筛选严格性，则可一次性组合两个亲本菌株中所有缺失的并集。一个限制因素是同基因型细胞间GFP强度的细胞间差异。在代表性结果的第二个示例中，预计群体中仅有0.8%的细胞会包含此次杂交可能产生的全部11个缺失（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
G418	Sigma-Aldrich	A1720	溶于水并过滤除菌（使用0.2-μm滤器）。储备液浓度：200 mg/ml。4 °C保存。
ClonNAT（nourseothricin）	WERNER BioAgents	5001000	溶于水并过滤除菌（使用0.2-μm滤器）。储备液浓度：100 mg/ml。4 °C保存。
强力霉素（Doxycycline）	Sigma-Aldrich	D9891	溶于50%乙醇并过滤除菌（使用0.2-μm滤器）。储备液浓度：10 mg/ml。每四周新鲜配制一次。用铝箔避光，4 °C保存。
Zymolyase	ZymoResearch	E1005
Difco 酵母氮源基础培养基（不含氨基酸）	BD	291940
Revolver（试管旋转仪）	Labnet	H5600
Enduro Gel XL 电泳装置	Labnet	E0160
Sonifier 450	Branson	101-063-198
Sonifier 450 微型探头	Branson	101-148-062
FACSAria 细胞分选仪	BD
MoFlo 细胞分选仪	Beckman-Coulter
Biomek FX 或同类自动化工作站	Beckman Coulter		可选，用于构建基因分型PCR反应体系。